KATIA MOREIRA DA SILVA

Universidade Federal Fluminense Faculdade de Medicina Veterinária Programa de Pós-Graduação em Clínica e Reprodução Animal KATIA MOREIRA DA SILVA AVALIAÇÃO CITOLÓGICA DO LAVADO TRAQUEAL DE EQÜINOS DE PÓLO PÓS EXERCÍCIO Niterói 2010

24 KATIA MOREIRA DA SILVA AVALIAÇÃO CITOLÓGICA DO LAVADO TRAQUEAL DE EQÜINOS DE PÓLO PÓS EXERCÍCIO. Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, para a obtenção do título de Mestre. Área de concentração:clínica e Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. DANIEL AUGUSTO BARROSO LESSA Niterói 2010

25 KATIA MOREIRA DA SILVA AVALIAÇÃO CITOLÓGICA DO LAVADO TRAQUEAL DE EQÜINOS DE PÓLO APÓS O EXERCÍCIO PÓS EXERCÍCIO Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, para a obtenção do título de Mestre. Área de Concentração:Clínica Médica Animal. Aprovada em Março de 2010 Banca Examinadora Prof. Dr. Daniel Augusto Barroso Lessa UFF Prof. Dr. Wilson Roberto Fernandes FMVZ/USP Prof. Dr. Paulo de Tarso Landgraf Botteon IV /UFRRJ

26 S586 Silva, Katia Moreira da Avaliação citológica do lavado traqueal de eqüinos de pólo pós exercício)/katia Moreira da Silva; orientador Daniel Augusto Barroso Lessa. - 2010. 57f. Dissertação (Mestrado em Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, 2010. Orientador: Daniel Augusto Barroso Lessa 1. Citodiagnóstico. 2. Cavalo de Polo. 3. Citologia. 4. Endoscopia veterinária. I. Título. CDD 636.089607582

27 DEDICATÓRIA A minha mãe, Elisabeth, por ser meu apoio, meu alicerce, meu tudo. Ao Bernardo pelo apoio, compreensão e paciência, principalmente nestes dois últimos anos. Aos meus novos amigos, os cavalos.

28 AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, Prof. Daniel Lessa pelo apoio constante, ensinamentos e compreensão. Aos comandantes do Regimento de Cavalaria de Guardas Andrade Neves (RCGd/EB) pela autorização para utilização dos animais neste trabalho. A todos do regimento pela colaboração e auxílio, em especial ao tenente Estevão Grossi e tenente Henri. Aos proprietários dos animais do Itanhangá Golf Clube por disponibilizarem os animais para este estudo. Ao médico veterinário Alexandre pela disponibilidade e ajuda inestimável sem a qual seria impossível a realização deste trabalho. Ao grupo de pesquisa em medicina de eqüídeos da Universidade Federal Fluminense (HIPIATRAS) em especial aos amigos Joana, Aline, Juliana, Denis, Maria Luisa e Vanessa pela amizade, companheirismo e apoio demonstrados nessa missão. Sem a ajuda de vocês, certamente este trabalho não teria chegado a lugar nenhum. A Médica Veterinária Eliene Sad por sempre se dispor a ajudar e pelo empréstimo das sondas utilizadas. Ao Prof. Nayro Alencar por toda a ajuda e apoio no decorrer deste trabalho. Aos amigos do Laboratório de Patologia Clínica da Universidade Federal Fluminense, Laborlife Análises Clínicas e Laboratório Plasma pelo auxílio e disponibilidade de suas instalações para confecção e leitura das lâminas A todos aqueles que fizeram deste trabalho, um verdadeiro trabalho em equipe, o meu sincero agradecimento.

29 RESUMO O pólo é um dos mais antigos esportes eqüestres, tendo sido introduzido no Brasil na década de 1920 e vem crescendo desde então. O aparelho respiratório é fundamental para a saúde e bom desempenho atlético dos eqüinos, sendo os processos mórbidos neste sistema responsáveis por prejuízos orgânicos e econômicos consideráveis. Dentre as enfermidades de maior importância do trato respiratório eqüino, estão os processos inflamatórios não infecciosos de vias aéreas posteriores e a Hemorragia Pulmonar Induzida pelo Exercício (HPIE). A citologia de lavado traqueal é considerada mais específica do que somente o exame endoscópico no diagnóstico dessas enfermidades. Considerando que os eqüinos de pólo ainda são pouco explorados no que se refere a estudos clínicos, este trabalho teve por objetivo avaliar a citologia do lavado traqueal de eqüinos regularmente utilizados em atividades de pólo, com ênfase no diagnóstico da HPIE. Foram utilizados 37 equinos e para triagem e formação dos grupos, foi realizado exame físico incluindo-se a endoscopia, 30 a 90 minutos após a participação do animal na partida. O grupo 1 foi formado por animais sem alteração de ausculta, com graus 0 e 1 de muco na endoscopia e/ou sangue na endoscopia, sendo os animais do Grupo 2 àqueles com muco e sangue no exame. O lavado traqueal foi realizado entre 16 e 24 horas após o exercício. A ocorrência de processo inflamatório pôde ser caracterizada em 22,2% dos animais do Grupo 1 e 27,0% do Grupo 2. Para o diagnóstico da HPIE foram considerados: a presença de hemácias, a eritrofagocitose e o escore total de hemossiderófagos (ETH). Hemácias foram observadas em 44,4% dos animais do Grupo 1 e 66,6% do Grupo 2, enquanto a eritrofagocitose foi observada em 11,1% do Grupo 1 e 2,7% do Grupo 2. Considerando o ETH, a HPIE não foi observada em nenhum animal do Grupo 1 e encontrada em 22,2% no Grupo 2. Apesar de estarem aparentemente assintomáticos, os animais apresentaram quadros citológicos compatíveis com processo inflamatório e HPIE em proporções relevantes, fato que deve levar essas enfermidades a serem consideradas como uma das primeiras opções de diagnóstico na investigação de queda de desempenho atlético de equinos nessa atividade esportiva Palavras-chaves: cavalo de pólo, endoscopia, HPIE, lavado traqueal, citologia.

