Integração do Metabolismo

BLOCO IV Integração do Metabolismo Wagner Seixas da Silva Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica Bloco E- Sala 038

Calendário do Bloco IV 25/05-8:30h Gliconeogênese - Roteiro de discussão 1 (questões 1 a 9) 30/05-8:30h Mini-Teste (1,0 Ponto) 10:30h Módulo 1 - Constructore Livre 31/05 - Módulo 1 - Constructore Livre 01/06-8:30h Regulação da Gliconeogênese - Roteiro de discussão 1 (questões 10 a 13) 10:30h Mini-Teste Regulação da Gliconeogênese (1,0 Ponto) 06/06-8:30h Apresentações do Módulo 1 - (1,5 Ponto) 10:30h Via das pentoses - Roteiro de discussão 2 07/06-9:00h Dr. Roberto Bueno Paiva Bioquímica e Clínica Médica 08/06-8:30h Mini-teste Via das Pentoses (1,0 Ponto) 10:30h - Módulo 2- Constructore Livre 13/06-8:30h - Insulina - Roteiro de discussão 3 10:30h - Mini-Teste Insulina e Diabetes (1,0 Ponto) 14/06 - Módulo 2- Constructore Livre 15/06-8:30h Apresentações do Módulo 2 - (1,5 Ponto) 10:30h - Módulo 3 - Estudo dirigido - Diabetes e Inflamação (1,0 Ponto) 20/06-8:30h Glicocorticóides - Roteiro de discussão 4 10:30h Mini-Teste (1,0 ponto) 21/06-8:30h Outros Hormônios (Leptina, grelina, neuropeptídeo Y, triiodotironina) 10:30h - Módulo 4 - Estudo Dirigido- Outros Hormônios (1,0 ponto) Cálculo da Média do Bloco IV Total de pontos das apresentações/mini-testes/estudos Dirigido (TPAC): 10,0 Pontos

Gliconeogênese Síntese nova glicose

Roteiro 1 1) Com base no dados da tabela abaixo, construa um gráfico que relacione o tempo em jejum (em dias, no eixo x) com as concentrações plasmáticas de glicose (em mm, no eixo y) (tabela 1). Agora, construa um novo gráfico com os valores de concentração plasmática de glicose após administração deste nutriente (teste de tolerância à glicose) em um indivíduo normal ou com diabetes. Tabela 1: Concentração de glicose no paciente Dias em jejum -0,3 0 3 10 17 24 31 35 Glicose* 4,95 4,79 3,63 3,70 3,76 3,76 3,78 3,70 Tabela 2: Concentração de glicose nos pacientes Níveis Séricos de Glicose (mg/dl) Valores após a injeção intraperitoneal de 25 g minutos 0 a 10 20 30 40 50 60 Paciente 1 65.9 199.8 163.7 139 120 105.4 92.7 Paciente 2 168.8 340 330 328 320 317 310 a O tempo zero representa a glicemia após 12 horas de jejum.

Perfil da Glicemia durante o Jejum 5.25 4.50 GLICOSE (mm) 3.75 3.00 2.25 1.50 0.75 0.00 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Dias de jejum

Teste de Tolerância a Glicose Nível Sérico de Glicose (mg/dl) 400 350 300 250 200 150 100 50 Paciente 1 Paciente 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Minutos

Em humanos... NUTRIENTE Triacilglicerídeos (tecido adiposo) Glicogênio (fígado) Glicogênio (músculo) Glicose (sangue e outros líquidos corporais) Proteína corporal (músculo, principalmente) QUANTIDADE (g) 9.000 90 250 20 8.000 principal reserva Por que precisamos sintetizar glicose?

Células dependentes de glicose como nutriente glicose lactato ADP ATP CÉLULAS ANAERÓBICAS hemácias células do cristalino algumas células da retina células da medula renal glicose CO 2 ADP ATP CÉLULAS COM ISOLAMENTO SELETIVO DA CIRCULAÇÃO SISTÊMICA células do cérebro (BHE) células embrionários (BP)

Exemplificando com uma situação extrema... 1960-1970: tratamento da obesidade com jejum prolongado assistido

2) Em torno de 1930, Carl Ferdinand Corie GertyThereza Coridemonstraram que é possível sintetizar glicose (e glicogênio) a partir de lactato. Quais poderiam ser as etapas envolvidas nesta via? Alguma via já estudada por você poderia estar envolvida? Lembre-se de que algumas reações podem ser reversíveis dependendo das condições celulares. Haveria necessidade de vias alternativas? Justifique sua resposta. Piruvato NADH Lactato NAD + Glicose (Glicogênio)

