Resumo - capítulo 6. Pedro Ivo Gomes de Faria

Resumo - capítulo 6 Pedro Ivo Gomes de Faria Sumário 1 Capítulo 6 - Mecanismos Genéticos Básicos 2 1.1 RNA e síntese de proteínas.................... 2 1.2 Reparo do DNA.......................... 5 1.3 Replicação do DNA........................ 6 1.4 Recombinação genética...................... 9 1.5 Vírus, plasmídeos e elementos genéticos de transposição.... 11 1

1 Capítulo 6 - Mecanismos Genéticos Básicos 1.1 RNA e síntese de proteínas O RNA (tanto o RNAm quanto outros RNAs que possuem função estrutural ou catalítica) é sintetizado (pela enzima RNA polimerase) a partir de uma modelo de DNA em um processo chamado transcrição de DNA. A RNA polimerase liga-se fortemente ao DNA numa região específica (chamada de promotora), que contém o sítio de começo para a síntese de RNA. A partir daí a polimerase move-se no sentido de alcançar a ponta 3, usando a cadeia de DNA que vai sendo exposta para o pareamento de bases (enquanto religa a parte da cadeia já usada). O processo acaba em um sinal de parada, quando o DNA molde e o RNA formado são soltos pela polimerase. Seqüências de nucleotídeos em comum (com variações mínimas e funções parecidas) entre diferentes loci gênicos são ditas sequências de consenso. Em bactérias, promotores fortes (associados a genes de expressão elevada) possuem seqüências que casam bem com as sequências de consenso. Apesar de (em princípio) qualquer das duas cadeias de DNA puder ser usada como molde, apenas uma delas é usada em cada região. Isso acontece porque as regiões promotoras (que orientam o sentido da transcrição) estão orientados de formas diferentes num mesmo cromossomo. Outros fatores envolvidos na produção de uma molécula de RNAm madura são as proteínas regulatórias de gene (ajudam a determinar quais regiões do DNA serão transcritas) e a excisão (splicing) de sequências não codificantes (íntrons) em eucariontes. Todas as células possuem RNA transportadores (RNAt), que são moléculas em forma de L (com um aminoácido em uma ponta e uma região - anticódon - para ligar-se ao RNAm na outra) responsáveis pela conversão de nucleotídeos em aminoácidos (sendo que os aminoácidos que carrega são ativados para que possam reagir - formando uma ligação peptídica - com o aminoácido do terminal carboxila na seqüência proteica). Cada RNAt liga-se especificamente a um aminoácido, mas o inverso não é verdadeiro. O que determina em que ponto da proteína o aminoácido será adicionado é o próprio RNAt, e portanto é vital que o mecanismo que liga um determinado aminoácido à molécula de RNAt correspondente seja preciso. Esse mecanismo depende das enzimas aminoacil-trna sintetases, que ligam cada aminoácido a um de seus RNAts correspondentes (existe uma delas para cada aminoácido, totalizando 20 sintetases). Logo, o código genético é traduzido por dois adaptadores (RNAts e sintetases) que agem sequencialmente, fazendo os casamentos de duas superfícies moleculares com alta especificidade. O código genético (mapeamento entre códons e amioácidos) diz-se de- 2

generado pois um aminoácido pode ser codificado por mais de um códon (já que existem 64 códons diferentes - três dos quais indicam o final da cadeia polipeptídica - para 20 aminoácidos conhecidos). Logo existe mais de um RNAt para cada aminoácido ou um único RNAt pode parear-se com mais de um códon (ambos os casos ocorrem). O segundo caso ocorre pois algumas moléculas de RNAt toleram incompatibilidades na terceira posição do códon (o que explica porque vários códons de um mesmo aminoácido diferem apenas no terceiro nucleotídeo). As reações envolvidas na síntese protéica requerem um complexo maquinário catalítico para guiá-las. O movimento preciso (sempre no mesmo frame de leitura) e outros eventos são catalisados por ribossomos, compostos por uma subunidade pequena (liga-se