30 ABSTRACT Polo is one of the oldest team games, since 1920 and being in continuous development in this country (Brazil).The respiratory tract is essencial to health and performance for the sport equine medicine. Among the more important diseases are the non infectious airways disorders and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH).The cytology of tracheal wash is considered more specific that endoscopic exam to diagnose this diseases. The objective of this study was evaluate the cytology of tracheal wash of horses Thirty seven horses were used in this study divided in groups by physical exam and endoscopic results. The tracheal wash were performed between 16 and 24 hours after the game. Inflammatory disease could be recognized in 22% of the animals of group 1 e 27,0% of group 2 For the diagnoses of EIPH were considered the presence of red blood cells, eritrofagocitose and total hemossiderin score (THS).. Red blood cells were seen in 44,4% of the animals of group 1 and 66,6% of group 2 and eritrofagocitose was found in 11,1% of group 1 and 2,7% of Group 2. Considering the THS, EIPH were not observed in any animal of the group 1 and were seen in 22,2% os group 2. The results demonstrate that the horses apparently were health but they had cytological patterns that indicate inflammatory disease and EIPH. This fact shows that these diseases must be considered one of the most important options of diagnostic and investigation of bad performance in this sport activity. The THS were developed for bronchoalveolar lavage studies, so new studies must be done for estabilished a new cutoff point for THS in tracheal washes. Key Words: polo horses, endoscopy, EIPH, tracheal wash, citology

31 SUMÁRIO: Página LISTA DE ILUSTRAÇÕES 09 LISTA DE ABREVIATURAS 10 LISTA DE APÊNDICES 11 RESUMO 12 ABSTRACT 13 1.INTRODUÇÃO. 14 2.REVISÃO DE LITERATURA.. 16 3.MATERIAL E MÉTODO 23 3.1ANIMAIS 23 3.2. EXAME FÍSICO. 23 3.3. AVALIAÇÃO ENDOSCÓPICA 24 3.4. HEMOGRAMA E DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO PLASMÁTICO 25 3.5 - CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE PARA A FORMAÇÃO DOS GRUPOS: 25 3.6-OBTENÇÃO DO LAVADO TRAQUEAL: 25 3.7-PROCESSAMENTO E ANÁLISE DO LAVADO TRAQUEAL 27 3.7.1-Centrifugação do material e confecção de lâminas 27 3.7.2-Coloração do material 3.7.3-Avaliação citológica 3.8-INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 27 28 29

32 4.RESULTADOS 30 5.DISCUSSÃO: 37 6.CONCLUSÕES. 44 7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45 8. APENDICES 49

33 1.INTRODUÇÃO A equideocultura é uma atividade econômica altamente relevante, sendo o Brasil hoje, responsável pelo terceiro maior rebanho de equinos do mundo com 5,9 milhões de animais. Dentre as atividades equestres realizadas, as esportivas vêm cada dia mais se destacando e exigindo constante atualização dos profissionais envolvidos, principalmente no que tange a clínica médica veterinária, desde a prevenção ao diagnóstico e tratamento das enfermidades que acometem esses animais. Dentre os esportes equestres, o pólo é um dos jogos de times mais antigos do mundo. No Brasil, a partir de 2000, os organizadores dos torneios começaram a atrair novos jogadores, a ampliar a área de influência do esporte e a desenvolver a prática do mesmo (FANTINS, 2008; ARANHA, 2008). Desde então o esporte vem se desenvolvendo e crescendo. Um jogo de pólo dura pouco menos de uma hora, e é dividido por períodos. Conforme o nível dos participantes, podem variar de quatro a oito períodos por partida. Cada período tem duração de sete minutos e é feito um intervalo de três minutos entre eles. Apesar do número de praticantes não ser tão grande, se comparado com outros esportes equestres, é importante ressaltar que pelas características do jogo, cada jogador participa da competição com vários cavalos. Este fato aumenta o número de animais utilizados para esta atividade esportiva. Se considerarmos, como exemplo, uma partida de sete períodos, utilizando-se quatro cavalos por time em cada período, serão necessários aproximadamente 56 animais por jogo. O aparelho respiratório é fundamental para a saúde e bom desempenho atlético dos equinos, sendo os processos mórbidos neste sistema responsáveis por prejuízos orgânicos e econômicos consideráveis nesta espécie. De acordo com Derksen e Robinson (2002) dentre as enfermidades de maior importância do trato respiratório equino, estão os distúrbios não infecciosos de vias aéreas posteriores, tais como Obstrução Recorrente das Vias Aéreas

34 (ORVA), Doença Inflamatória das Vias Aéreas (DIVA) e Hemorragia Pulmonar Induzida pelo Exercício (HPIE), justamente por serem os que mais acometem equinos, principalmente os mais jovens e atletas. O estudo das secreções obtidas do trato respiratório já vem sendo utilizado no Brasil e tem sido considerado de grande valia, já que representa um meio semiológico importante, ajudando no diagnostico das doenças (GONÇALVES, 1997; SANCHES, 1998, MICHELOTTO et al. 2007 ). A citologia de lavado traqueal (LT) é considerada mais específica do que somente o exame endoscópico, sendo descrita como uma ferramenta no diagnóstico da doença pulmonar crônica, em particular no diagnóstico da ORVA e infecções por parasitos (DIXON, 1995). Em casos de suspeita de HPIE em que o diagnóstico endoscópico é negativo, a citologia torna-se fundamental devido à observação de células características dos processos hemorrágicos como os hemossiderófagos (HODGSON e HODGSON, 2003). Alguns trabalhos indicam que quase 100% dos cavalos em treinamento demonstram hemossiderófagos em lavados (WHITWEEL E GREET, 1984). Apesar do lavado broncoalveolar (LBA) ser o método mais recomendado e utilizado para coleta de material para a avaliação do trato respiratório posterior, Hoffman (2008) afirma que realização deste procedimento exige que o animal permaneça em repouso nas 24 a 48 horas posteriores. No caso de animais atletas em atividade constante, como os utilizados no pólo, esse repouso torna-se inviável. Nessas situações, o lavado traqueal pode ser utilizado, uma vez que não há necessidade de repouso após a realização do procedimento. Apesar do crescimento do número de animais utilizados para a atividade de pólo e a alta frequência já relatada das enfermidades respiratórias em equinos (BURRELL, 1985; ROSSDALE et al. 1985, SWEENEY, 1991; WOOD et al. 1999; CHAPMAN et al. 2000; LESSA et al. 2005), equinos utilizados para a prática do pólo ainda são pouco explorados no que se refere a estudos clínicos e epidemiológicos destas doenças. Nesse contexto, este trabalho teve por objetivo avaliar a citologia do lavado traqueal (LT) de equinos utilizados para jogo de pólo, com ênfase no diagnóstico semi-quantitativo da hemorragia pulmonar induzida pelo exercício

