Regulação e Diferenciação 2010/2011 Objectivos gerais da disciplina O programa da disciplina de Regulação e Diferenciação engloba dois temas gerais: os principais pontos de controlo e mecanismos operam na regulação do ciclo celular e as bases moleculares da diferenciação celular. O principal objectivo desta disciplina é o de contribuir para o desenvolvimento de uma visão global e integrada, mas simultaneamente aprofundada, de mecanismos moleculares que regulam o ciclo celular e a diferenciação celular em determinados processos biológicos. Esta disciplina também pretende fomentar nos alunos a pesquisa científica e desenvolver um elevado espírito crítico, sendo pontualmente desenvolvidos ou redefinidos alguns conceitos, dogmas e paradigmas, aprendidos anteriormente, perspectivando os conhecimentos de regulação da expressão génica, como o factor indutor da diferenciação celular. Considerando a importância da correlação entre a experimentação e os conceitos teóricos, sempre que possível serão discutidas estratégias experimentais relevantes e apresentados métodos alternativos ou tecnologias recentes, utilizadas no estudo da expressão génica. Pré-requisitos Os alunos que vão frequentar a disciplina de Regulação e Diferenciação, já deverão ter adquirido os conhecimentos moleculares e celulares básicos, em disciplinas de carácter mais fundamental como, Bioquímica, Biologia Celular, Genética e Biologia Molecular, Engenharia Genética, Genética de Procariotas e Genética de Eucariotas, ou disciplinas conteúdos programáticos similares. Assim, para além de todos os conceitos relativos à expressão génica, tópicos como os da divisão celular, células estaminais, diferenciação e desenvolvimento, comunicação celular, vias de transdução de sinal, adesão intercelular e reprogramação molecular, abordados nestas e noutras disciplinas, serão aqui desenvolvidos numa óptica integrativa, em articulação com processos biológicos específicos de regulação génica e celular, estabelecendo comparações, tanto quanto possível, entre bactérias e organismos mais complexos. Programa Teórico 1. Regulação do ciclo celular 1.1 Os acontecimentos do ciclo celular eucariótico. Variações na estrutura do ciclo em diferentes tipos celulares. Principais pontos de controlo. Descoberta das ciclinas, MPF e SPF. Análise genética em leveduras e identificação de mutantes CDC. Estrutura do MPF. CDC14, Wee1, CAK e lógica da regulação da entrada em mitose. Regulação por fosforlação/desfosforilação. Diferentes complexos CDK promovem as transições G1/S
e G2/M. CDKs e ciclinas: estrutura e função. Mecanismos de activação das CDKs pelas CAKs. Regulação das CDKs por fosforilação/desfosforilação e proteólise das ciclinas. Via da ubiquitina e saída de mitose. APC/C. Regulação das CDKs por CKIs, Cks1 e Ringo/Speedy. Activação mitogénica e complexos CDKs activos em cada transição do ciclo. Sinalização mitogénica pela via Ras. Sinalização mitogénica pela via das cinases PI3. Regulação da ultrapassagem do ponto de controlo G1/S. SPF e progressão na fase-s. Factores de licenciamento da replicação. Irreversibilidade e proteólise (SCF e APC/C). Entrada e saída de mitose. Transição metafase-anafase. CDC20, Cdh1 e activação do APC/C. Principais pontos de regulação do ciclo celular. Conceito de checkpoint. Importância da regulação negativa. Tensão e efeitos bioquímicos. Regulação da organização do fuso mitótico. Mutantes Bub e Mad. Componentes do SAC. Tensão, ocupação dos microtúbulos e silenciamento do checkpoint. SAC e rearranjo dos complexos Mad2. Complexo MCC. Activação e silenciamento do SAC. Papel da cinase aurora-b na correcção de interacções erradas entre os microtúbulos do cinetocoro e cada pólo. Relações epistáticas dos componentes do SAC. Shugoshin, PP2A e coesão centromérica. 1.2 Desregulação do ciclo celular e cancro. Proto-oncogenes e genes supressores de tumores. Checkpoints que operam em G1, S e G2/M. Checkpoints de verificação de danos no DNA. Regulação da p53. Integração da sinalização ATR/ATM com a CDC25 e as CDKs. Regulação da dinâmica microtubular, MTOCs e cancro. 