Histórico... Claude Bernard: o fígado é capaz de fornecer glicose à circulação Glicogênio hepático glicose Glicogênio muscular lactato Lactato pode ser convertido em glicogênio no fígado? Gerty Theresa Cori Carl Ferdinand Cori Journal of Biological Chemistry, 1929 (Laureados com Prêmio Nobel em 1947)

hexocinase G o = -8.0 kcal/mol fosfo-hexose isomerase G o = -0.6 kcal/mol fosfofrutocinase G o = -5.3 kcal/mol aldolase G o = -0.3 kcal/mol triose-fosfato isomerase G o = +0.6 kcal/mol gliceraldeído3p desidrogenase G o = -0.4 kcal/mol fosfogliceratocinase G o = +0.3 kcal/mol ATP ADP ATP ADP Pi glicose glicose-6-fosfato frutose-6-fosfato frutose-1,6-bisfosfato gliceraldeído-3-fosfato NAD+ NADH 1,3-bisfosfogliceratoato ADP ATP 3-fosfogliceratoato fosfoglicerato mutase G o = +0.2 kcal/mol 2-fosfogliceratoato enolase G o = -0.8 kcal/mol piruvatocinase G o = -4.0 kcal/mol fosfoenolpiruvato ADP ATP piruvato

Perfil energético das reações da GLICÓLISE glicose Etapas 1, 3 e 10 são contornadas na via de Gliconeogênese 1 kj = 0,24 kcal piruvato

3) Fracionando-se o tecido hepático e incubando-se separadamente as frações subcelulares isoladas (mitocôndria, retículo endoplasmático, membrana plasmática, citoplasma e núcleo, etc) na presença (14C) lactato, não se verificou incorporação significativa de 14C em glicose em nenhuma das frações isoladas. Que hipótese isto lhe sugere e que experiência você propõe para comprová-la? Gliconeogênese Mitocôndria, Retículo, Citosol

4) A Gliconeogênese foi definida como síntese líquida de glicose a partir de precursores de origem não glicídica. Baseado nos conhecimentos por você adquiridos, quais precursores poderiam ser indicados? Que reações e quais intermediários vocês esperariam que estivessem envolvidos? Justifique.

TAG Glicerol + Àc. Graxos GLICOSE Glicose Piruvato Lactato Glicogênio Proteínas aas

TAG Glicerol + Àc. Graxos Glicose Piruvato Lactato Glicerol Glicerol-3P DHAP?? Glicose NAD + NADH G3P 1,3 BPG NAD + NADH LDH Lactato Piruvato PEPCK PEP PC Piruvato Acetil-CoA NADH NAD + Oxaloacetato MDH PEP PEPCK Oxaloacetato Malato Citrato Isocitrato aas Malato Fumarato CO 2 α-cetoglutarato Succinil-CoA CO 2 Proteínas aas

Lactato desidrogenase (LDH) reação reversível em condições fisiológicas enzima tetramérica dois tipos de subunidades: M (músculo esquelético), H (coração) M 4 (músculo esquelético) M 3 H 1 M 2 H 2 M 1 H 3 H 4 (coração) diferentes valores de Km para os substratos lactato e piruvato

Glicerol Glicerol-3P DHAP?? Glicose NAD + G3P NAD + LDH Lactato NADH 1,3 BPG NADH Piruvato PEPCK PEP PC Piruvato Acetil-CoA NADH NAD + Oxaloacetato MDH Malato PEP PEPCK Oxaloacetato Malato Fumarato Citrato Isocitrato CO 2 α-cetoglutarato aas Succinil-CoA CO 2

Reações para conversão de piruvato a fosfoenolpiruvato (PEP) (para reversão da reação da piruvato cinase)

5) O consumo de álcool, especialmente por um indivíduo mal alimentado, pode causar hipoglicemia. O álcool ingerido é convertido a acetaldeído no citoplasma do hepatócito, em reação catalisada pela enzima álcool desidrogenase: CH3-CH2-OH + NAD + CH3-COH + NADH.H + Utilizando seus conhecimentos sobre a gliconeogênese, tente justificar a hipoglicemia causada pela ingestão de álcool.

