DISCIPLINA: MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE TÓPICO 4: Espectrofotometria de Absorção Molecular UV/Visível A espectrofotometria é uma técnica de análise baseadas na interação entre a radiação eletromagnética e a matéria. Conceitualmente, a radiação eletromagnética pode ser definida como um fenômeno ondulatório que não necessita de nenhum veículo de transmissão sendo bastante lembrada pela sua capacidade de propagação no vácuo. A propagação da radiação eletromagnética resulta de uma oscilação dos campos elétricos e magnéticos e pode ser considerado, fisicamente, como um fluxo de partículas de energia (fótons). A energia irradiada (fótons) provém de cargas elétricas que, ao manterem movimentos vibratórios, causam as oscilações eletromagnéticas. Figura: Propagação da radiação eletromagnética. Fonte: http://www.infoescola.com/fisica/radiacao-eletromagnetica/.
Estas vibrações se propagam ao longo de uma direção radial a partir de onde esta oscilação iniciou. O campo elétrico oscila perpendicularmente ao campo magnético. A propagação da radiação eletromagnética ocorre em movimento ondulatório e terá como parâmetros físicos o seu comprimento de onda ( ) e a sua freqüência (f). Espectro Eletromagnético: Trata-se da ampla faixa de comprimentos de onda ou freqüência que uma radiação eletromagnética pode assumir: Figura: Espectro Eletromagnético. Fonte: http://quimicaambiental.com/aquecimentoglobal/efeito-estufa/espectro-eletromagnetico. Como observado, as radiações eletromagnéticas podem ser classificadas como ondas de rádio, microondas, luz infravermelho, luz visível, luz ultravioleta, raios X e raios Gama. As técnicas espectrofotométricas trabalham com a faixa do ultravioleta (1 nm a 380 nm, sendo a faixa utilizada para análise entre 200 e 380 nm) ao visível (400 a 700 nm). Interação da Radiação com a Matéria: A radiação interage com a matéria sem, no entanto, ocorrer transferência permanente de energia. O fenômeno ocorrido pode ser descrito como uma polarização temporária das espécies atômicas e moleculares presentes na matéria. Esta polarização provoca uma deformação temporária das nuvens eletrônicas causado pelo campo elétrico da radiação.
No momento em que a radiação é retida pela matéria (intervalo de 10-14 segundos) ocorre uma excitação atômica ou molecular para ser, em seguida, reemitido para o meio. Espalhamento e Polarização da Radiação: As radiações eletromagnéticas possuem como característicos alguns fenômenos: 1. Difração da Luz: Desvio de um feixe de radiação ao passar por uma fenda (barreira estreita). A interação entre as partículas (na região da fenda) e a radiação produz franjas (bandas) claras e escuras. 2. Espalhamento da Luz: Radiação transmitida é retida (momentaneamente) pelos átomos, íons ou moléculas e, em seguida, reemitido em todas as direções. Átomos e moléculas apresentam baixo espalhamento (chamado espalhamento Rayleigh). Já as macromoléculas apresentam grande Espalhamento (Mie).
3. Refração da Luz: Mudança abrupta de direção do feixe de radiação na interface entre 2 meios. Fonte:http://www.passeiweb.com/na_ponta_lingua/sala_de_aula/fisica/optica/optica /otica_refracao_da_luz 4. Reflexão da Luz: Parte da radiação é refletida ao cruzar a interface entre 2 meios. Fonte: http://www.sofisica.com.br/conteudos/otica/reflexaodaluz/reflexao.php A radiação ao atravessar um meio que absorva, emita, refrate ou reflita, seletivamente, a radiação se torna polarizada e direcionada a um único plano.
