1 UFLA Universidade Federal de Lavras, DAG, Campus Universitário, Caixa Postal 3037, Lavras MG,

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1 Crescimento in vitro de hortelã do campo em função da posição do explante e taxa de multiplicação Priscila Pereira Botrel 1 ; José Eduardo Brasil Pereira Pinto 1 ; Suzan Kelly Vilela Bertolucci 1 ; Felipe Campos Figueiredo 2 ; Aurislaine Santos Ribeiro 1 ; Helena Botelho de Andrade 1 1 UFLA Universidade Federal de Lavras, DAG, Campus Universitário, Caixa Postal 3037, Lavras MG, , botrelpp@yahoo.com.br; jeduardo@dag.ufla.br; suzan@dag.ufla.br; auris_laine@hotmail.com; heleninhaba@yahoo.com.br 2 Instituto Federal do Sul de Minas Gerais, Campus Muzambinho, IFSMG, Morro Preto, Caixa Postal 2, Muzambinho MG, felipe@eafmuz.gov.br RESUMO O trabalho teve o objetivo de avaliar a influência da posição do explante no crescimento in vitro de H. marrubioides e a taxa de multiplicação em três subcultivos. O ensaio foi realizado em delineamento experimental inteiramente casualizado. Após 40 dias avaliou-se o número de nós, comprimento da brotação, biomassa seca da parte aérea, biomassa seca de raiz e comprimento de raiz. O maior comprimento da brotação e raiz, biomassa seca da brotação e da raiz foram evidenciados no segmento apical. A maior taxa de multiplicação (3,59) foi obtida no terceiro subcultivo. PALAVRAS-CHAVE: planta medicinal, Hyptis marrubioides, micropropagação, subcultivos. ABSTRACT In vitro growth of field-mint in function of explant position and multiplication rate The purpose of this study was evaluated the influence explant position in in vitro growth of H. marrubioides and multiplication rate in three subculture. The trial employed a completely randomized design. After 40 days evaluated nodal number, shoot length, shoot and root dry biomass and root length. The bigger shoot and root length, shoot and root dry biomass were evidenced in apical segment. The large multiplication rate (3.59) was obtained in the third subculture. Keywords: medicinal plant, Hyptis marrubioides, micropropagation, subculture. INTRODUÇÃO O óleo essencial no gênero Hyptis tem importância como fonte de constituintes bioativos, possuindo importantes efeitos biológicos, como atividades antimicrobianas, S17

2 citotóxicas e inseticidas (Kuhnt et al., 1995). Hyptis marrubioides Epl., conhecida popularmente como hortelã-do-campo, é uma planta de uso medicinal com atividades contra infecções gastrointestinais e dermatológicas, dores e câimbras (Corrêa, 1931). A propagação de H. marrubioides pode ser feita por sementes, que em geral apresenta boa germinação. No entanto, plantas advindas de sementes apresentam grande variabilidade quanto à morfologia e ao teor de metabólitos, o que torna fundamental a utilização de técnicas como a micropropagação visando à produção de mudas homogêneas e de qualidade. Tendo em vista a propagação de plantas homogêneas e geneticamente estáveis, os explantes ideais para a regeneração são aqueles contendo gemas pré-existentes, como os segmentos nodais e apicais (Debergh & Read, 1991), uma vez que, não sendo necessária a desdiferenciação celular, há uma menor probabilidade de regeneração de plantas com variação somaclonal. Em geral, sob condições ideais, esses explantes regeneram plantas por longos períodos de tempo; porém, em algumas espécies, há uma redução na organogênese ao longo dos subcultivos (Hussey, 1986; Mantell et al., 1994). Além disso, a determinação da duração da cultura e do intervalo entre os subcultivos são aspectos essenciais para evitar a regeneração de plantas com alterações genéticas e/ou epigenéticas (Klerk, 1990). Vários trabalhos têm verificado a influência de fatores importantes no crescimento in vitro de plantas medicinais tais como posição do segmento nodal na plântula e volumes de meio de cultura (Reis et al., 2004) e taxa de multiplicação in vitro (Flores et al. 2006). Nesse sentido foi desenvolvido este trabalho com o objetivo de estabelecer um crescimento in vitro para H. marrubioides, avaliando a influência da posição do segmento nodal na plântula e determinação da taxa de multiplicação in vitro. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos e Plantas medicinais do Departamento de Agricultura (DAG) da Universidade Federal de Lavras (UFLA), MG. Fase de estabelecimento: Gemas apicais e laterais de H. marrubioides provenientes de plantas cultivadas em casa de vegetação foram estabelecidas in vitro em meio MS semisólido (Murashige & Skoog, S18