35 2.REVISÃO DE LITERATURA O aspirado traqueal foi introduzido por Pecora (1959) primeiramente na medicina humana como método de colheita de amostras do trato respiratório para analises microbiológicas e citológicas. Beech (1975) foi uma das primeiras a introduzir a técnica do aspirado traqueobrônquico em equinos. Para a coleta do material 10cm 2 de área no terço inferior do pescoço foi higienizada, como num procedimento cirúrgico, e infiltrada com anestésico local subcutâneo. Após a incisão, uma agulha foi introduzida no espaço entre os anéis traqueais. Após a remoção da agulha, um tubo com 30 cm de comprimento foi introduzido sendo infundidos 30mL de solução salina, rapidamente aspirada. A coleta de aspirado traqueal em equinos foi também descrita por Mansmann e Knight (1972) e Mansmann e Strouss (1976), dentre outros. Posteriormente, Greet (1982) descreveu o método de coleta do aspirado via endoscópio. Hodgson e Hodgson (2003) afirmam que este método tem se tornado popular sendo considerado uma boa alternativa para coleta de material de traquéia. Por ser uma técnica não invasiva, ela ainda permite que o catéter seja guiado e proporciona a inspeção do trato respiratório na hora da coleta de material podendo ser realizada a avaliação da traquéia (grau de hiperemia) e conteúdo luminal ( quantidade e qualidade do muco, secreção mucopurulenta e sangue), dados que podem auxiliar na interpretação dos resultados citológicos. Os autores ainda descrevem a técnica de coleta para lavados traqueais. Para isso, um catéter de polietileno é inserido através do canal de biópsia do endoscópio e 10 a 15 ml de solução salina são instilados. Na área ventral na traquéia, anterior a carina, forma-se um acúmulo de fluido que pode então ser aspirado mais facilmente. Esta técnica se aplica principalmente para o exame citológico. A técnica transtraqueal possui a vantagem de eliminar a passagem pela cavidade nasal e porções do

36 trato respiratório anterior, diminuindo o risco de contaminação da amostra por microorganismos. Porém, a técnica de aspiração via endoscópio é menos invasiva e permite a visualização do trato respiratório e do material a ser coletado. A descrição dos achados de lavados traqueais de animais considerados normais foi realizada por Beech (1975). As amostras deste estudo eram compostas predominantemente por células epiteliais colunares ciliadas, apresentando também raros neutrófilos, algumas células mononucleadas e células fagocíticas. Podem ser encontrados alguns esporos e hifas ocasionais, assim como células mononucleares grandes. Em alguns aspirados, havia células multinucleadas com citoplasma vacuolado. A presença de eosinófilos e células caliciformes foram baixas ou mesmo ausente em alguns animais. A autora também descreveu achados em casos de animais com broncopneumonia. Nestes animais, os neutrófilos representavam cerca de 40% das células e frequentemente excediam os 90% em casos agudos. Muitos desses neutrófilos tinham núcleo hipersegmentado e aparentemente estavam fragmentados ou degenerados. O muco na maioria dos animais era abundante, embora em alguns fosse escasso e o aspirado quase que formado totalmente de agregados de neutrófilos. Macrófagos contendo bactérias em seu citoplasma também foram descritos e em alguns casos, bactérias foram observadas junto ao muco. O aspirado de quatro animais com histórico de epistaxe tinha em sua maioria células epiteliais normais e macrófagos. Havia alguns macrófagos grandes com grânulos esverdeados intracitoplasmáticos de hemossiderina. Utilizando a coleta via endoscópio, Whitwell e Greet (1984) avaliaram 223 lavados traqueais de 191 equinos. Por meio de uma análise celular semi-quantitativa, os autores afirmam que as células epiteliais ciliadas eram de proporção significativa em 75% dos animais normais. Macrófagos alveolares foram também encontrados em número considerável em todas as categorias. Neutrófilos foram observados em quase todos os lavados, sendo sua ausência encontrada em poucos animais normais. Embora os neutrófilos tenham formado uma proporção significativa de células em um terço dos animais, os autores não consideram esta uma avaliação importante, visto que parte dos animais possuía contagens celulares totais baixas. Larson e Busch (1985) realizaram 166 lavados traqueobrônquicos em animais sadios e com achados histopatológicos de pneumonia intersticial, broncopneumonia, eosinofilia focal e difusa e bronquite crônica e supurativa. Nos 92 animais com pulmões sadios, os autores obtiveram uma média e desvio padrão das porcentagens de neutrófilos de 39±21% no lavado traqueobrônquico, variando de 3 a 83%. Eosinófilos foram encontrados em 3,5±2,0 % variando de 0 a 8%. Correlacionando os achados citológicos e histopatológicos dos animais

37 sadios e dos portadores de doença respiratória, os autores afirmam que existe pouca correlação entre os achados histopatológicos e os achados do lavado traqueobrônquico. Mair (1987) avaliou a importância do aspirado traqueal para equinos acometidos por ORVA. Encontrou uma média de 61,5±25,8% de neutrófilos, confirmando as observações de Whitwell e Greet (1984) que verificaram que em animais com ORVA há aumento significativo do número de neutrófilos. Freeman e Roszel (1987) avaliaram o padrão citológico normal para aspirados traqueais em eqüinos, por meio da obtenção de amostras de animais sem sinais clínicos de doença respiratória e/ou anormalidades do sistema pulmonar em necropsia. Aspirados traqueais dessas amostras celularidade discreta a moderada, ausência de sangue, baixa quantidade de proteína, fibrina e debris celulares, podendo ser encontrado pequena quantidade de muco.os autores afirmam que pode haver grande quantidade de células epiteliais colunares e cliliadas que podem apresentar núcleo picnótico. A presença dos macrófagos alveolares indica que a área terminal das porções do trato respiratório foi alcançada e está sendo representada. Essas células podem apresentar um citolplasma pouco denso ou espumoso, como sinal de ativação. Foram encontrados nos animais sadios, número baixo de neutrófilos, alguns degenerados e uma pequena quantidade de linfócitos.eosinófilos podem ou não estarem preesntes. Sweeney et al. (1992) realizaram um estudo em animais de corrida aparentemente saudáveis utilizando para a coleta do aspirado traqueal a técnica via trans-traqueal. Dos 66 animais avaliados, 73% apresentaram contagens percentuais de neutrófilos abaixo de 20%. Em 12%, os valores para neutrófilos encontravam-se entre 21 e 40%. Contagens de neutrófilos superiores a 40% foram obtidas em 15% dos animais. A presença de eosinófilos foi observada em 29 animais (44%) sendo que somente em dois, a percentagem excedeu o valor de 5%. As células epiteliais foram observadas em 19 (29%) dos animais. Hemossiderófagos foram observados em 58 animais (86%), sendo que, metade destes era sabidamente portador de HPIE diagnosticada por endoscopias prévias. Bain (1997) também descreve a presença de células colunares ciliadas e não ciliadas em animais considerados sadios. Poucos neutrófilos, macrófagos e quantidade escassa de muco também podem ser encontrados. A percentagem relativa dos tipos celulares em animais normais pode variar com a idade e o exercício. Os autores afirmam que potros tendem a ter uma maior porcentagem de neutrófilos. Estas células podem estar presentes em animais normais e suas características celulares são geralmente bem preservadas. Geralmente, os neutrófilos compreendem menos de 20% da população de células nucleadas em animais