ao RNAm e ao RNAt) e uma grande (catalisa a formação de ligações peptídicas). Mais da metade da massa do ribossomo é RNA, e acredita-se que o RNA ribossômico (RNAr) desempenhe um papel central em suas atividades catalíticas. Um ribossomo contém três sítios de ligação com RNAs: o que segura o RNAt ligado ao último aminoácido da cadeia polipetídica (sítio de ligação do peptidil-rnat ou sítio P), o que segura a molécula de RNAt que possui um aminoácido ainda não ligado à cadeia (sítio de ligação do aminoacil-rnat ou sítio A) e o que liga-se ao RNAm. A elongação de uma cadeia de aminoácidos no ribossomo pode ser visto como um ciclo de três passos: 1. um aminoacil-rnat ocupa um sítio A (adjacente a um sítio P já ocupado). 2. o terminal carboxila da cadeia é desacoplado do RNAt do sítio P e forma uma ligação peptídica com o aminoácido ligado ao RNAt no sítio A (reação catalisada pela enzima peptidil transferase). 3. o novo peptidil-rnat no sítio A é transferido para o sítio P, enquanto o ribossomo move-se exatamente três nucleotídeos no sentido de aproximarse da ponta 3 do RNAm. Quando um dos códons de parada (UAA, UAG ou UGA) é encontrado, proteínas ditas fatores de soltura ligam-se ao sítio A, alterando a atividade da peptidil transferase (fazendo catalisar a adição de uma molécula de água em vez de um aminoácido ao peptidil-rnat). Esta reação libera o terminal carboxila que mantinha a cadeia unida ao RNAt, liberando a proteína no citoplasma. Em princípio, qualquer um dos três frames de leitura do RNA poderia ser transcrito. A determinação do frame correto é dada pela seqüência do RNA, que determina como o ribossomo se monta. O processo de iniciação 3

(descoberta do primeiro início da parte codificante) envolve vários passos catalisados pelos fatores de iniciação (proteínas que se ligam à subunidade menor do ribossomo e controlam a taxa de síntese proteica). Sabe-se que apenas após a subunidade ribossômica menor (ligada a um RNAt iniciador, que sempre carrega uma metionina) encontrar o códon de início (AUG) é que a subunidade ribossômica maior liga-se ao RNAm. A metionina é frequentemente removida pouco depois de sua incorporação (isso é importante porque o aminoácido no terminal amino determina o tempo de vida da proteína através de uma via de deagradação dependente da ubiquitina - que marca proteínas que a serem digeridas por proteassomas). Em eucariontes, o RNAm é dito monocistrônico, pois (geralmente) um único tipo de cadeia peptídica é transcrita para cada RNAm. Isso ocorre porque existe apenas um sítio de ligação no ribossomo (perto do cap 5, que auxilia a ligação entre o RNAm e o ribosomo), a partir do qual o primeiro códon AUG indica o início da transcrição. Já em procariontes o RNAm é policistrônico, pois existem vários sítios de ligação do ribossomo (sequências de Shine-Dalgarno) em um único RNAm (o que implica na codificação de mais de uma proteína). Normalmente uma mesma molécula de RNAm é lida ao mesmo tempo por vários ribossomos, formando um polirribossomo. Isso aliado ao fato do RNAm poder ser dobrado de forma circular permite uma elevar rapidamente o número de transcritos. Existem dois mecanismos distintos de correção de erros na síntese de proteínas: um deles atua na ligação de um aminoácido ao RNA t correspondente e o outro atua no pareamento entre códons do RNAm e anticódons do RNAt. O primeiro mecanismo depende dos sítios ativos da aminoacil-rnat sintetase: um que liga o aminoácido ao RNAt e outro que reconhece um aminoácido incorreto já ligado e o remove por hidrólise. Esse processo é energeticamente custoso, pois também acaba removendo uma parcela considerável de aminoácidos ligados corretamente. O segundo mecanismo baseia-se em fatores de elongação, que ligam-se fortemente ao aminoácido do aminoacil-rnat e a uma molécula de GTP (trifosfato de guanosina, um