2. Bases moleculares da diferenciação celular 2.1 Os conceitos de Regulação e de Diferenciação. O início da diferenciação celular. Diferenciação e especialização celular. Noção de compromisso e de diferenciação. Factores moleculares intrínsecos e extrínsecos associados à diferenciação celular. Diferenciação celular na evolução dos organismos multicelulares. A conservação dos processos moleculares de diferenciação celular na origem da adaptação e diversidade. O conceito de evolvabilidade, e as propriedades dos processo s reguladores e de desenvolvimento conservados. A teoria da variação facilitada. 2.2 Diferenciação das células estaminais, como modelo de estudo das etapas mais precoces da indução e especialização das células. Origem e evolução do termo célula estaminal. Conceito de célula estaminal. Classificação das células estaminais de acordo com o seu potencial de desenvolvimento. Origem das células estaminais embrionárias. Células estaminais adultas. Potencial de diferenciação, irreversibilidade e plasticidade da diferenciação. Conceitos de desdiferenciação e transdiferenciação. Análise molecular da pluripotência e determinação da pluripotência das células estaminais embrionárias. Factores envolvidos na manutenção do estado indiferenciado e na estimulação da diferenciação das células estaminais. Regulação epigenética das células estaminais embrionárias: propriedades gerais da cromatina e assinaturas epigénicas da cromatina; proteínas envolvidas na marcação de histonas. Manutenção do estado de indiferenciação
e diferenciação in vitro das células estaminais embrionárias. Investigação em células estaminais. Técnicas de reprogramação nuclear; células pluripotentes induzidas (ips). 2.3 Divisão celular simétrica vs. assimétrica na auto-renovação das células e na geração da diferenciação e diversidade celular. Factores que conduzem à assimetria da divisão celular. Consequências da assimetria da divisão celular na expressão génica. Mecanismos moleculares da divisão simétrica e assimétrica em diferentes modelos de diferenciação: zigoto de Caenorhabditis. elegans, neuroblastos de Drosophila e células estaminais da pele dos mamíferos. 2.4 A hematopoiese como paradigma do estudo da diferenciação das células estaminais dos mamíferos. 2.4.1 Diversificação de linhagens e mapas de linhagens. Características biológicas dos progenitores hematopoiéticos nos pontos de ramificação. Vias moleculares de regulação da auto-renovação, diferenciação e maturação das células do sangue. A opção de diferenciação: concentração e timing da expressão de factores transcricionais. Regulação homeostática e papel dos microambientes hematopoiéticos na função das células estaminais hematopoiéticas (HSC, hematopoietic stem cells). Destino das HSC na medula óssea. Moléculas que medeiam a sinalização e as interacções de adesão entre as HSC e os seus nichos. Estudos da divisão celular simétrica vs. assimétrica na auto-renovação e diferenciação das HSC. 2.4.2 A hematopoiese durante o desenvolvimento embrionário de ratinho e humano. Fases da hematopoiese: hematopoiese primitiva e definit iva. Padrões de expressão génica durante a hematopoiese. Controlo espacial e temporal da expressão génica durante a diferenciação das células hematopoiéticas. Locais de hematopoiese. Formação das células do sangue: uma origem comum ou duas fontes separadas, YS vs. AGM. Da formação da mesoderme à diferenciação ou especificação do primeiro precursor hematopoiético o hemangioblasto: ponto de divergência entre as linhas endotelial e hematopoiética durante a embriogénese. Controvérsia sobre a evidência do hemangioblasto. 2.4.3 A eritropoiese e a expressão diferencial dos genes das hemoglobinas durante o desenvolvimento dos mamíferos. Estrutura, função e tipos de hemoglobinas. A família multigénica das hemoglobinas: os agrupamentos e dos genes globínicos. Os diferentes mecanismos de regulação da expressão diferencial dos genes globínicos. O papel das regiões reguladoras proximais e da região distal LCR (locus control region) do locus. Factores de transcrição e a activação de domínios da cromatina; o papel do factor de transcrição GATA1; etapas moleculares na activação dos domínios da cromatina durante a diferenciação hematopoiética. Mecanismo multistep na activação da transcrição do locus. 3. Bases moleculares da adaptação a novos nichos bióticos e abióticos. 3.1 Factores e agentes determinantes nas alterações da expressão génica e modificações do genoma.