38 normais. Ocasionalmente, outros leucócitos podem estar presentes, como eosinofilos (<3%) em animais normais. Mair et al. (1987) avaliaram a celularidade de 42 secreções obtidas dos diferentes níveis do trato respiratório (cavidade nasal, traquéia, brônquios e broncoalveolar) de equinos de idades variadas. Os autores compararam também as diferenças nas contagens celulares de secreções de traquéia obtidas via endoscopia e via trans-traqueal. A contagem diferencial do lavado traqueal demonstrou diferença significativa entre as duas formas de coleta quanto à percentagem de células epiteliais, macrófagos e neutrófilos. Em lavados obtidos via endoscópio foi observada uma média de 49,1 ± 11,5% de células epiteliais enquanto que em lavados trans-traqueais, os valores obtidos foram 19,8±6,1%. Derksen et al (1989) não encontraram correlação estatisticamente significativa entre as citologias de AT e LBA e afirmam que a população celular da traquéia não é representativa da população celular nas vias aéreas posteriores. Em seu estudo, os autores avaliaram 50 equinos com doença pulmonar crônica e dez animais controle, sem histórico de doença respiratória. Utilizando para obtenção do aspirado a infusão de 20 ml de solução salina estéril via endoscópio, os autores relatam uma contagem de neutrófilos nos animais controles de 32±8,9. A presença de hemossiderófagos foi observada no LBA de nove animais, destes, somente em quatro, estas células também foram observadas no LT. Fernandes et al. (2000) realizaram um estudo com a finalidade de avaliar os tipos celulares obtidos pelas técnicas de LBA e Lavado Traqueobrônquico (LTB) de cavalos clinicamente sadios, em lâminas citológicas coradas pelo método de Rosenfeld. Neste estudo utilizaram cinco equinos, que foram submetidos ao procedimento do LBA cinco vezes seguidas com um intervalo de sete dias entre as coletas, totalizando 25 amostras. A análise das citologias do LBA revelou uma porcentagem média de 81,5% de macrófagos, 2,91% de linfócitos, 8,92% de neutrófilos, 0,15% de mastócitos e 0,76% de eosinófilos. O macrófago foi o tipo celular predominante em ambos os lavados, comprovando a capacidade de que ambas as técnicas possuem plena capacidade de obter amostras representativas das porções bronco alveolares. Entretanto, a contagem de macrófagos mostrou uma diferença significativa entre as amostras, onde o LTB apresentou uma maior proporção deste tipo celular. A contagem diferencial dos demais tipos celulares foi semelhante. Segundo os autores, os resultados os permitiram concluir que o LTB disponibiliza uma maior variedade celular, o que significa que é capaz de coletar amostras de diferentes porções pulmonares que não só broncoalveolar.

39 As contagens diferenciais entre amostras de LT e LBA também foram comparadas por Malikides et al (2003). Neste estudo, foram realizados LT e LBA de 48 animais de corrida com queda de performance, avaliando-se a concordância no diagnóstico de doença inflamatória. Para tal, foram considerados sadios animais com contagens de neutrófilos abaixo de 20% nos LT e abaixo de 5% no LBA. A coleta foi realizada de uma a duas horas após o exercício em esteira. Em 19 das amostras pareadas, houve diferença na interpretação entre os LT e LBA, sendo que a inflamação das vias aéreas foi indicada pelas amostras de traquéia em 13 e em broncoalveolar em seis. A avaliação citológica de secreções do trato respiratório posterior é relatada como o método mais específico para o diagnóstico da DIVA (DERKSEN e ROBINSON,2002). Porém, a interpretação dos valores, principalmente quanto aos valores limítrofes de neutrófilos apresenta controvérsia entre os autores. Martin et al. (1999) avaliaram 42 LT de equinos com histórico de queda de performance. Os lavados foram obtidos antes e 30 minutos após o exercício, por meio de instilação de 30 ml de solução salina estéril via endoscópio. Foram considerados clinicamente normais 10 animais (24%), levando-se em conta as amostras obtidas antes e após o exercício. Em oito animais (19%) foi diagnosticada HPIE. Em sete equinos (17%) foram encontradas nas duas amostras evidências de HPIE e DIVA Dos animais coletados, seis amostras (14%) não puderam ser comparadas, pois o lavado obtido antes do exercício foi considerado inadequado. A interpretação entre as amostras foi diferente em cinco dos 36 animais (14%). Os autores recomendam que seja colhida a amostra após o exercício, pois esta contém mais secreções das vias aéreas e menos evidencias citológicas de contaminação orofaríngea. Christley et al (2001) em estudo de casos-controles, avaliaram 100 cavalos com tosse e 148 animais sem sinais clínicos. Nos animais com tosse foi observado um aumento significativo no escore de muco de trato anterior e traquéia e também maior frequência de hiperplasia folicular linfóide. Os AT destes animais tinham aumento de neutrófilos e apresentaram com mais frequência a presença de bactérias intracelulares que os animais controles. Para determinar se há aumento nos valores de neutrófilos após o exercício, Malikides et al (2007) realizaram AT de 40 animais. A coleta, realizada via endoscópio, por meio da infusão de 10mL de solução salina estéril foi realizada 24 horas antes e uma a duas horas após o exercício em esteira. A média da percentagem de neutrófilos foi significativamente maior nas amostras coletadas após o exercício. Em 15 animais classificados como menos que 20 %

40 de neutrófilos antes do exercício, a percentagem nos AT após aumentou significativamente excedendo os 20%. Em seis dos 15 animais, os valores aumentaram para mais de 50%. Estes autores recomendam que para um diagnóstico mais preciso, a coleta do AT seja realizada após o exercício, mas com intervalo de pelo menos uma a duas horas. Hemorragia Pulmonar Induzida pelo exercício A Hemorragia Pulmonar Induzida pelo Exercício (HPIE) é definida como sendo a presença de sangue livre, de origem pulmonar, na árvore traqueobrônquica ou sinais de sangue, após exercício intenso, geralmente identificado por endoscopia após 30 a 60 minutos depois do exercício (COSTA et al., 2004; NEWTON et al., 2005) e com os hemossiderófagos no Lavado Broncoalveolar (DOUCET e VIEL, 2002).É considerada por muitos, um dos maiores problemas médicos em cavalos de esporte por acarretar pela diminuição de desempenho e, em casos raros, levar o animal a morte. Numerosas causas e mecanismos fisiopatológicos têm sido propostos para a HPIE incluindo doenças das vias aéreas, obstrução de trato superior, hiperviscosidade sanguínea induzida pelo exercício, estresse mecânico da respiração e locomoção, redistribuição do fluxo sanguíneo no pulmão, diferenças nas pressões alveolares e hipertensão Pascoe et al (1981), em um estudo com 235 cavalos puro-sangue inglês, determinaram uma freqüência de 43,8% de hemorragia em vias aéreas, em diversos graus, sendo que somente 0,8 % apresentaram epistaxe. Raphael & Soma (1982) realizaram um estudo endoscópico em 191 animais de corrida em até duas horas após o exercício, verificando que 147 (75,4%) apresentavam evidências de HPIE e apenas 13 (9%) apresentavam epistaxe. Estes resultados permitem inferir que, embora a hemorragia pulmonar seja encontrada em um grande número de animais, a epistaxe é um achado relativamente infrequente deste fenômeno (SWEENEY, 1991). A ocorrência da HPIE já foi relatada em todos os cavalos PSI de corrida em treinamento (WEST et al., 1993; HINCHCLIFF, 2007), mas também constitui um problema em outras raças de cavalos que realizam exercício intenso, como os trotadores e os quarto de milha, e em cavalos realizando exercício de menor intensidade, como os cavalos de salto e tração (LAPOINTE et al., 1994; ERICKSON e POOLE, 2007; VICINO, 2007). Mc Kane et al (1993) em estudo com LBA de 62 animais de 1 a 7 anos em atividade esportiva. Os autores encontraram hemácias livres em 73% dos animais e hemossiderófagos em 90 % das amostras o que indica a ocorrência de hemorragia imediata ou passada. Os