tipo de nucleotídeo). O reconhecimento inicial de um códon ativa a hidrólise do GTP pelo fator de elongação, produzindo um curto impedimento entre o pareamento códon-anticódon e a elongação da cadeia polipeptídica. Logo, como um RNAt incorreto forma um número menor de ligação de hidrogênio que um correto, ele se liga fracamente a um ribossomo e acaba se soltando do RNAm durante esse tempo. Ribossomos procarióticos e eucarióticos são altamente homólogos, apesar das diferenças no número e tamanho de seus RNAr e componentes protéicos. Acredita-se que a grande quantidade de RNA remanescente nos ribossomos 4

atuais reflita o que ocorreu em estágios primários da evolução, antes das proteínas dominarem a catálise de processos biológicos. 1.2 Reparo do DNA Apesar de que sobrevivência em longo prazo de uma determinada espécie possa ser aumentada por mudanças genéticas, a sobrevivência de um indivíduo requer estabilidade gênica. Caso uma mudança não seja corrigida pelos processos de reparo, torna-se permanente e recebe o nome de mutação (podendo causar os mais variados efeitos num organismo). A taxa de mutação apenas pode ser estimada indiretamente, pela análise da seqüência de aminoácidos de uma mesma proteína em várias espécies. Analisando fibrinopeptídeos (proteínas envolvidas na coagulação do sangue, que toleram quase qualquer mudança em seus aminoácidos), estima-se que uma proteína de tamanho médio (400 aminoácidos) sofra uma mudança em um aminoácido a cada 200000 anos (o que mostra a fidelidade com que são mantidas as seqüências de DNA). Mudanças em algumas proteínas são evidentemente mais danosas que em outras (6 a cada 7 mudanças aleatórias na hemoglobina são fatais contra 29 de cada 30 no citocromo c), mas quase todas são deletérias. Apesar da taxa de mutação parecer ser pequena, ela limita o número de proteínas essenciais que qualquer organismo consegue codificar em sua linhagem germinativa a aproximadamente 60000. Enquanto células germinativas precisam ser protegidas de taxas altas de mutação para manter a espécie, células somáticas precisam ser protegidas para evitar a morte do indivíduo (que pode ocorrer devido à proliferação celular descontrolada ou câncer). Vários danos no DNA ocorrem de forma espontânea devido à flutuações térmicas: aproximadamente 5000 bases púricas são perdidas por dia do DNA de uma célula humana pela quebra de sua ligação com a desoxirribose. Estima-se que a desaminação espontânea de citosina a uracila ocorra a uma taxa de 100 bases por genoma por dia. Existe uma variedade de mecanismos de reparo (cada um catalisado por um conjunto diferente de enzimas), mas quase todos dependem da existência de duas cópias da informação genética. A via básica de reparo do DNA evolve três passos: 1. a porção alterada de uma cadeia é reconhecida e removida por nucleases de reparo do DNA, que deixam uma pequena lacuna no local. 2. a DNA polimerase liga-se à ponta 3 da cadeia cortada e preenche a 5

lacuna fazendo uma cópia complementar dos nucleotídeos na cadeia vizinha intacta. 3. o corte deixado na cadeia danificada é fechado pela DNA ligase, completando a restauração. O dano no DNA pode ser reparado por mais de uma via, dependendo do tipo de dano. O reparo por excisão de bases envolve vários tipos de enzimas chamadas DNA glicosilases: cada uma delas reconhece uma base alterada no DNA e catalisa a sua remoção hidrolítica. Existem pelo menos seis tipos dessas enzimas, incluindo as que removem citosinas e adeninas desaminadas, bases alquiladas ou oxidadas, bases com anéis abertos e bases nas quais a ligação dupla carbono-carbono foi convertida para uma ligação simples. Em seguida, as enzimas AP endonuclease e fosfodiesterase removem o açúcar exposto, a lacuna é preenchida pela DNA polimerase e pela DNA ligase. O reparo por excisão de nucleotídeos é capaz de