Absorção Molecular: A absorção de energia proveniente de uma radiação gera espectros mais complexos e com maior número de estados energéticos em relação ao átomo isolado. A absorção molecular de energia é avaliada a partir de bandas, ou seja, faixas de comprimentos de onda onde ocorre a maior absorção de radiação. A energia de uma banda será: E total = E eletrônica + E vibracional + E rotacional Cada molécula ou conjunto de moléculas (substância) é capaz de absorver radiação (energia) em diferentes comprimentos de onda. Entretanto, cada molécula terá um comprimento de onda (banda) de radiação onde esta absorção será máxima. Será esta banda ou faixa de comprimento de onda a ser definida no equipamento para que se alcancem os resultados mais precisos em uma análise. Para eliminar a interferência da absorção de energia por outras moléculas em uma amostra é necessário analisar um branco, contendo todos os componentes exceto aquele que se deseja analisar. Figura: Varredura do espectro UV/Visível de radiação para o beta-caroteno (vermelho) e licopeno (azul). Fonte: http://www.cromatografialiquida.com.br/carotespec.htm O gráfico acima mostra a relação entre a absorção de energia (indicada pelo parâmetro de absorbância) e o comprimento de onda da radiação. Cada molécula apresentará um espectro
de Absorção característico e uma banda de absorção máxima a ser utilizada para sua análise pelo equipamento. As setas indicam as possíveis bandas de absorção máxima para o betacaroteno e para o licopeno. A absorção máxima do licopeno em acetona ocorre em 474nm, enquanto a do beta-caroteno ocorre em 454nm. Portanto, caso se deseje analisar apenas o licopeno, o comprimento de onda ideal seria de 474 nm enquanto para análise do betacaroteno, o mesmo deveria ocorrer empregando radiação com comprimento de onda de 454 nm. Fundamentos da Espectrofotometria: Baseia-se na interação da energia radiante com a matéria, através de excitações energéticas nas moléculas. Entre as vantagens da técnica tem-se: Baixo custo de operação e análise. Robustez do equipamento. Boa sensibilidade Baixo Custo de manutenção (durabilidade média das lâmpadas) Figura: Espectrofotômetro UV/Vis Thermo. Fonte: Thermo
Figura: Espectrofotômetro UV/Vis Shimadzu. Fonte: http://www.shimadzu.com.br/analitica/produtos/espectrofotometros/uv-vis/uv- 2450_2550.aspx. O espectro de absorção de radiação por uma substância é o principal parâmetro a ser verificado para uma boa condição de análise. Toda molécula é capaz de absorver energia a partir da radiação emitida pelo aparelho. Entretanto, a quantidade de energia absorvida irá variar de acordo com a energia emitida (para cada comprimento de onda, existe uma quantidade específica de energia absorvida pela molécula). A análise espectrofotométrica é baseada na teoria de Beer-Lambert:
Lei de Lambert: A quantidade de energia transmitida depende do caminho óptico seguido pela radiação. O caminho óptico, por sua vez, será influenciado pelas dimensões e material da cubeta (vidraria utilizada para acondicionar a amostra a ser analisada pelo aparelho). Lambert elaborou uma equação que expressasse a relação entre o caminho óptico e a quantidade de energia transmitida após o contato com o analito. Assim: I T3 menor que I T1 Onde: I T = energia radiante transmitida (saída do analito) I 0 = energia radiante inicial (entrada do analito) K = constante de Lambert l = largura da cubeta ou caminho óptico. Lei de Beer: A quantidade de energia transmitida depende da quantidade de moléculas presentes, ou seja, da concentração da substância analisada.
A concentração de analito influenciará na intensidade de radiação transmitida uma vez que o aumento no número de moléculas modifica a absorção de energia pelo meio. Assim, para o exemplo acima, I T2 será menor que I T1 pois o aumento da concentração provoca aumento na quantidade de energia absorvida no analito. Onde: I T = energia radiante transmitida (saída do analito) I 0 = energia radiante inicial (entrada do analito) K = constante de Beer c= concentração no analito. A união das duas leis que regem a espectrofotometria deu origem ao conceito empregado hoje para qualquer análise espectrofotométrica UV/Vis: A espectroscopia de absorção molecular (espectrofotometria) está baseada na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que estão relacionadas através das equações:
A absorbância corrige desvios gerados pela determinação da transmitância sendo hoje o principal parâmetro de quantificação espectrofotométrica. A união das Leis de Lambert e Beer gerou a equação de absorbância: A =.b.c Onde: A : Absorbância e: Coeficiente de Extinção Molar b: largura da cubeta c: concentração da substância Caso a análise espectrofotométrica seja efetuada no mesmo equipamento e com a mesma cubeta, os fatores e e b serão constantes e absorbância só irá variar com a concentração da substância (de maneira linear). A maior importância da medida de absorbância está em sua proporcionalidade com a concentração de analito. Tal proporcionalidade é mantida para valores de absorbância abaixo de 1,000. Figura: Gráfico de Proporcionalidade entre Absorbância (A) e Concentração (C)
Estabelecer a proporcionalidade entre a absorbância e a concentração para sua análise é possível através da construção da chamada Curva de Calibração do método. A Lei de Beer-Lambert apresenta, porém, algumas limitações reais que devem ser levadas em conta: A Lei é válida somente para baixas concentrações. Em Altas concentrações a interação entre as moléculas afeta a distribuição de radiação, alterando o coeficiente de absortividade molar (e). (Manter Absorbância inferior a 1,000) Pode-se diluir a amostra para manter a absorbância dentro da Lei de Beer e, assim, garantir a precisão na análise. DESVIO INSTRUMENTAL: A lei só é válida para radiação monocromática, ou seja, para um único comprimento de onda ( ). Como minimizar o desvio? Escolher a região onde o é constante na região selecionada (pico de absorção)
O espectrofotômetro é constituído pelas seguintes partes: Fontes de radiação (responsável pela emissão do feixe de luz UV-Visível) Monocromador (responsável pela seleção do comprimento de onda adequado para ser levado em contato com a amostra) Compartimento de amostra (única parte com contato externo e onde a cubeta contendo o analito será acondicionada) Detector (responsável pela detecção da radiação transmitida a partir da cubeta contendo o analito e também pela conversão desta energia em um sinal elétrico a ser convertido no aparelho em um valor de absorbância). Os Monocromadores são instrumentos ópticos de construção muito robusta, destinado a selecionar faixas do espectro de emissão de luz, ou seja, seleciona apenas um comprimento de onda. O monocromador será tanto melhor quanto menor for a banda de passagem (a largura de banda típica para uma abertura de fenda de 1mm na região de 500nm é de 12nm). O comprimento de onda da luz transmitida através do monocromador pode ser continuadamente variado e o espectro resultante analisado. Uma fonte de luz branca (UV + VIS + IRP + IR) e um monocromador formam uma fonte de luz cujo comprimento de onda é ajustável para estudos de excitação ou absorção.