3.2 Adaptação bacteriana mediada pelo mecanismo regulador intrínseco, o locus mar. Componentes do locus mar de Escherichia coli. Os reguladores da transcrição, MarR e MarA. A transcrição do locus mar. Os circuitos reguladores MarA, e seus homólogos SoxS e Rob. A marbox. Mecanismos de regulação transcricional por MarA. Identificação e regulação diferencial dos componentes do regulão mar. Fenótipos e mecanismos de resistência mediados pelo operão mar. Importância clínica dos sistemas tipo-mar; desenvolvimento de terapias através do controlo da expressão do operão mar. 2.1 Patogenicidade microbiana como modelo de diferenciação. Diversidade de mecanismos moleculares de diferenciação durante o processo infeccioso. Mecanismos genéticos na origem da patogenicidade e responsáveis pelo aumento e diversidade de processos patogénicos. Variação de fase e variação antigénica. Ilhas de patogenicidade (PAI): evolução, transferência, local de integração e estrutura das PAI; bactérias patogénicas sem PAI. Etapas do processo infeccioso. Mecanismos de patogenicidade. Tipos de factores de virulência e o seu modo de acção. Regulação dos factores de virulência. Interacção dos agentes patogénicos com o sistema imunitário do hospedeiro e mecanismos de escape à resposta imune. 2.4.1 Modelo de estudo: Helicobacter pylori A infecção por H. pylori na origem de diferentes patologias gástricas. Mecanismos de sobrevivência e factores importantes de adaptação a um nic ho específico. O dinamismo e plasticidade do genoma de H. pylori. Estratégias e aproximações experimentais utilizadas na identificação de genes importantes no processo infeccioso. O papel dos polimorfismos na resposta imune e prognóstico da infecção. Os principais factores de virulência: factores de adesão, e as toxinas VacA e CagA. A multifuncionalidade da citotoxina VacA. A resposta imune do hospedeiro: os mecanismos de evasão da bactéria ao sistema imunitário e de persistência da infecção. 2.4.2 Modelo de estudo: Plasmodium falciparum Ciclo de vida de P. falciparum. Variação antigénica do factor de virulência PfEMP1. Estrutura, organização e origem da família multigénica var. Expressão mutuamente exclusiva dos genes da famíla var. Controlo epigenético da variação antigénica: modificações das histonas, RNA não-codificante de intrões envolvidos no silenciamento dos genes var, e silenciamento de promotores var. Localização perinuclear e activação dos genes var. O início do desenvolvimento sexual em P. berghei: mecanismos de regulação génica pós-transcricional que medeiam o silenciamento traducional nos gametócitos e o papel dos P-bodies. 2.4.3 Modelo de estudo: Chlamydiales Taxonomia. Chlamydiales ambientais e Chlamydiales patogénicas. Doenças humanas associadas a infecção por Chlamydia trachomatis e Chlamydophila pneumoniae. Ciclo bifásico de desenvolvimento de bactérias Chlamydiales. Corpos elementares e corpos reticulados. A inclusão, um vacúolo membranar. Diferentes etapas do ciclo infeccioso. Transcritoma das Chlamydiales ao longo do ciclo infeccioso. Mecanismos moleculares que determinam a interconversão de corpos elementares e corpos reticulados: o papel das proteínas de tipo histona, HctA e HctB, e de um snrna. Mecanismos moleculares e celulares da interacção das Chlamydiae com as células do hospedeiro durante o ciclo