remover quase qualquer tipo de dano no DNA que cause uma grande mudança na dupla hélice. Tais lesões incluem as criadas pela reação de bases do DNA com hidrocarbonetos (como o carcinógeno benzopireno) ou dímeros de pirimidina (T-T, T-C e C- C) causados pela radiação ultravioleta. Quando uma lesão é encontrada, a porção da cadeia que a circunda (um oligonucleotídeo) é cortada nas duas pontas e removida pela enzima DNA helicase. A lacuna produzida é então reparada pela DNA polimerase e pela DNA ligase. A maioria dos processos de reparo requer que a cadeia complementar à danificada esteja intacta, mas mesmo quando isso não acontece existe alguma chance do dano ser reparado. Este mecanismo reparador requer que uma segunda hélice da mesma sequência esteja disponível na célula, usando técnicas de recombinação genética para transferir a informação de uma hélice para a outra (num processo chamado de conversão gênica). 1.3 Replicação do DNA Além de manter a integridade das sequências de DNA, todos os organismos precisam duplicar seu DNA de forma precisa antes de cada divisão celular. A velocidade e a precisão necessárias para tanto são adquiridas por meios de complexos multienzimáticos que guiam o processo. O processo no qual uma sequência de nucleotídeos de uma cadeia de DNA é copiada por pareamento complementar de bases em uma sequência complementar (de DNA ou RNA) é denominada templating de DNA. Em 1957 foi descoberta a primeira enzima polimerizadora de nucleotídeos, a DNA polimerase (tendo trifosfatos de desoxirribonucleosídeos). Em seguida 6

foi isolada a RNA polimerase, cujos substratos eram os trifosfatos de ribonucleosídeos. No caso do DNA, como cada uma das moléculas filhas possui uma cadeia nova e herda apenas uma cadeia "pronta"da molécula mãe, a replicação é dita semiconservativa. Análises feitas no anos 1960 revelaram que uma região localizada de replicação se move pela dupla hélice de DNA parental. Por causa de sua estrutura em forma de Y, está região é chamada de garfo de replicação do DNA. Inicialmente pensou-se que (devido à orientação antiparalela na dupla hélice do DNA) uma das cadeias filhas crescia da ponta 5 à ponta 3 e a outra crescia da 3 à 5 (crescimento em "direção à cabeça"). Porém, uma enzima que catalisasse a polimerização da 3 à 5 nunca foi encontrada. A síntese da cadeia que começa na ponta 3 ocorre devido à formação de fragmentos de Okazaki (cadeias de DNA com 1000 a 2000 nucleotídeos) que são sintetizados apenas da ponta 5 à 3 (apesar da cadeia em que estão ser aberta da ponta 5 à 3 ) e unidos (após sua síntese) pela mesma DNA ligase responsável pelo reparo do DNA. Logo, um garfo de replicação possui uma estrutura assimétrica: a cadeia filha sintetizada continuamente (da ponta 5 à 3, tendo a cadeia que é aberta da ponta 3 à 5 como molde) é a cadeia líder, e sua síntese precede a da outra cadeia filha (a cadeia atrasada) que é sintetizada descontinuamente (pela união dos fragmentos de Okazaki). A fidelidade de cópia do DNA é tal que ocorre um erro a cada 10 9 pares de bases replicados, como requerido para manter um genoma de 3 10 9 pares de bases (no caso dos mamíferos). Isso ocorre devido a vários mecanismos de correção de erros existentes. Um desses mecanismos depende de propriedades especiais da DNA polimerase: diferentemente da RNA polimerase, ela requer um terminal 3 -OH de uma cadeia iniciadora (primer) ao qual adicionar nucleotídeos. Além disso, caso esse terminal não esteja corretamente pareado com a cadeia mãe, a DNA polimerase inverte seu sentido (indo da 3 à 5 ) para excisar a base incorreta e então continuar a polimerização (da 5 à 3 ). Por isso a DNA polimerase é dita uma enzima autocorretora. A cadeia líder precisa de um primer apenas no começo da replicação, mas a cadeia atrasada necessita de vários primers por sintetizar vários fragmentos descontínuos. Os primer são compostos de RNA (aproximadamente 10 nucleotídeos em eucariontes), e são sintetizados pela enzima DNA primase. Após a síntese, são elongados pela DNA polimerase para formar os fragmentos de Okazaki, até que a enzima encontre o primer de RNA na ponta 5 do fragmento anterior. Em seguida, o primer é removido (por uma RNase), substituído por DNA (pela DNA polimerase) e os dois fragmetnos são unidos (pela DNA ligase). Para que as duas cadeias de uma molécula de DNA fiquem expostas e 7

