Manual para coleta de Patasltls di pebls Por: Gabriela Tomas Jerônimo - MSC gabriela@cca.ufsc.br Engenheira de Aquicultura; Doutoranda em Aquicultura. UFSC Mauricio Laterça Martins mlaterca@cca.ufsc.br Biólogo - Docente UFSC Arlene Sobrinho Ventura arlenesventura@yahoo.com.br Médica Veterinária Márcia Mayumi Ishikawa marcia@cpao.embrapa.br Médica Veterinária; Pesquisadora Embrapa Agropecuária Oeste Marcos Tavares Dias marcostavares@cpafap.embrapa.br Biólogo; Pesquisador Embrapa Macapá ntre as metodologias para se identificar as doenças em peixes cultivados está a análise parasitológica. No entanto, é importante seguir etapas de forma correta para obtenção dos parasitos e para que posteriormente seja possivel a sua identificação. Assim, é necessário retirar e analisar os ór ãos do peixe onde podemos encontrar os parasitos, seguindo uma sequência de procedimentos que facilite a execução e garanta a preservação dos parasitos (EIRAS et a!. 2006). Sempre que possivel, os peixes deverão ser examinados imediatamente após sua coleta e morte, para observação de parasitos externos (ectoparasitos) e internos (endoparasitos). O objetivo deste artigo é orientar técnicos, estudantes e profissionais da área sobre as metodologias adequadas para coleta de parasitos de peixes, principalmente na piscicultura. O texto foi publicado anteriormente pela Embrapa de Macapá, AP (Circular 39), em maio de 2011. Para conter e sacrificar os peixes podem ser utilizados alguns anestésicos sintéticos como a tricaína metano sulfonato (MS-222) e a benzo caí na, os quais são muito utilizados. Estes anestésicos podem causar efeitos indesejados em algumas espécies de peixes, tais como a perda de muco, irritação das brânquias e danos na córnea (INOUE et ai., 2003), além da perda de ectoparasitos. Outra alternativa é a utilização do óleo de cravo que apresenta algumas vantagens como a praticidade, baixo custo, eficiência em baixas concentrações e rápida metabolização e depuração (CHO; HEAT, 2000; MUNDAY; WILSON, 1997; WATERS- TRAT, 1999). O anestésico a ser utilizado fica a critério do piscicultor. Após anestesiar os peixes, uma maneira simples e eficaz de sacrificar os mesmos, consiste em perfurar a parte superior da cabeça com um instrumento pontiagudo, no qual um pequeno movimento lateral nesta posição causa a comoção cerebral, provocando sua morte. A medida do tamanho e peso do peixe (biometria) deve ser realizada para complementar as informações referentes ao diagnóstico da doença. O comprimento pode ser o total, que vai da boca até a cauda ou o comprimento padrão, que vai da boca até o pendúculo caudal.
Sequência de procedimentos para coleta de parasitos de peixes Coleta de parasitos externos (ectoparasitos) em peixes de pequeno porte: a) Colocar o peixe em um frasco com formalina 1:4000; b) Esperar duas horas e completar com formol (37-40%) até atingir uma concentração aproximada de 5%; c) Etiquetar o frasco com informações do proprietário. a) As narinas devem ser abertas com auxílio de uma tesoura de ponta fina e deve-se realizar a lavagem das suas cavidades com soro fisiológico 0,65% ou formalina 1:4000; b) O conteúdo deve ser colocado em um frasco; c) Adicionar formal a 10% até alcançar a concentração de 5% sobre o conteúdo; d) Etiquetar o frasco contendo o órgão e identificá-lo com informações sobre o peixe analisado (espécie), o local e data de coleta. a) Fazer uma inspeção macroscópica com objetivo de detectar possíveis parasitos visíveis a olho nu; b) Realizar raspagem da pele no sentido cabeça-cauda, não se esquecendo das nadadeiras; c) Colocar o conteúdo obtido da pele em um frasco; d) Adicionar formol a 10% até alcançar a concentração de 5% sobre esse conteúdo; e) Etiquetar o frasco, contendo o órgão, peixe analisado e data. a) Para sacrificar o peixe, após perfurar a parte superior da cabeça com um instrumento pontiagudo, realizar um pequeno movimento LateraL para seccionar a medula. b) Levantar o opérculo, expondo as brânquias (guelras), retirá-las com cuidado e separar cada parte dela, que é chamada de arco. c) Colocar em frasco e banhá-las com água a 60 (, e após aproximadamente 30 minutos, completar o frasco com formal a 10%. d) Etiquetar o frasco, contendo o órgão, peixe analisado e data.