As fontes de radiação utilizadas no aparelho são lâmpadas de tungstênio (empregada para análises no espectro visível) e de deutério (empregadas para análises no espectro ultravioleta). Fonte: Princípios de Análise Instrumental. (Holler, Skoog, Crough) Como visto no gráfico, a maior intensidade da lâmpada de deutério é obtida na faixa entre 200-300 nm, correspondente ao espectro ultravioleta. Entretanto, para a lâmpada de tungstênio, a maior intensidade ocorre entre 500 e 900nm, correspondente ao espectro visível. O erro na escolha da lâmpada a ser utilizada acarreta em medidas incorretas e deve se ter grande atenção do analista. As cubetas de medida podem ser de quartzo, empregada tanto para análises em UV quanto visível, pois, apresenta baixa absorção de radiação na faixa entre 150 e 3000 nm. Entretanto, cubetas de vidro ou plástico só devem ser empregadas para análises no espectro visível, pois, apresentam baixa absorção de radiação apenas na faixa entre 380-800 nm (plástico) e 375 2000 nm (vidro).
As análises quantitativas buscam determinara concentração de uma ou mais substâncias presentes em uma amostra. O uso da espectrofotometria na obtenção de uma concentração é possível graças a aplicação da Lei de Beer que, por sua vez, garante proporcionalidade entre absorbância (A) e concentração (C). Existem três métodos principais para análise quantitativa em espectrofotômetro: - Técnica da Adição de Padrão: adição de concentração conhecida do padrão da substância que se deseja analisar e comparação com a amostra. - Técnica da análise direta de mistura de substâncias: determinam-se as absortividades e absorbâncias das moléculas presentes na mistura amostral e, por cálculo, obtém-se cada concentração. - Técnica do fator de correção: muito empregado em métodos bioquímicos e imunoclínicos. Multiplica-se a absorbância da amostra por um fator de correção determinado pela medida da absorbância do padrão. - Curva de Calibração: muitos protocolos trabalham com a elaboração de uma equação de curva que relacione Absorbância e concentração. Estabelecimento de uma Curva de Calibração: É efetuada a medida da absorbância de várias concentrações de padrão. Em seguira se estabelece uma reta relacionando os valores de absorbância e concentração. Ao se estabelecer a equação desta reta é possível converter os resultados de absorbância (A) do espectrofotômetro em concentração do analito.
Figura: Concentrações de Padrão de Albumina para estabelecimento de uma curva de calibração para dosagem de proteínas por espectrofotometria UV/Vis. TUBO [Proteína] (μg/ml) Absorbância 1/1' 10 0,040 2/2' 20 0,087 3/3' 30 0,133 4/4' 40 0,188 5/5' 50 0,242 6/6' 60 0,319 7/7' 70 0,379 8/8' 80 0,428 9/9' 90 0,493 10/10' 100 0,547
DAbs UNIVERSIDADE PAULISTA Concentração de Proteínas 0,600 0,500 y = 0,0058x - 0,0317 R² = 0,9975 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 20 40 60 80 100 120 [Proteína] ( g/ml) Figura: Curva de Calibração A equação da reta corresponde a A = 0,0058. C -0,0317. O coeficiente de determinação (r 2 ) deverá sempre estar próximo a 1,000 sendo um indicativo da forte linearidade (proporcionalidade) obtida entre os valores de absorbância e concentração. À partir de um resultado de análise é possível converter o mesmo em um valor de concentração de analito empregando a equação da curva. Exemplo: para uma absorbância de 0,520, qual a concentração de proteínas totais? 0,520 = 0,0058.C 0,0317 (0,520 + 0,0317) = 0,0058. C 0,5517 = 0,0058. C (0,5517/0,0058) = C 95,12 = C Ou seja, a análise indicou concentração de proteínas totais igual a 95,12 g/ml.