sirvam de molde para a replicação, a dupla hélice precisa ser aberta além do ponto onde está o garfo de replicação. Como ela é muito estável em condições normais, e necessária a ação de dois tipos de proteínas para que isso ocorra: as DNA helicases e as proteínas SSB (single-strand DNA-binding proteins). DNA helicases foram isoladas pela primeira vez como proteínas que hidrolisam ATP (o que a faz mudar de forma de uma maneira que permite a realização de trabalho mecânico) quando ligadas a um filamento único de DNA. DNA helicases se utilizam da energia gerada para mover-se rapidamente pelo filamento onde estão, removendo eventuais filamentos complementares. As proteínas SSB ligam-se a filamentos simples de DNA (mas deixando as bases expostas) de modo cooperativo para prevenir a formação de curtas hélices (num mesmo filamento) que podem impedir o progresso da DNA polimerase. Por conta própria, a DNA polimerase sintetizaria apenas um curto oligonucleotídeo antes de se desacoplar de um molde de DNA. Essa dissociação facilita a criação de fragmentos de Okazaki, mas dificulta a síntese de longas cadeias (como a da cadeia líder). Para evitar o desacoplamento, um anel proteico deslizante liga-se à parte anterior da DNA polimerase (anexados e removidos do DNA por proteínas chamadas fatores de replicação C), sem impedir o seu movimento. Todas as estruturas mencionadas acima trabalham em conjunto para efetuar a replicação, sendo que a DNA primase liga-se diretamente à DNA helicase no filamento atrasado para formar um primossomo, que cria primers de RNA enquanto a DNA helicase avança. Existe ainda outro mecanismo para correção dos erros que passam pelo "máquinário"de replicação, formado pelas proteínas MutS e MutL. MutS ligase a um par de bases pareado incorretamente, enquanto MutL procura o DNA circundante por um corte (que indica que a cadeia foi sintetizada recentemente, e portanto ela é que contém o erro). Em seguida, ocorre a remoção do filamento entre MutS e MutL e o reparo do DNA recém-formado. Tanto em bactérias quanto em mamíferos, os garfos de replicação de originam em uma estrutura chamada bolha de replicação, na qual são formados dois garfos que se movem em sentidos opostos. As bolhas se formam em sequências especiais do DNA ditas origens de replicação (aproximadamente 300 nucleotídeos). Proteínas iniciadoras ligam-se a pontos específicos da origem de replicação, formando um grande complexo. Este complexo liga a DNA helicase a um filamento exposto, seguida da DNA primase e da DNA polimerase. Um último problema não mencionado até agora é que cada 10 pares de bases replicados no grafo correspondem a uma volta completa em torno do eixo da dupla hélice parental. Logo, para que um garfo se mova, todo o cro- 8