3 1962), sem a presença de regulador de crescimento. Inicialmente as gemas foram lavadas em água corrente por duas horas e posteriormente desinfestadas com solução de hipoclorito de sódio a 30% durante 15 minutos. Após a desinfestação o material vegetal foi lavado quatro vezes com água destilada e autoclavada. Foram inoculadas 50 gemas apicais e 50 gemas laterais em tubos de ensaio (22 x 150 mm), contendo 10 ml de meio de cultura MS. A exsicata desta espécie está depositada no herbário da UFLA, sob o código ESAL e foi coletada em Tiradentes, MG. Para a análise estatística dos experimentos utilizou-se o software SISVAR (Ferreira, 2000). Avaliação da posição do segmento no crescimento in vitro de plântulas de H. marrubioides. Os explantes utilizados foram segmento apical e 1, 2, 3 e 4 segmentos laterais contendo duas gemas axilares de plântulas já estabelecidas in vitro. Estes segmentos foram inoculados em tubos de ensaio contendo 10 ml de meio MS sólido, sem a presença de regulador de crescimento. Os explantes foram expostos a condições de 25 µmol m -2 s -1 de intensidade luminosa, temperatura de 25 ± 1 C e fotoperiodo de 16 horas de luz e 8 de escuro. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado (DIC), com cinco tratamentos contendo quatro repetições e cinco tubos por repetição. Após 40 dias, as plântulas foram avaliadas quanto ao comprimento médio da maior brotação (CMB), biomassa seca da parte aérea (BSPA), biomassa seca da raiz (BSR), comprimento da raiz (CR) e número de segmentos nodais. Taxa de multiplicação de H. marrubioides em função da origem do explante. Para a obtenção da taxa de multiplicação, foram realizados três subcultivos de segmentos contendo segmentos apicais e laterais. Estes segmentos foram inoculados em tubos de ensaio, mantendo o mesmo meio de cultura. Foi colocado um explante por tubo de ensaio e estes foram expostos a condições de 25 µmol m -2 s -1 de intensidade luminosa, temperatura de 25 ± 1 C e fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 de escuro. Após 40 dias realizou-se a primeira repicagem (1º subcultivo). Os segmentos obtidos na primeira repicagem foram, então, inoculados em frascos de vidro com capacidade de 250 ml, contendo 30 ml de meio de cultura, com 5 segmentos por frasco. Em cada subcultivo os segmentos apicais e laterais foram mantidos em frascos separados. Após S19

4 40 dias, o mesmo procedimento foi realizado para segunda repicagem (2º subcultivo) e terceira repicagem (3º subcultivo). A partir dos dados do número de segmentos apicais e laterais obtidas ao final de cada subcultivo comparando com o número inicial de gemas inoculadas, foram determinadas as taxas de multiplicação. RESULTADOS E DISCUSSÃO A posição do segmento nodal na plântula demonstrou exercer influência nas varáveis de crescimento analisadas. Plântulas desenvolvidas a partir de segmentos apicais (4,75 cm), 1ª, 2ª e 3ª gemas laterais (3,81; 4,47 e 4,29 cm), os quais não diferiram estatisticamente entre si, apresentaram maior comprimento da maior brotação (CMB) do que as desenvolvidas a partir da 4ª gema lateral (2,93 cm). Para biomassa seca (BSR) e comprimento de raiz (CR), maiores valores foram observados em plântulas desenvolvidas a partir de segmentos apicais (2,1 mg e 1,81 cm, respectivamente) (Tabela 1). Os resultados observados podem estar relacionados aos níveis endógenos de fitormônios, por exemplo, a auxina é um tipo de hormônio vegetal produzido principalmente nos tecidos de órgãos aéreos, regiões apicais e transportada de célula a célula para as raízes ou através do floema formando um gradiente de concentração concentração ao longo do caule (George et al., 2008). Com relação à biomassa seca da parte aérea (BSPA), verificou-se que o segmento apical e os segmentos mais basais apresentaram maiores acúmulos. Já para o número de segmentos nodais, 2ª e 3ª gemas laterais apresentaram resultados superiores (7,2 e 6,9 nós/explante) (Tabela 1). Pereira et al. (2005), estudando a influência do número de gemas, presença ou ausência de folhas e posição do explante na multiplicação in vitro da batata, concluíram que microestacas de origem basal proporcionam resultados superiores aos apicais, especialmente para altura de brotações, taxa de multiplicação e número de brotações secundárias formadas. Em plântulas de ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata) cultivadas in vitro, segmentos basais também proporcionaram maior taxa de multiplicação e plantas maiores em biomassa, altura, número de raízes e brotações (Nicoloso, 2002). Esses resultados são contrários ao observado para espécie H. marrubioides, onde valores superiores foram encontrados em explantes desenvolvidos principalmente á S20