Glicose?? NAD + G3P NAD + Lactato NADH 1,3 BPG NADH LDH Piruvato PEP PEPCK Piruvato PC Oxaloacetato PEPCK Oxaloacetato NADH PEP NAD + MDH MDH NAD + Malato Malato NADH

6) Foi verificado na década de 20 que animais alimentados com dieta hipercalórica, exclusivamente composta por lipídeos, apresentavam uma baixa glicemia e eram incapazes de repor suas reservas de glicogênio hepático. Isso aconteceu apesar de apresentarem uma alta concentração de ácidos graxos livres e de corpos cetônicos circulantes no plasma. Tente justificar por que estes metabólitos não poderiam ser usados para síntese de glicose e para reposição de glicogênio hepático.

Acil CoA 2C

7) Em 1930, Weil-Marlherbe e colaboradores observaram, provocando um certo escândalo no meio científico, que a adição de acetoacetato (precursor de Acetil-CoA) provocava um aumento na formação de glicose em fatias de rim de rato quando incubadas na presença de lactato. Quais são as maneiras possíveis de uma substância estimular uma reação? Agora discuta a sua resposta com base nos resultados encontrados por Weil-Marlherbe.

Acetoacetato 2C

Requerimento diário de glicose: 120 g lactato glicerol aminoácidos 40 g 20 g 60 g glicerol-p F1,6BP DHAP G3P 1,3BPG G3PDH lactato piruvato ácido graxo de cadeia ímpar acil-coa de cadeia ímpar PEP PEPCK oxaloacetato MDH PEP PEPCK MDH piruvato oxaloacetato PIRUVATO CARBOXILASE acetil-coa propionil-coa aas malato malato α-cetoglutarato fumarato succinato succinil-coa

8) Até agora o seu grupo já deve ter analisado o envolvimento do oxaloacetato e dos diversos intermediários do ciclo de Krebs na síntese de glicose pela via glicogênica. Por outro lado, a partir de (3H) PEP é possível obter (3H) glicose com os mesmos intermediários da via glicolítica que você já conhece e através da localização citosólica. Quais seriam os eventos que você procuraria descobrir para estabelecer um elo entre esse conjunto de fatos e desta forma apresentar e discutir as diferentes etapas da gliconeogênese?

hexocinase G o = -8.0 kcal/mol fosfo-hexose isomerase G o = -0.6 kcal/mol fosfofrutoocinase G o = -5.3 kcal/mol aldolase G o = -0.3 kcal/mol triose-fosfato isomerase G o = +0.6 kcal/mol gliceraldeído3p desidrogenase G o = -0.4 kcal/mol fosfogliceratocinase G o = +0.3 kcal/mol ATP ADP ATP ADP Pi glicose glicose-6-fosfato frutose-6-fosfato frutose-1,6-bisfosfato gliceraldeído-3-fosfato NAD+ NADH 1,3-bisfosfogliceratoato ADP ATP 3-fosfogliceratoato fosfoglicerato mutase G o = +0.2 kcal/mol 2-fosfogliceratoato enolase G o = -0.8 kcal/mol piruvatocinase G o = -4.0 kcal/mol fosfoenolpiruvato ADP ATP piruvato

Reação para conversão de frutose-1,6-bisfosfato a frutose-6-p (para reversão da reação da fosfofrutocinase) Pi frutose-1,6-bisfosfatase frutose-1,6-bisfosfato frutose-6-p

Reação para conversão de glicose-6-p a glicose (para reversão da reação da hexocinase) Pi glicose-6-fosfatase glicose-6-p glicose expressa somente no fígado e no cortex renal

glicerol-p DHAP F1,6BP F6P G6P glicose F1,6BPase G6Pase lactato 1,3BPG G3P G3PDH piruvato PEP PEPCK oxaloacetato PEP PEPCK piruvato oxaloacetato PIRUVATO CARBOXILASE aas MDH MDH malato malato α-cetoglutarato fumarato succinato succinil-coa

9) Discuta o significado da regulação alostérica da piruvato carboxilase, da piruvato desidrogenase, da citrato sintase, da acetil-coa carboxilase e da carnitina aciltransferase 1: a) Quando a gliconeogênese estiver inibida e com a esterificação de triacilgliceróis predominando amplamente sobre a lipólise. b) Quando a gliconeogênese estiver estimulada assim como a lipólise. Discuta o que ocorreria com a síntese de ATP na mitocôndria nos dois casos acima.