41 autores também relatam maior quantidade de hemossiderina nos animais mais idosos. Não foram observadas diferenças na citologia do LBA no que se refere a sexo e performance esportiva. O escore semi quantitativo de hemossiderina nos macrófagos alveolares corados tem sido descrito e utilizado para avaliar a gravidade dos episódios de hemoptise em humanos (GOLDE et al, 1975). A utilização desse escore em LBA de equinos tem se mostrado um método de diagnóstico mais sensível do que somente as endoscopias repetidas para a detecção da HPIE (DOUCET e VIEL, 2002). Hegedus et al. (2007) realizaram um estudo com equinos sadios e portadores de HPIE. O lavado traqueal foi coletado duas horas após o exercício de acordo com metodologia de Mansmann e Knight (1972). Os animais foram separados em três grupos - Grupo 1 Animais com HPIE não tratados com furosemida, grupo 2, animais com HPIE tratados com furosemida e grupo controle (animais sem sangramento). Observou-se aumento no numero de neutrófilos nos grupos 1 e 2, portadores de HPIE (16,9% e 21,1%, respectivamente) quando comparados aos valores do grupo controle (9,7%). Associado ao aumento dos neutrófilos, houve um aumento de eosinófilos nos aspirados dos grupos 1 e 2 (4,5 e 15,8%) valores maiores do que os apresentados pelo grupo controle (2,7%). Observou-se também, uma redução no número de hemossiderófagos nos cavalos tratados com furosemida. O grupo 1 teve uma porcentagem de 7,8%, o grupo 2 teve média de 4,2 % e o grupo controle apenas 0,3% para a contagem deste tipo celular. É aceito que a HPIE é um problema de cavalos atletas e não de uma raça específica ou ligada a algum tipo de atividade. Biava et al (2006) descreveram a enfermidade em quartos de milha, sendo que 40% dos cavalos participantes de provas de seis balizas e 75% dos participantes de prova de três tambores apresentaram o problema. Lessa et al (2005) revisando vários autores, relataram que a incidência da HPIE em cavalos de pólo era de 11%. Burrell et al (1996) examinaram 60 equinos utilizados em corridas, uma hora após a competição e em três corridas diferentes, tendo obtido um percentual de 87% dos animais com evidência endoscópica de hemorragia pulmonar. Pascoe et al (1981), num estudo com 235 cavalos Puro Sangue Inglês examinados com endoscópio de fibra óptica num período de 2 horas após o exercício determinaram uma freqüência de 43,8 % (103) de eqüinos com vários graus de hemorragia no lúmen traqueal. Apenas dois desses cavalos tinham epistaxe e não demonstraram relação do grau de hemorragia com idade, sexo ou posição na corrida. No Brasil, a ocorrência da HPIE foi avaliada Biava et al. (2006) em cavalos Quartode-Milha, sem evidências de sangue na endoscopia. Os autores encontraram evidências

42 citológicas de HPIE em lavados de 58 % dos cavalos. Lessa et al (2005) em estudo realizado com 23 animais, encontraram evidências de HPIE em lavados broncoalveolares de 11 animais (47,8%). Em um estudo no Jockey Clube Brasileiro, Da Nova et al. (2000) encontraram num total de 200 animais, um percentual de 58% (117) positivos para HPIE. Em outro estudo realizado por Ganem et al (2007) no mesmo local, foi encontrado um percentual de 52,46% animais com evidências de sangue em endoscopia pós corrida. Moran et al. (2003) submeteram ao exame endoscópico 39 cavalos de pólo em treinamento no Chile. A realização do exame ocorreu duas a quatro horas após o exercício. Demonstrou-se que 48% dos animais apresentavam algum grau de HPIE. A ocorrência da HPIE em animais de pólo também foi avaliada por Voynick e Sweeney (1986). Utilizando a endoscopia pós jogo como ferramenta de diagnóstico, os autores encontraram uma frequência de 11,1% da enfermidade. As limitações de diagnóstico do exame endoscópico, principalmente no que tange ao intervalo entre o episódio hemorrágico e o momento do exame, ainda dificultam o diagnóstico em muitos cavalos (MEYER et al, 1998). Michelloto et al (2007) realizaram estudo com AT via endoscópio em equinos quartode-milha, participantes de prova de três tambores. Nenhum animal apresentou anormalidades ao exame clínico, incluindo epistaxe. Porém, em três animais observou-se hemossiderófagos, sugerindo que estes animais sofrem de HPIE subclínica. Foi observado também um aumento no número de neutrófilos, obtendo média de 23,1 ±35,93 de neutrófilos. Segundo os autores, o processo inflamatório muitas vezes passa despercebido por treinadores e proprietários, sendo necessário o exame clinico detalhado, incluindo a endoscopia e a citologia, para a real avaliação do trato respiratório. A presença de hemossiderófagos em secreções traqueobrônquicas tem sido estudada já há algum tempo. Porém, poucas tentativas têm sido realizadas a fim de quantificar a observação (DOUCET e VIEL, 2002). Doucet e Viel (2002) realizaram estudo com 74 animais, divididos em grupo controle e HPIE positivos, baseados em resultados de histórico e endoscopia. Os autores afirmam que todos os animais tiveram algum grau de hemossiderina, independente de seu grupo. Foi observada diferença significativa entre os escores dos grupos controle e portadores de HPIE. Por meio de testes estatísticos, os autores concluíram que quando utilizaram o escore de 75 como ponto de corte, o ETH demonstrou uma sensibilidade de 94% e especificidade de 88% para detecção da HPIE.

