ISSN 98-49 - Volume 4 Número VARIAÇÕES CLONAIS EM CULTURA DE TECIDOS DE Phyllanthus tenellus ROXB., UMA PLANTA MEDICINAL Cristiane Pimentel Victório ; Celso Luiz Salgueiro Lage RESUMO - O padrão de desenvolvimento in vitro de Phyllanthus tenellus foi avaliado, considerando as características fenotípicas: número de brotos, altura do broto, número de ramos, tamanho dos ramos, número de folíolos e enraizamento, com o objetivo de verificar as variações clonais e selecionar genótipos superiores para seguir com os subcultivos por propagação vegetativa in vitro. A partir da germinação in vitro, foram selecionados dois clones C 4 e C. O clone C apresentou características morfogênicas melhores que o C 4 durante 6 dias, quando ocorreu o esgotamento dos nutrientes do meio de cultura e a senescência foliar. Unitermos: genótipos superiores, quebra-pedra, micropropagação, propagação clonal CLONAL VARIATIONS IN TISSUE CULTURES OF Phyllanthus tenellus ROXB., A MEDICINAL PLANT ABSTRACT In vitro development pattern of Phyllanthus tenellus was evaluated, considering phenotypical features as shoot number, shoot height, branch number, branch length, leaflets number and rooting, aiming to verify the clonal variations and to choose superior genotypes to continue with in vitro subcultures by vegetative propagation. Two clones were chosen after in vitro germination C 4 and C. The C clone presented better morphogenic features than C 4 along 6-day, when occurred the depletion of nutrient medium and leaf senescence. Uniterms: clonal propagation, micropropagation, plant tissue culture, superior genotypes INTRODUÇÃO As variações entre indivíduos da mesma espécie, quando desenvolvido em mesmo ambiente, evidenciam diferenças intrínsecas no DNA que caracteriza diferentes padrões no desenvolvimento vegetal. A seleção de genótipos superiores é possível na observação de características fenotípicas ao longo do desenvolvimento. A técnica de cultura de tecidos vegetais tem sido bastante utilizada na seleção de genótipos superiores devido à praticidade na produção clonal de plantas em grande quantidade por um período curto e em um espaço reduzido em comparação ao tempo de cultivo em campo. O desenvolvimento de órgãos in vitro é limitado por fatores como genótipo, tipo de explante e composição do meio de cultura, relevantes para o sucesso da via de regeneração (Brown & Charlwood, 99). O gênero Phyllanthus (Phyllanthaceae), conhecido como quebra-pedra, compreende cerca de 75 espécies distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais. Nas Américas, principalmente no Caribe e Brasil, existem cerca de espécies amplamente distribuídas (Calixto et al., 998). Várias espécies do gênero são utilizadas para fins de tratamento renal, e, comprovadamente, o chá de quebra-pedra age impedindo a agregação dos cristais de oxalato de cálcio por alterar a polaridade e estrutura dos cristais, evitando a formação ou aumento do cálculo renal o que caracteriza uma Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas (Biofísica). UFRJ/IBCCF/ Laboratório de Fisiologia Vegetal/CCS. Endereço para correspondência: Bloco G, Av. Carlos Chagas Filho, s/n, Cidade Universitária, Ilha do Fundão, 94-9, Rio de Janeiro - RJ, cris.pvictor@gmail.com. Físico, Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica). UFRJ/IBCCF/Laboratório de Fisiologia Vegetal, CCS, clslage@biof.ufrj.br