Glicose TAGS Ác. Graxos Glicólise PEP Piruvato Síntese de Ác. Graxos Malonil CoA + Citrato Acetil CoA Carboxilase Acetil CoA Oxaloacetato Piruvato + - PC PDH Acetil-CoA Citrato (6C) β-oxidação - CPT Malato Oxaloacetato (4C) - Malato (4C) - - NADH

Glicólise Glicose PEP Piruvato Lactato, Glicerol, Ác. Graxos, AAs TAGS Ác. Graxos Malonil CoA - Citrato Acetil CoA Carboxilase Acetil CoA Oxaloacetato Piruvato + PC - PDH Acetil-CoA Citrato (6C) β-oxidação + CPT Malato Oxaloacetato (4C) Malato (4C)

10) Em 1980, Van Schaftingen e colaboradores descobriram uma substância capaz de modificar a atividade da fosfofrutoquinase isolada de fígado, como mostra a figura abaixo: Essa substância é formada no fígado podendo atingir 20 µm em ratos bem alimentados e destruída após tratamento com glucagon. Observou-se que esta mesma substância era capaz de inibir a frutose 1,6 bisfosfatase com um Ki = 0.5 µm, que uma concentração próxima daquela necessária para a metade da ativação máxima da fosfofrutoquinase. Analise estes dados e procure integrá-los a um esquema metabólico mais geral.

11) Estes mesmos autores descobriram em 1981 uma enzima capaz de sintetizar frutose - 2,6 BP a partir de frutose-6p as custas de ATP a semelhanca do que ocorria com a fosfofrutoquinase anteriormente conhecida. Para evitar confusão foram denominadas de fosfofrutoquinase-1 (PFK-1), a clássica, e fosfofrutoquinase-2 (PFK-2) a que sintetiza frutose 2,6-bisfosfato. Além disso, o mesmo grupo de trabalho em 1982 purificou de fígado de rato, uma enzima capaz de transformar frutose 2,6-bisfosfato em frutose-6p. Observaram ainda que uma fosforilação desta enzima pela proteína quinase AMPc dependente (PKA) provocava um grande aumento em sua atividade. A PFK-2 também é substrato para PKA, sendo o resultado da fosforilação um acentuado decréscimo de sua atividade. Por muitos anos tentou-se isolar as duas enzimas, mas finalmente se descobriu que se tratava de uma única cadeia polipeptídica capaz de catalisar uma ou outra reação dependendo do seu estado de fosforilação. Com estes novos dados, procure analisar o quadro metabólico quando a gliconeogênese encontra-se ativada ou inibida levando em consideração todas as informações fornecidas. PFK 1 F6P + ATP F1,6BP + ADP F1,6BPase F1,6P F6P + Pi PFK 2 F6P + ATP F2,6BP + ADP F2,6BPase F2,6P F6P + Pi

Hepatócito: [Glicose] Glucagon camp PKA P PFK-2 + FBPase-2 P X Frutose 6P Frutose 2,6BP PFK-1 + FBPase-1 Glicólise Gliconeogênese

12) A adrenalina age no músculo e no fígado através de sua ligação a receptores β- adrenérgicos o que resulta na ativação da proteína quinase A (PKA). Nos dois tecidos a PKA catalisa a fosforilação da PFK-2. Entretanto os efeitos sobre a glicólise em cada um dos tecidos são opostos: no fígado esta via é inibida enquanto no músculo esta via é ativada. Tente sugerir uma explicação para estes achados.

Glucagon ou Adrenalina Hepatócito: camp PKA P PFK-2 + FBPase-2 P X Frutose 6P Frutose 2,6BP PFK-1 + FBPase-1 Glicólise Gliconeogênese Adrenalina camp PKA Músculo: P + PFK-2 FBPase-2 P Frutose 6P Frutose 2,6BP + PFK-1 FBPase-1 Glicólise Gliconeogênese

13) Complete agora seu esquema metabólico, sabendo que a atividade da enzima piruvato quinase (PK) é modificada pela presença de frutose 1,6 bisfosfato e pela fosforilação promovida pela PKA. Atribua a estes modificadores uma função (ativação ou inibição) sobre esta enzima tal qual o permita construir um quadro metabólico coerente quando somado as informações anteriormente fornecidas.

Glicólise

Fígado

Fígado Músculo Igual ao Fígado FBPase-2 PFK-2

sinal / estímulo γ β Gs GDP α Gs GTP α AC PKA GTP ATP camp AMP Gliconeogênese - PFK2 / F2,6Pase piruvato quinase - + P P Fosforilação de proteínas - glicogênio sintase P + glicogênio fosforilase Degradação de Glicogênio P P lipase + P Lipólise acetil-coa carboxilase -