5 partir de segmentos apicais, em todos os parâmetros analisados, exceto para número de segmentos nodais. Já Reis et al. (2004), não encontraram diferença significativa no desenvolvimento vegetativo in vitro de ipeca (Psychotria ipecacuanha) utilizando segmentos nodais obtidos das posições basal, mediana e apical. Esses resultados mostram que existem variações muito grandes entre espécies no que se refere à determinação da posição do segmento nodal que proporciona melhor crescimento in vitro. Observando a plântula in vitro, após este período de 40 dias, as folhas demonstraram amarelecimento e posterior queda de folhas. O desenvolvimento e crescimento dos segmentos de H. marrubioides in vitro evidenciaram que a plântula inicia a entrada na fase estacionária aos 40 dias de cultivo. Pode-se concluir que para esta espécie a melhor época de repicagem seja por volta de 30 a 40 dias, antes de entrar na fase estacionaria e assim não entrar na fase de senescência. Este intervalo é importante para determinar a taxa de multiplicação e calcular o número de plântulas que poderão ser obtidas num intervalo determinado no laboratório. Com três repicagens tanto de segmentos apicais e laterais foi determinado uma taxa de multiplicação para Hyptis marrubioides, onde os segmentos apicais mostram um maior crescimento e conseqüentemente uma maior obtenção de plântulas a cada subcultivo (Tabela 2). Após o terceiro subcultivo observase uma taxa média de multiplicação de 3,59, ou seja, para cada segmento obtêm três plântulas e meia após 40 dias. Pode-se inferir após um ano de subcultivo, iniciando com 1000 explantes de plantas elites, conseguir aproximadamente plântulas. Conforme Grattapaglia & Machado (1998), o ideal é que um novo subcultivo seja realizado antes do início da fase de senescência. A taxa de multiplicação pode depender do tipo de explante e da espécie em estudo. Neste trabalho com a espécie H. marrubioides o explante apical evidenciou melhor crescimento e taxa de multiplicação. Na micropropagação de ginseng brasileiro (Pfaffia tuberosa), onde explantes provenientes de segmentos nodais apresentaram uma maior taxa de multiplicação quando comparados com os apicais (Flores et. al., 2006). Calvete et al. (2009) estudando o desempenho in vitro e agronômico de cultivares de morangueiro em vários subcultivos, concluíram que a maior taxa de multiplicação foi observada durante o 2º e o 3º subcultivos com média de sete a oito propágulos/explante, S21

6 respectivamente. Para H. marrubioides, foi observado um aumento na taxa de multiplicação apenas no 3º subcultivo (Tabela 2). Reis et al. (2008), também avaliaram a taxa de multiplicação in vitro de erva cidreira (Melissa oficinalis) e demonstraram que a taxa de multiplicação é cerca de 2,1 vezes maior para plântulas cultivadas em meio MS que para aquelas subcultivadas em meio MS na presença de BAP. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem á CAPES, CNPq e FAPEMIG pelo apoio de bolsas (de estudo, produtividade e apoio técnico) e suporte financeiro. REFERÊNCIAS CALVETE EO; GRANDO MF; GOMIDE DG; MARAN RE; SUZIN M; NIENOW AA; CECCHETTI D Desempenho in vitro e agronômico de cultivares micropropagadas de morangueiro em vários subcultivos. Revista Brasileira Fruticultura 31: CORRÊA MP Dicionário das plantas úteis e das exóticas cultivadas. Rio de Janeiro: Imprensa Nacional. DEBERGH, P.C.; READ, P.E. Micropropagation. In: DEBERGH PC; ZIMMERMAN RH. Micropropagation: technology and application. London: Kluwer Academic. p FERREIRA DF Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão 4.0. In... REUNIÃO ANUAL DA REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45. Anais... São Carlos: UFSCar. p FLORES R; JOSEILA M; NICOLOSO FT Otimização da micropropagação de Pfaffia tuberosa (Spreng.) Hicken. Ciência Rural 36: GEORGE EF; HALL MA; DE KLERK GJ Plant propagation by tissue culture. Springer: Netherland. 501p. GRATTAPAGLIA D; MACHADO MA Micropropagação. Retrospectiva da cultura de tecidos de plantas. In: TORRES AC; CALDAS LS. (eds). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/ Embrapa-CNPH. p HUSSEY G Problems and prospects in the in vitro propagation of herbaceous plants. In: WITHERS LA; ALDERSON PG. Plant tissue culture and its agriculture applications. London: Butterwoths. p S22