mossomo depois do garfo teria que girar rapidamente (consumindo grande quantidade de energia). Para evitar isso, torniquetes de proteínas chamados DNA topoisomerases se formam ao redor da hélice de DNA. Uma topoisomerase pode ser vista como uma nuclease reversível que se liga covalentemente a um fosfato de DNA, quebrando uma ligação fosfodiéster (e permitindo que duas partes da hélice girem independentemente, diminuindo a tensão). Usando a energia da ligação covalente com o fosfato, a clivagem é revertida posteriormente sem precisar de energia adicional. 1.4 Recombinação genética Apesar de a estabilidade genética ser importante para a sobrevivência dos indivíduos, a sobrevivência em longo prazo depende da variação (causada pela recombinação genética). Existem dois tipos de recombinação: a geral e a específica por sítio. Na recombinação geral, a troca ocorre entre qualquer par de sequências de DNA homólogas. Um dos exemplos mais importantes é a troca de pedaços entre cromossomos homólogos que ocorre na meiose de eucariontes. Na recombinação específica por sítio, a homologia não é requerida: a troca ocorre em sequências específicas (em uma ou ambas as moléculas de DNA participantes) que são reconhecidas por enzimas de recombinação específicas de sítio. Logo, esse tipo de recombinação altera as posições relativas de sequências de nucleotídeos no genoma. A recombinação geral ocorre quando duas moléculas de DNA homólogas tem suas hélices quebradas e então permutadas (o sítio de troca pode ocorre em qualquer posição). No sítio de troca, um filamento de uma molécula pareia-se a um filamento da segunda molécula para criar uma junta heteroduplex (sem alteração das sequências de nucleotídeos). Sabe-se que um único corte num filamento de uma molécula de DNA é suficiente para iniciar uma recombinação geral, como ocorre em E. coli (pela ação da proteína RecBCD, que é uma helicase e também uma nuclease). A hibridização (reconstituição de uma dupla hélice a partir de seus filamentos, que é central para recombinação geral) do DNA pode ser simulada num tubo de ensaio. Ela ocorre quando uma rara colisão aleatória justapõe seqüências de nucleotídeos complementares (que estão em dois filamentos de DNA complementares), permitindo a formação de uma parte da dupla-hélice. Este passo relativamente lento é seguido do rápido pareamento de todo o resto das duas cadeias (como um zíper se fechando). Células bacteriais utilizam proteínas SSB para manter os filamentos numa geometria favorável (linear) ao pareamento das cadeias. Na recombinção geral, um filamento único de DNA precisa invadir uma 9

outra dupla hélice. Em E. coli, este processo requere a proteína RecA. Ela possui mais de um sítio de ligação ao DNA, e portanto pode unir um filamento único e uma dupla hélice (numa reação em vários passos chamada sinapse). Após a sinapse, uma curta região heteroduplex (onde dois filamentos de duas moléculas de DNA diferentes começam a se parear) é alargada pela migração em ramos (direcionada pela proteína RecA). A migração em ramos espontânea é um "passeio aleatório", e por isso faz pouco progresso por longas distâncias. A recombinação geral normalmente envolve a formação de uma importante estrutura intermediária: a junção de Holliday. Nesta estrutura, as duas hélicas homólogas de DNA são mantidas juntas por troca mútua de dois dos quatro filamentos presentes (um de cada hélice). Não é necessária a quebra do pareamento de bases para mantê-la, e ela possui duas propriedades importantes: 1. o ponto onde os dois filamentos se cruzam pode migar rapidamente para trás ou para frente nas hélices. 2. ela possui dois pares de filamentos: um par se cruzando e o outro não (a estrutura pode - porém - sofrer isomerização, fazendo com que dois filamentos que não se cruzavam se cruzarem e vice-versa). Um tipo de fenômeno que ocorre devido à recombinação geral (e mecanismos de reparo do DNA) é a conversão gênica, que consiste na mudança de um alelo (versão de um gene) de um genitor para um alelo de outro genitor (causando desequilíbrio na quantidade de material genético herdada de cada um dos pais). Durante a meiose juntas heteroduplex são formadas nos sítios de permutação entre cromossomos homólogos (um paterno e um materno). Se as seqüências de DNA forem levemente diferentes, a junta pode incluir algumas bases pareadas incorretamente. O mau pareamento na dupla hélice pode ser