43 Biava et al. (2008) utilizaram o escore de hemossiderófagos de Doucet e Viel (2002) para avaliar a HPIE em 20 cavalos da raça quarto-de-milha. Os autores não observaram presença de sangue na endoscopia em nenhum animal, porém, citologicamente, 15% dos animais apresentaram ETH superior aos valores de referência, sendo considerados HPIE positivos. DeHeer e Mc Manus (2005) tomaram como base a metodologia de Doucet e Viel (2002) para quantificação de hemossiderófagos e a aplicaram em lavados traqueais de felinos com doenças respiratórias.

44 3.MATERIAL E MÉTODO 3.1. ANIMAIS Foram utilizados 37 eqüinos adultos, mestiços de crioulo com PSI, de idade entre três a 22 anos, regularmente utilizados em jogos de pólo (Apêndice 1 e 2). Destes animais, 20 (14 fêmeas e seis machos) pertencentes ao Itanhangá Golf Clube, localizado no Rio de Janeiro, no bairro da Barra da Tijuca, e 17 (sete fêmeas e 10 machos) pertencentes ao Regimento de Cavalaria de Guardas Andrade Neves (RCGd/EB), localizado no bairro de Deodoro, Rio de Janeiro. Os animais pertencentes ao Itanhangá Golf Clube eram alimentados com ração comercial, aveia e volumoso (feno de alfafa). Já os animais do RCGd eram alimentados com ração comercial, feno de Coast Cross, e suplementados com sal mineral. Todos os animais foram mantidos em cocheiras e periodicamente vermifugados e vacinados contra tétano, influenza, encefalomielite leste, oeste e raiva. 3.2-EXAME FÍSICO Foram registrados os dados de identificação dos animais, a idade e o peso. Também foram anotadas a freqüência cardíaca (FC), freqüência respiratória (FR) e temperatura (T) segundo Mc Gorum et al. (2002) bem como informações colhidas à inspeção, palpação, percussão e ausculta do aparelho respiratório (Apêndice 3 ).

45 3.3-AVALIAÇÃO ENDOSCÓPICA Os animais foram submetidos à avaliação endoscópica do trato respiratório, entre 30 e 90 minutos após o término do tempo no qual jogou, segundo a metodologia preconizada por Pascoe et al. (1981) ( Apêndice 3). O exame foi realizado utilizando-se um Colonofibroscópio Olympus modelo CF 10L, acoplado a uma Microcâmera Karl Storz modelo Endovision XL 20280130 NTSC e uma Filmadora Digital Sony modelo DCR HC-65. Todas as endoscopias foram digitalizadas, armazenadas e analisadas posteriormente. Após contenção física (cachimbo e tronco de contenção), o endoscópio foi introduzido pelo meato ventral da narina direita ou esquerda, aleatoriamente. Foram analisadas as estruturas anatômicas desde os meatos nasais até à bifurcação brônquica (carina). Foram realizadas avaliações semi-quantitativas para a presença de sangue segundo Costa et al. (2004) e para a presença de muco, segundo Gerber et al. (2004), conforme descrito a seguir: Avaliação semi quantitativa para hemorragia segundo Costa et al. (2004). Grau 1 Traços de sangue na traquéia; Grau 2 Presença de filete de sangue na traquéia; Grau 3 Presença de sangue na traquéia em quantidade superior ao grau anterior; Grau 4 Presença abundante com acúmulo de sangue na traquéia; Grau 5 Hemorragia nasal ou presença de sangue abundante e acumulado na traquéia até a orofaringe; Avaliação semi quantitativa para presença de muco, segundo Gerber et al.(2004). Grau 0 - Nenhum muco aparente; Grau 1 - Pequenos e poucos pontos de secreção; Grau 2 - Um número maior de pontos maiores de muco podendo a vir a formar confluência; Grau 3 - Presença de confluência de secreção na face ventral do lúmen traqueal, podendo haver poças de secreção ao redor; Grau 4 - Presença de secreção traqueal ocupando menos que 25% do lumen traqueal Grau 5 - Presença de secreção traqueal profusa ocupando mais que 25% da extensão da traquéia.

46 3.4 HEMOGRAMA E DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO PLASMÁTICO: As amostras de sangue foram obtidas por venopunção jugular e coletadas em tubo contendo anticoagulante EDTA 10% sendo utilizadas para realização do hemograma, conforme descreve Jain (1993). As contagens de hemácias, leucócitos e plaquetas foram realizadas em aparelho semi automatizado Coulter T-890, sendo conferidas posteriormente pela observação do esfregaço sanguíneo. Esfregaços foram confeccionados e corados por Panótico Instantâneo para a realização da leucometria específica. A dosagem de fibrinogênio plasmático foi realizada pelo método de precipitação pelo calor (JAIN, 1993). 3.5 - CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE PARA A FORMAÇÃO DOS GRUPOS: Todos os animais apresentaram frequência cardíaca, respiratória, temperatura e resultados de hemograma e fibrinogênio plasmático dentro dos valores de referência segundo Cowell e Tyler (1992). Esses animais foram então divididos em dois grupos (1 e 2) segundo os resultados de ausculta e endoscopia conforme descrito a seguir: Grupo 1 Constituído por animais que apresentavam: - Ausculta pulmonar normal segundo McGorum et al. (2002), - Ausência de sangue na traquéia - Escore até 1 para a presença de muco na traquéia. Grupo 2: Constituído por animais que apresentavam um ou mais dos três itens abaixo: - Ausculta pulmonar com ruídos respiratórios anormais (creptações finas, grossas, sibilos, roncos isoladamente ou qualquer combinação desses) segundo McGorum et al. (2002) - Achados endoscópicos de hemorragia (escore de 1 a 5) - Escore de 2 a 5 para a presença de muco traqueal 3.6-OBTENÇÃO DO LAVADO TRAQUEAL: Para obtenção do lavado traqueal os animais foram colocados em brete e contidos com cachimbo. O endoscópio, contendo a sonda 1 (Figura 1) em seu canal de trabalho, foi introduzido pelo meato nasal ventral em direção a traquéia. A sonda foi posicionada na

47 traquéia em porção distal, anterior a carina, de acordo com técnica utilizada por Whitwell e Greet (1984). Para tal, 20 a 40mL de solução salina estéril foram instilados, por meio de seringas plásticas estéreis (Injex ) e imediatamente aspirados. As amostras foram consideradas adequadas quando era possível observar partículas suspensas ou filamentos de muco (Figura 2). O lavado obtido foi acondicionado em frascos cônicos graduados de 50mL, mantido sob refrigeração até o momento do processamento, tempo esse que não excedeu a 6 horas pós coleta. Figura 1 Sonda para coleta transendoscópica (MILA Delivery Catheter), utilizada para a obtenção do lavado traqueal dos animais de pólo. Rio de Janeiro, 2009. 1 MILA Delivery Catheter - 2.5mm x 190cm