ISSN 98-49 - Volume 4 Número ação preventiva eficiente; além de relaxar o sistema urinário, facilitando a eliminação das pedras dos rins (Schor, ). Estudos etnofarmacológicos mostram que folhas de quebra-pedra são bastante utilizadas pela população carente do Rio de Janeiro, que freqüenta feiras-livres e o Mercadão de Madureira, no intuito de tratar enfermidades renais e hepáticas (Branquinho, 999). A demanda pela utilização popular e os efeitos terapêuticos desta planta justificam a viabilização de matéria-prima fidedigna e de qualidade. Este trabalho se constitui na seleção de clones de Phyllanthus tenellus para uma série de estudos de avaliação de variáveis como reguladores de crescimento vegetal, qualidade e quantidade de luz e produção de mudas padronizadas para utilização como matéria-prima em fitoterápicos. MATERIAL E MÉTODOS Exemplar da espécie Phyllanthus tenellus Roxb., fonte das sementes utilizadas neste trabalho, foi identificado e está depositado no Herbário do Museu Nacional do Rio de Janeiro, sob o número R 87. Segmentos nodais obtidos de plantas germinadas in vitro foram inoculados em meio MS (Murashige & Skoog, 96) modificado, com redução à metade das concentrações de NH 4 NO e KNO que contêm nitrogênio (MS½N) (Victório & Lage, 9a), acrescido de g.l - de sacarose, vitaminas (tiamina HCl -, µm, piridoxina µm e ácido nicotínico - 4,µM), mio-inositol -,6 mm e 7,8 g.l - agar, ph ajustado para 5,8±,. Após germinação, as plântulas oriundas de cada semente foram separadas para subcultivos no mesmo meio anteriormente especificado. A partir do terceiro subcultivo, dois clones foram selecionados pela aparência para acompanhamento quanto ao desenvolvimento: C 4 e C, denominados assim por originarem da 4ª e ª semente a germinar. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado e consistiu em três conjuntos contendo 5 explantes, para cada clone. As culturas foram mantidas em sala de crescimento, com temperatura controlada a 5 ± ºC, fotoperíodo de 6h, sob lâmpada fluorescente Sylvania (F W, T-) que proporcionavam a intensidade luminosa de µmol.m -.s -. Foram avaliados os parâmetros numero de brotos, altura dos brotos, número de ramos, tamanho dos ramos, número de folíolos e percentagem de enraizamento. As análises para porcentagem de enraizamento foram realizadas através do teste da diferença entre duas porcentagens (P e P ). Os dados dos demais parâmetros foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias, comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. RESULTADOS E DISCUSSÃO Observou-se que os clones responderam de forma diferente, Figura, ao cultivo in vitro. O apresentou vantagens no desenvolvimento morfogênico, com os melhores resultados absolutos registrados para todos os parâmetros avaliados, apesar de apresentar diferença estatística significativa apenas para o parâmetro número de ramos. A avaliação de clones de P. tenellus é inédita, embora a germinação in vitro e a avaliação inicial de plântulas por 5 dias, após a germinação, já tenha sido feito, permitindo verificar que a redução dos macronutrientes nitrogenados do meio MS favoreceu o desenvolvimento in vitro da espécie (Victório & Lage, 9a).
4 ISSN 98-49 - Volume 4 Número. 6 * 5 número de brotos altura dos brotos 7.5 5..5 número de ramos 4.. tamanho dos ramos número de folíolos 7.5 5..5 raiz (%) 75 5 5. Figura - Morfogênese de plantas in vitro de Phyllanthus tenellus cultivados por 6 dias em meio MS. As médias foram avaliadas por ANOVA e teste de Tukey. *Indica diferenças estatísticas, p<,5, n 45. O crescimento das plantas em altura foi contínuo até 6 dias, mostrando a cada intervalo de dias o crescimento médio de %. Aos 6 dias, apesar de continuarem a crescer, as culturas foram subcultivadas em novo meio, anteriormente descrito, em função do esgotamento do meio e da senescência da parte aérea. Altura dos brotos (cm) 4 5 6 Idade da planta (dias) Figura - Altura das plantas de Phyllanthus tenellus provenientes de cultura de tecidos. Médias obtidas durante o tempo de cultivo de, 4 e 6 dias (n 45). Planta com 6 dias de cultivo in vitro em meio MS½N. Barra= cm.