corrigido pelos mecanismos de reparo, eliminando nucleotídeos no filamento paterno e os substituindo por nucleotídeos que casem com o filamento materno (ou vice-versa, cujo resultado será uma conversão gênica). Deduz-se que o mesmo mecanismo de correção de erros que detecta erros de replicação também seja responsável por evitar recombinação entre duas seqüências de DNA que não casem perfeitamente (mesmo que os dois cromossomos tenham 80 A recombinação específica por sítio conservativa (reversível) é guiada por uma enzima que reconhece sequências específicas de nucleotídeos em uma ou ambas as moléculas de DNA recombinante. Separando e juntando moléculas de DNA em pontos específicos, este tipo de recombinação permite que 10

vários tipos de DNAs móveis desloquem-se pelos cromossomos. Um exemplo ocorre no vírus bacteriófago lambda, cujo genoma se integra ao do genoma hospedeiro através da ação da enzima lambda integrase. Já a recombinação específica por sítio transposicional não requer uma sequencia específica de DNA no cromossomo alvo, e não forma uma junta heteroduplex na união dos recombinantes. Em vez disso, as integrases cortam as duas pontas da seqüência de DNA do elemento genético móvel e catalisam um ataque direto na molécula alvo utilizando essas pontas. 1.5 Vírus, plasmídeos e elementos genéticos de transposição Muitas sequências de DNA podem se replicar independentemente do resto do genoma. Cromossomos virais são os mais independentes (de seus hospedeiros) por ter uma capa proteica que os permite moverem-se livremente de célula para célula. Vírus são intimamente relacionados a plasmídeos e elementos de transposição, que são sequências de DNA que não possuem capa e portanto são mais dependentes da célula hospedeira (e restritos a ela e sua prole). A ideia de que vírus e genes desempenham funções similares foi confirmada em estudos com bacteriófagos (vírus bacteriais). Em 1952 mostrouse que o DNA do bacteriófago T4 (e não a sua proteína) invade a célula hospedeira e começa a se replicar (gerando centenas de vírus numa mesma célula). A multiplicação viral por si só costuma ser letal para as células em que ocorre; em muitos casos a célula infectada se rompe (lise) e permite que a prole tenha acesso a células vizinhas. O envoltório proteico que envolve o ácido nucleico da maioria dos vírus (o capsídeo) contém mais de um tipo de cadeia polipetídica, comumente dispostas em várias camadas. Além disso, muitos vírus têm o capsídeo envolto por uma dupla membrana lipídica (o envelope, normalmente adquirido através das proteínas da membrana plasmática do hospedeiro através do brotamento). Como o genoma viral costuma ter um número de nucleotídeos muito menor que o da célula, não há necessidade de manter o material genético numa estrutura de dupla hélice de DNA (estável e de fácil reparo). Logo, a informação genética de um vírus pode ser carregada de várias formas: DNA ou RNA, filamentos simples ou duplos, estrutura linear ou circular, etc. A maioria dos vírus codifica não só a proteína de seu envoltório como também uma ou mais enzimas necessárias à replicação de seu ácido nucleico. No caso de vírus de DNA, essas enzimas seletivamente iniciam a síntese 11

do DNA viral reconhecendo uma seqüência específica de nucleotídeos que servem como origem de replicação. Isso é importante porque um vírus precisa neutralizar os sinais de controle da célula, que (se funcionais) poderiam fazer o DNA viral se replicar no mesmo ritmo do DNA hospedeiro. Tanto vírus de RNA quanto de DNA se replicam através da formação de filamentos complementares. No caso dos vírus de RNA, este processo é catalisado por enzimas RNA polimerase (replicases), que sempre estão no capsídeo de vírus com senso negativo (nos quais o filamento infectante não codifica proteínas, e sim serve de molde para um RNAm funcional). Por