infeccioso: funções do sistema de secreção de tipo III; funções de algumas proteínas efectoras a proteína TARP e a proteína IncA. Programa Prático O papel da sinalização Notch na diferenciação das células estaminais hematopoiéticas. Programa Teórico-Prático Métodos de análise do ciclo celular. Métodos de indução dos pontos de controlo do ciclo celular. Métodos de sincronização de células de mamífero e de levedura. Métodos de detecção de células em fases específicas do ciclo celular. Métodos de detecção de actividades cinásicas e fosfatásicas. Métodos de mapeamento das origens de replicação. Métodos de DNA combing. Drosophila como organismo-modelo em genética, no estudo do desenvolvimento e do ciclo celular. Técnicas de análise genética. Cromossomas balanceadores. Cruzamentos genéticos. Uso de transposões e transgénese. Transformação de células da linha germinal mediada por elementos-p. Mapeamento das inserções transgénicas. Isolamento de sequências genómicas adjacentes ao local de inserção por recuperação do plasmídeo. Armadilhas para enhancers (enhancer trapping) e padrões de expressão. Sistema Gal4-UAS para expressão dirigida e sobreexpressão. Análise de mosaicos mitóticos produzidos pelo sistema FLP-FRT. Uso da técnica de esterilidade feminina dominante para obtenção de clones homozigóticos da linha germinal e rastreio de efeitos maternos. Programa Prático Observação de Drosophila e técnicas básicas de utilização. Exemplos de cromossomas balanceadores, marcas fenotípicas e simbologia genética em Drosophila. Elaboração de um esquema de cruzamentos para mapear grosseiramente uma nova mutação letal no cromossoma 3 por recombinação meiótica com um stock multimarcado. Observação de cromossomas politénicos das glândulas salivares larvares. Formato da disciplina Duração semestral: 15 semanas ECTS Aula teóricas 2h x 15 sem 4 Aulas práticas 3h x 7 sem 1 Aulas teórico-práticas 3h x 7 sem 1 Total 6
Bibliografia Geral - Artigos de Revisão e Específicos - Livros de texto exclusivamente de apoio: Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2008). Molecular Biology of the Cell. 5 th ed. Garland Science, New York Gilbert, Scott F. (2006). Developmental Biology. 8 th ed Sunderland (MA), Sinauer Associates, Inc Lengeler, J. W., Drews, G., Schlegel, H. G (1999). Biology of Prokaryotes. Blackwell Science. Thieme Stuttgart, NY Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C., Krieger, M., Scott, M., Zipursky, S. L., Darnell, J. (2005). Molecular Cell Biology. 5 th ed. Freeman, New York Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J. (2003). Brock Biology of Microorganisms. 10 th Prentice Hall Pearson Education, NJ ed. Strachan, T., Read, A. P. (2004). Human Molecular Genetics. 3 rd Francis Group, London ed. Garland Science, Taylor and Avaliação A avaliação constará de um teste teórico e teórico-prático a meio do semestre, e de um exame final (1ª época) com consulta e que incluirá toda a matéria teórica, teórico-prática e questões sobre o trabalho experimental realizado. Os alunos que tiverem realizado o teste intercalar só respondem à 2ª metade da matéria. A 2ª época consta de um exame final com consulta abrangendo toda a matéria. Os alunos com nota final inferior a 9,5 valores serão reprovados, podendo repetir o teste na 2ª época de avaliação. Os alunos com nota igual ou superior a 9,5 valores obtêm aprovação. Os alunos podem fazer melhoria na 2ª época de avaliação, ou no ano lectivo seguinte. Não há provas orais.