7 KLERK GJ How to measure somaclonal variation. Acta Botanica Neerlandica 38: KUHNT TM; PROBSTLE A; RIMPLER H; BAUER R; HEINRICH M Biological and pharmacological activities and further constituints of Hyptis verticullata. Planta Medica 61: MANTELL SH; MATTHEUS JM; MCKEE RA; AZEVEDO JLT; AGUIAR-PERECIN MLR de; VELLO NA Princípios de biotecnologia em plantas: uma introdução à engenharia genética em plantas. Ribeirão Preto: SBG. 344p. MURASHIGE T; SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: NICOLOSO FT; ERIG AC Efeito do tipo de segmento nodal e tamanho do recipiente no crescimento de plantas de Pfaffia glomerata in vitro. Revista Ciência e Agrotecnologia Edição Especial: PEREIRA JES; FRANÇA RB; DANTAS ACM; FORTES GRL Influência do número de gemas, presença ou ausência de folhas e posição do explante na multiplicação in vitro da batata. Horticultura Brasileira 23: REIS ES; PINTO JEBP; CORRÊA RM; BERTOLUCCI SKV; LAMEIRA OA Tamanhos e posições de explantes e volumes de meio de cultivo na multiplicação de ipeca (Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes) in vitro. Revista Ciência e Agrotecnologia 28: REIS ES; PINTO JEBP; ROSADO LDS; CORRÊA RM Influência do meio de cultura na germinação de sementes in vitro e taxa de multiplicação de Melissa officinalis L. Revista Ceres 55: S23

8 Tabela 1. Comprimento médio da maior brotação (CMB) em cm, biomassa seca da parte aérea (BSPA) em mg, biomassa seca da raiz (BSR) em mg, comprimento da raiz (CR) em cm e número de segmentos nodais de plântulas de H. marrubioides com 40 dias de cultivo, em função da posição do segmento nodal na plântula (Average length of the higher shoot in cm, shoot dry biomass in mg, root dry biomass in mg, length root in cm and number of the nodal segments in H. marrubioides plantules with cultivation 40 days, in function of the position nodal segment in plantule). Lavras, UFLA, Posição do segmento nodal CMB (cm) BSPA (mg) BSR (mg) CR (cm) Nº segmentos nodais segmento apical 4,75 a 22 a 2,1 a 1,81 a 5,1 b 1ª segmento lateral 3,81 a 19 b 0,3 b 0,14 b 6,0 b 2ª segmento lateral 4,47 a 19 b 0,5 b 0,21 b 7,2 a 3ª segmento lateral 4,29 a 23 a 0,4 b 0,08 b 6,9 a 4ª segmento lateral 2,93 b 24 a 0,4 b 0,30 b 6,1 b As médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade. Tabela 2. Número de plântulas e taxas de multiplicação (TM) de explantes de H. marrubioides oriundos de segmentos apicais e laterais, em três subcultivos com intervalo de 40 dias (Number of the plantules and multiplication rate of H. marrubioides explants from of apical and lateral segment, in three subculture with 40 days interval). Lavras, UFLA, Origem do explante Número inicial de segmentos 1º Subcultivo Número de plântulas 2ª Subcultivo Número de plântulas 3º Subcultivo Número de plântulas Apicais Laterais Total TM - 2,90 2,80 3,59 S24