outro lado, para vírus de RNA com senso positivo, o próprio RNA infectante serve como RNAm e é capaz de produzir replicases quando entra no hospedeiro. Todos os vírus possuem apenas uma quantidade limitada de ácido nucleico, e por isso precisam parasitar as vias metabólicas da célula hospedeira em várias etapas de sua reprodução. Um exemplo é o vírus da floresta Semliki, que utiliza a via endocítica para entrar na célula. Antes de ser transferido ao lisossomo, o vírus escapa (deixando que seu envelope se funda ao endossomo) e seu capsídeo é degradado no citosol (soltando o RNA viral). A partir daí o RNA viral utiliza-se dos ribossomos (para sua replicação e síntese de proteínas do capsídeo e do envelope) e do complexo de Golgi (que transporta as proteínas do envelope para a membrana plasmática) do hospedeiro. As proteínas do envelope viral são todas transmembranares (fazem parte da membrana, atravessando-a) sintetizadas no retículo endoplasmático, cada uma delas carregando um sinal de endereçamento que as direcionam para um tipo de membrana em particular (seu local de destino determina o sítio do brotamento viral). Nem sempre um cromossomo viral imediatamente cria um grande número de cópias e de proteínas virais após a infecção da célula (ciclo lítico). Em vez disso, muitos entram em um estado de latência (ciclo lisogênico), no qual seus genomas estão presentes na célula, porém inativos (e incorporados - como provírus - ao genoma da célula hospedeira). Uma célula em ciclo lisogênico costuma entrar em ciclo lítico quando é submetida a algum estresse (luz ultravioleta ou radiação ionizante), fazendo com que o vírus não pereça com a célula hospedeira. Alguns tipos de células animais (não-permissivas) oferecem aos vírus uma alternativas ao crescimento lítico: o cromossomo viral se integra ao genoma do hospedeiro ou permanece como plasmídeo que se replica de forma controlada (sem matar a célula). O problema de tal infecção está na mudança genética do hospedeiro, que pode causar a proliferação descontrolada (câncer) do mesmo (nesse caso, o vírus é dito um oncovírus e processo é a transformação neoplásica). Para um grupo de vírus de RNA (os oncovírus de RNA), a infecção de 12

uma célula permissiva (permite que o vírus se multiplique de forma lítica) leva à replicação não-letal do vírus e a uma mudança genética permanente (que pode ocorrer em qualquer ponto, pela ação da enzima integrase) na célula infectada. Vírus de RNA capazes de promover alterações genéticas são ditos retrovírus, que possuem uma DNA polimerase capaz de usar tanto RNA quanto DNA como molde (a transcriptase reversa). Muitos genomas possuem seqüências de DNA móveis que não formam partículas virais e estão confinados à mesma célula (são os elementos de transposição). Cada elementos de transposição é ocasionalmente ativado para mover-se a outro sítio do DNA (da mesma célula) em um processo chamado transposição, catalisado por suas próprias enzimas de recombinação (integrases ou transposases). Uma grande família de elementos de transposição (os retrotransposons) se transpõe de forma análoga ao de um retrovírus: 1. transcrição de todo o elemento de transposição, gerando um RNA. 2. o RNA serve como molde para a síntese de uma dupla molécula de DNA (pela ação da transcriptase reversa codificada pelo elemento) Diferentemente dos retrotransposons, a maioria dos elementos de transposição dificilmente existem livres dos cromossomos do hospedeiro; as transposases que catalisam seu movimento agem em seu DNA enquanto ele ainda está integrado ao genoma do hospedeiro. Para alguns mecanismos de transposição o mecanismo difere apenas no fato de que a molécula de DNA a ser integrada precisa ser excisada de uma molécula de DNA muito maior (deixando quebras no cromossomo hospedeiro, que podem resultar em mutações após o reparo). 13