5 ISSN 98-49 - Volume 4 Número Apesar de ser discutida a fidelidade genética dos clones (Lushai & Loxdale, ), a propagação clonal diminui as variações intraespecíficas e com isso viabiliza a obtenção de plantas mais homogêneas quanto às características morfológicas e, aos perfis químicos dos metabólitos especiais. Outra ponto que se discute é a estabilidade do clone, visto que em culturas, as alterações epigenéticas podem ocorrer diversificando as respostas dos explantes, em função dos tratamentos utilizados em cultura de tecidos (Erig & Schuch, ). No entanto, a técnica de cultura de tecidos vegetais é bastante utilizada na seleção de genótipos superiores como forma de homogeneizar as respostas fenotípicas (Silva et al., 6; Victório & Lage, 9b). Além disso, a integridade genética dos clones tem sido conservada em várias culturas (Gavidia et al., 996). Mas vale ressaltar, que dependendo do objetivo de se estabelecer uma cultura in vitro, como na restauração de ambientes naturais degradados, a propagação clonal não é o ideal, visto que no meio ambiente as variações genotípicas oferecem vantagens na sobrevivência da biota. A avaliação do período de crescimento das plantas de P. tenellus foi fundamental para o sucesso da micropropagação, já que as plantas in vitro dependem das condições físicas de exposição à luz, temperatura e umidade, além das condições nutricionais do meio. O tempo entre 4 e 6 dias se mostrou ideal, para se evitar a senescência e a deficiência nutricional. CONCLUSÃO A avaliação dos clones obtidos por diferentes sementes e a obtenção de um grupo de indivíduos genotipicamente uniformes norteou os estudos futuros com a espécie P. tenellus no intuito de produzir matéria-prima em larga escala, analisar a produção de substâncias fenólicas como os taninos, bastante presentes nesta espécie, e avaliar o efeito de fatores físicos e químicos na melhoria das características morfológicas e químicas de P. tenellus. AGRADECIMENTOS CAPES e FINEP devido ao suporte financeiro, e a CAPES pela bolsa de mestrado da primeira autora. REFERÊNCIAS Brown, J.T.; Charlwood, B.V. (99) Organogenesis in callus culture. In: Pollard, J.W.; Walker, J.M. Plant cell and tissue culture. New Jersey: Humana Press, p.65-7. Branquinho, F.T.B. (999) Da química da erva nos saberes popular e científico. (Tese de Doutorado) - Departamento de Sociologia do Instituto de Filosofia e Ciências Sociais, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo-SP. Calixto, J.B.; Santos, A.R.S.; Cequinel Filho, V.; Yunes, R.A. (998) A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology and terapeutic potential. Medical Research Review, 8: 5-58. Erig, A.C.; Schuch, M.W. (). Avaliação da fidelidade genotípica por marcadores RAPDs de brotações de pereira (Pyrus communis L.) cv. Carrick, regeneradas in vitro. Ciência Rural, (): 449-454. Gavidia, I.; Agudo, L.C.; Pérez-Bermúdez, P. (996). Selection and long-term cultures of highyelding Digitalis obscura plants: RAPD markers for analysis of genetic stability. Plant Science, :97-5.
6 ISSN 98-49 - Volume 4 Número Lushai, G.; Loxdale, H. D. (). The biological improbability of a clone. Genetic Research Cambridge, 79:-9. Murashige, T.; Skoog, F. (96). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plantarum, 5:47-497. Schor, N. () Pedras sobre controle. Revista FAPESP [on line], Edição 7, nov. - http:// www.pesquisafapesp.br. Acesso em de abril de. Silva, S.; Lage, C.L.S.; Esquibel, M.A.; San Gil, R.A.S.; Sato, A. (6). In vitro propagation of Melissa officinalis L. and production of essential oil. Plant Cell, Culture & Micropropagation., (): 5-6. Victório, C.P.; Lage, C.L.S. (9a). Light quality effects on in vitro germination and initial development of Phyllanthus tenellus. Revista Ciência Agronômica, 4:4-45. Victório, C.P.; Lage, C.L.S. (9b). Germinação e desenvolvimento pós-germinativo in vitro de Calendula officinalis L. sob diferentes qualidades de luz. Revista de Biologia e Farmácia, :8-87.