48 Figura 2 - Lavado traqueal. Observa-se alteração de coloração e presença de grande quantidade de muco.rio de Janeiro, 2009. 3.7-PROCESSAMENTO E ANÁLISE DO LAVADO TRAQUEAL 3.7.1-Centrifugação do material e confecção de lâminas Alíquotas de 5mL de lavado foram submetidas a centrifugação a 110g por 5 minutos em centrífuga RDE modelo MC-16. O sobrenadante foi dispensado e o sedimento de células utilizado para confecção das lâminas. Utilizou-se a técnica de esfregaço linear, segundo Cowell e Tyler (1992). Nesta técnica, coloca-se uma gota da solução numa das extremidades da lâmina. Com o auxílio de uma lâmina extensora, desliza-se a gota sobre a lâmina, interrompendo o movimento no centro, buscando concentrar as células de forma linear. Foram confeccionadas pelo menos duas lâminas de cada animal e posteriormente fixadas em álcool metílico por 5 minutos. 3.7.2-Coloração do material Pelo menos uma lâmina de cada animal foi corada pelo Giemsa e utilizada para a contagem diferencial dos tipos celulares. A segunda lâmina foi corada pela técnica do Azul da Prússia, de acordo com metodologia descrita a seguir:

49 Após fixação em metanol por 10 minutos, as lâminas foram hidratadas em água corrente por 5 minutos. Após secagem, foram colocadas numa solução de partes iguais de ferrocianeto de potássio a 0,5% e ácido clorídrico a 10% por 1 hora. Decorrido este tempo, foram lavadas com água destilada, secadas novamente e contracoradas com vermelho rápido nuclear a 0,1% por 10 minutos. Essa coloração é utilizada para evidenciação de ferro citoplasmático sendo utilizada para a avaliação semiquantitativa de HPIE por meio do escore de hemossiderófagos (ETH), seguindo-se metodologia de Doucet e Viel (2002). 3.7.3-Avaliação citológica A contagem diferencial dos tipos celulares de cada animal foi realizada por meio da análise de 300 células em objetiva de 100 vezes e posteriormente calculada a média dos valores encontrados. Para a obtenção do escore de hemossiderófagos, foram observados 100 macrófagos em objetiva de imersão de 100 vezes. Cada macrófago foi classificado segundo a quantidade de hemossiderina contida, de acordo com metodologia de Doucet e Viel (2002) descrita abaixo. Após a contagem, a quantidade de macrófagos obtida em cada grau foi multiplicada pelo valor numérico (de 0 a 4) atribuído ao grau e posteriormente somada, obtendo-se então o ETH (escore total de hemossiderina). Sistema de graduação de hemossiderina em macrófagos segundo Doucet e Viel (2002) Grau 0 Ausência de coloração azulada no citoplasma Grau 1 Coloração discreta, azul clara no citoplasma Grau 2 Coloração azul escura em pequena parte da célula ou coloração de média intensidade em toda o citoplasma Grau 3 Coloração azul escura na maior parte do citoplasma Grau 4 Célula totalmente preenchida por hemossiderina, demonstrando coloração azul escura por todo o citoplasma.

50 3.8-INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Foram analisados os resultados individuais e calculados a média e desvio padrão da contagem diferencial para os diferentes tipos celulares presentes no lavado traqueal dos eqüinos dos dois grupos. Devido à diferença no número de animais entre os dois grupos, não foi possível realizar uma análise estatística comparativa entre eles. Os critérios utilizados como referência para a citologia traqueal foram os propostos por Robinson (2003) sendo considerados sadios os animais com percentual de contagem para neutrófilos, abaixo de 20% do total de células nucleadas e para eosinófilos, abaixo de 1%. Para a avaliação da HPIE, foi realizada uma avaliação qualitativa para presença de hemácias e eritrofagocitose. Para o escore de hemossiderina, foi considerado como ponto de corte para caracterização de HPIE, o escore acima de 75 preconizado por Doucet e Viel (2002) para lavados broncoalveolares.

51 4.RESULTADOS Os resultados da contagem diferencial para os tipos celulares presentes no lavado traqueal dos eqüinos dos Grupos 1 e 2 encontram-se respectivamente nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1 - Resultados individuais, média e desvio padrão da contagem diferencial (expressos em porcentagem) para os diferentes tipos celulares presentes no LT de eqüinos do grupo 1 (n=9). Rio de Janeiro, RJ. 2009. Animal Neutrófilo Linfócito Macrófago Eosinófilo Célula Epitelial 2 2,8 3,2 28,5 0,0 65,6 0,0 4 7,3 21,3 36,6 0,0 34,8 0,0 6 16,6 5,7 41,7 0,0 36,0 0,0 9* 30,0 4,0 57,7 0,0 8,3 0,0 21 2,0 7,3 32,4 0,0 58,3 0,0 25 1,0 1,2 6,0 0,0 92,0 0,0 31 5,6 7,0 13,6 0,0 71,6 0,0 34* 78,6 2,3 13,4 0,3 5,4 0,0 36 0,5 2,3 10,6 0,0 86,6 0,0 Média ± DP 16,0±25,3 6,0±6,1 26,7±17,2 0,0±0,1 51,0±31,7 0,0 * valores de neutrófilos acima dos limites de normalidade (Robinson, 2003). Mastócito

52 Figura 3 : Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 1 ( Animal 31). Presença de muco, predomínio de células epiteliais cilíndricas e macrófagos. Coloração Giemsa. Microscopia óptica, aumento 400X. Figura 4 : Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 1 (Animal 2). Presença de células epiteliais cilíndricas ciliadas e um eosinófilo. Coloração Giemsa. Microscopia óptica, aumento 1000X.

53 Tabela 2 - Resultados individuais, média e desvio padrão da contagem diferencial (expressos em porcentagem) para os diferentes tipos celulares presentes no LT de eqüinos do grupo 2 (n=28). Rio de Janeiro, RJ. 2009. Animal Neutrófilo Linfócito Macrófago Eosinófilo Célula Epitelial Mastócito 1 9,7 4,3 83,3 0,0 2,7 0,0 3 17,6 5,2 60,2 0,0 17,0 0,0 5 15,2 25,3 21,6 1,3 36,6 0,0 7 8,0 28,3 36,6 3,0 24,0 0,0 8* 87,3 7,0 5,6 0,0 0,0 0,0 10 5,0 2,6 27,8 0,0 64,6 0,0 11 17,6 10,0 67,6 0,0 4,6 0,0 12 2,0 12,0 14,5 0,0 71,5 0,0 13 18,3 6,4 54,6 0,4 20,3 0,0 14 16,3 3,3 72,0 0,0 8,4 0,0 15 5,6 5,6 67,5 0,0 21,3 0,0 16* 83,0 4,3 7,0 0,0 5,6 0,0 17* 31,6 7,3 21,0 0,6 39,3 0,0 18* 82,0 1,6 16,0 0,0 0,4 0,0 19 3,0 2,0 13,0 0,0 83,0 0,0 20 1,8 1,3 12,6 0,6 83,6 0,0 22 3,4 5,0 27,6 0,6 63,3 0,0 23 15,6 13,0 66,8 0,0 4,6 0,0 24* 78,3 3,0 17,0 0,0 1,7 0,0 26 1,0 3,3 15,7 0,0 79,0 0,0 27 4,0 2,0 13,4 0,0 80,6 0,0 28 10,0 10,3 37,0 0,6 42,1 0,0 29* 21,0 4,3 25,7 0,0 49,0 0,0 30* 28,0 5,4 59,0 0,0 7,6 0,0 32 13,0 16,6 51,8 0,0 18,6 0,0 33 1,6 3,4 26,0 0,6 68,4 0,0 35 0,3 0,4 21,3 2,6 73,6 0,0 37 2,0 10,0 65,3 0,4 22,3 0,0 Média ± DP 20,8±27,0 7,3±6,8 36,0±23,6 0,4±0,8 35,5±30,2 0,0 * Valores de neutrófilos acima dos limites de normalidade (Robinson, 2003). ** Valores de eosinófilos acima dos limites de normalidade (Robinson, 2003)

54 Considerando os valores propostos por Robinson (2003), a ocorrência de processo inflamatório pôde ser caracterizada pelo infiltrado de neutrófilos em 22,2% dos animais do Grupo 1 (Tabela 1). No grupo 2 a ocorrência do processo inflamatório foi observada em dez animais (27,0%), sendo que destes, sete apresentaram infiltrado de neutrófilos e três de eosinófilos (Tabela 2, Figuras 4 e 5). Figura 4: : Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 2 (Animal 16). Grande quantidade de muco, presença de macrófago e de infiltrado neutrofílico Coloração Giemsa. Microscopia óptica, aumento 1000X. Figura 5: Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 2 (Animal 7) Eosinófilos contendo grânulos característicos bem definidos. Coloração Giemsa. Microscopia óptica, aumento 1000X.

55 A seguir, estão apresentados os resultados referentes à avaliação citológica para hemorragia pulmonar induzida pelo exercício. Tabela 3 Avaliação qualitativa para presença de hemácias e semi quantitativa para o conteúdo de hemossiderina em macrófagos (escore total de hemossiderina, ETH) encontrados no LT de eqüinos do Grupo 1 (n=9). Rio de Janeiro, RJ. 2009 Animal Hemácias ETH 2 Ausente 7 4 Presente 16 6 Presente 31,1 9 Ausente 21 21 Ausente 6 25 Presente 42 31 Ausente 27 34 Ausente 31 36 Presente 7

56 Tabela 4 Avaliação qualitativa para presença de hemácias e semi quantitativa para o conteúdo de hemossiderina em macrófagos (escore total de hemossiderina, ETH) encontrados no LT de eqüinos do Grupo 2 (n=28). Rio de Janeiro, RJ. 2009 Animal Hemácias ETH 1 Ausente 26,6 3* Presente 203,5 5 Presente 21,0 7* Presente 204,0 8 Ausente 32,0 10 Presente 42,5 11 Ausente 23,0 12 Ausente 40,0 13* Ausente 79,0 14 Ausente 34,0 15* Presente 84,0 16 Presente 59,0 17 Presente 64,0 18 Ausente 16,0 19* Ausente 151,0 20 Ausente 65,7 22 Presente 16,0 23 Presente 27,0 24 Presente 17,0 26 Presente 42,0 27 Presente 31,0 28 Presente 7,0 29 Presente 28,0 30 Presente 17,0 32 Ausente 9,0 33 Presente 11,0 35* Presente 104,0 37 Presente 40,0 * Valores de escore compatíveis com HPIE segundo Doucet e Viel (2002).

57 A presença de hemácias foi observada em quatro animais do Grupo 1 (44,4%) e 18 animais do Grupo 2 (66,6%). Quanto a ocorrência de eritrofagocitose esta foi observada em somente no animal 6 do Grupo 1, representando 11,1% e no animal 29 do Grupo 2, correspondendo a 2,7%. Considerando o valor de escore para o conteúdo de hemossiderina em macrófagos (escore total de hemossiderina, ETH) proposto por Doucet e Viel (2002), a ocorrência de HPIE não foi observada em nenhum animal do Grupo 1 e pôde ser caracterizada em 22,2% dos animais do Grupo 2 (Tabela 4,Figura 6 ). Figura 6 - Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 2 (Animal 7). Presença de numerosos macrófagos em diferentes graus de conteúdo de hemossiderina. Coloração Azul da Prússia. Microscopia óptica, aumento 1000X.

58 5.DISCUSSÃO: Os valores médios encontrados na contagem diferencial dos tipos celulares presentes no LT de eqüinos do Grupo 1, estão dentro dos valores estabelecidos por Robinson, (2003) para animais considerados sadios. Com relação à contagem de neutrófilos do grupo 1, estes valores foram semelhantes aos encontrados por Michelloto et al. (2007) que obtiveram 23,1 ±35,93% em animais sadios e inferiores aos observados por Larson e Busch (1985) que obtiveram 39,0±21% e Derksen et al. (1989) que obtiveram 32,0±8,9%. Mair (1987) obteve uma percentagem média (4,6±4,9) abaixo da observada nesse estudo, assim como Fernandes et al. (2000) que encontraram valores médios para neutrófilos de 8,92±7,41%, porém utilizaram a coleta por via transtraqueal. Essa grande variação dentre os números de neutrófilos, mesmo em animais considerados sadios, é sabidamente uma das desvantagens da metodologia de lavado traqueal. Corroborando estas informações, Dixon (1995) afirma que os valores de contagem diferencial na secreção traqueal dos eqüinos ainda não estão bem definidos, particularmente quanto aos limites superiores do número de neutrófilos. Taxas de mais de 40% são relatados em secreções respiratórias de animais aparentemente sadios mantidos estabulados. Conseqüentemente, a interpretação da citologia que contém de 15 a 40% de neutrófilos permanece problemática, embora a presença de mais de 40% de neutrófilos seja compatível com inflamação pulmonar. Por outro lado, Sweeney et al. (1992), em estudo com uma população jovem, homogênea (cavalos de corrida) e clinicamente normal, observaram que cerca de 80% dos animais apresentaram valores de neutrófilos abaixo de 20%. Concordamos com Hodgson e Hodgson (2003) quando constatam a dificuldade em associar o aumento no percentual de células a uma patologia pulmonar. Apesar da média do Grupo 1 estar dentro dos valores estabelecidos para animais sadios, em dois (nove e 34) foi encontrado uma alta porcentagem de neutrófilos. O animal