a) Com auxílio de instrumento pontiagudo, externar o globo ocular do peixe; b) Retirar os dois globos oculares; c} Estourar os globos oculares dentro de um frasco; d) Adicionar AFA Frio ou formol a 10%; e) Etiquetar o frasco, contendo o órgão, peixe analisado e data. Necropsia para coleta de parasitos internos (endoparasitos): a necropsia dos peixes consiste na abertura da cavidade visceral e exposição dos órgãos, como mostra a figura abaixo. a) Retirar o órgão desejado (estômago e/ou intestino); b) Individualizá-los em placa de Petri; c) Os órgãos devem ser abertos cuidadosamente. a,b) Fazer uma incisão ventral, começando na região do ânus e prolongando-a até a região anterior; c) Aseguir, rebatem-se as paredes laterais da cavidade visceral; d) Expor os órgãos internos e observar se há parasito aderido à superfície dos órgãos ou na própria cavidade visceral; e) Retirar o órgão desejado. a) Os órgãos devem ser banhados em água a 55 C (estômago e/ou intestino). b) Após 30 minutos completar o frasco com formol 10% ou AFA aquecido a 60 C. O intestino e o estômago devem ser abertos e fixados diretamente no frasco com formol10% ou AFA aquecido a 60 C; c) Etiquetar identificando qual órgão, data, espécie e informações do proprietário; d) Para facilitar a coleta, o conteúdo do estômago e/ou intestino poderão ser lavados em peneiras com malha de 100-15011m de abertura. e) Observar o órgão em estereomicroscópio; OBs: Se a coleta for realizada em laboratório, pode seguir direto para o passo d.
. É predso muito cuidado durante a manipulação dos reagentes indicados para fixação dos órgãos ou parasitos dos peixes. Deve-se usar luvas e máscaras, pois o formol e ácido acético são altamente tóxicos, cancerigenos e irritantes para as vias respiratórias do homem." Principais parasitos de peixes cultivados: Detecção e métodos de fixação Nos peixes de cultivo podem ser encontrados diferentes parasitos nos mais variados órgãos internos e externos, como apresentado na tabela. Estes parasitos, em geral, são identificados por especialistas, mas alguns podem ser coletados por piscicultor bem treinado quando este tiver reagentes químicos como formal, ácido acético e álcool 70% ou álcool absoluto (PA). Nesse caso, o piscicultor deve usar métodos de acordo com cada parasito, como descrito a seguir: Monogeneas - São parasitos que se encontram geralmente nas guelras, narinas e superfície do corpo dos peixes. Podem ser localizadas também no estômago, cavidade visceral, ovidutos e canais urinários do peixe, porém em menores quantidades. A verificação desses parasitos pode ser feita analisando-se peixes vivos, fazendo um raspado da pele e das guelras, ou analisando pequenos pedaços de brânquias colocados entre lâmina e lamínula. Para visualização desses parasitos no estômago, cavidade visceral, ovidutos e canais urinários, deve-se abrir o peixe e retirar o órgão desejado e fixar como recomendado no manual. Digenéticos - Podem ser coletados no trato-gastrointestinal (estômago, órgãos ocos, sistema circulatório ou tecido conjuntivo). Em sua forma larval (metacercárias) podem localizar-se nos olhos, cérebro, musculatura, cavidade visceral e mesentério. É recomendado que os parasitos adultos sejam comprimidos entre lâminas ou entre lâmina e lamínula e fixados com formal 5% ou AFA. Cestóides e nematóides - Em geral, os cestóides e nematóides são encontrados na fase adulta, parasitando o intestino ou a cavidade do corpo dos peixes e quando encontrados devem ser fixados com formol 5% ou AFA quente, para distensão do corpo do verme. Acantocéfalos - Os parasitos adultos são quase sempre encontrados no intestino dos peixes; já as larvas podem ser encontradas em vários órgãos, especialmente no mesentério e fígado. Para fixação, recomenda-se colocar os parasitos em água destilada e mantê-ias em geladeira, a 4 C, para que ocorra a eversão da prabóscide (órgão importante da identificação) e, depois, os parasitos colhidos devem ser fixados em formal 5% ou AFA. Protozoários (Ictio, Piscinodinium e tricodinas) - Esses parasitos podem ser encontrados nas guelras e pele dos peixes. Para identificar estes parasitos, o técnico ou piscicultor precisa de observação de raspados de pele (muco) e fragmentos de guelras colocados entre lâmina e lamínula, e visualizados com auxílio de microscópico. Quando for encaminhar amostras para laboratório, deve-se raspar a pele do peixe e retirar toda guelra do peixe, colocá-ios em frascos separados e fixar com fonnalina a 5%. Myxozoa - Podem ser encontrados nas brânquias, rins, fígado, baço, coração ou músculo. São caracterizados, na sua fase de parasito de peixes, por possuírem esporos, podendo ter folmas e dimensões muito diferentes. A sua observação deve ser feita, tanto quanto possível, imediatamente depois de coletados, colocando os órgãos entre lâmina e lamínula. Se for ímpossível observar os esporas a fresco, então pode proceder-se à fixação dos mesmos em fonnalina tamponada a 4% - 10%. a) Formalina 1:4000 - Formol (37-40). - Água destilada. b) Formol a 5%: - Formol (37-40) - Água destilada c) Formol a 10%: - Formol (37-40) - Água destilada d) Álcool a 70% - Álcool absoluto. - Completar com água destilada f) AFA - Álcool 700GL. - Formol (37-40). - Ácido acético glacial. 1 ml 900 ml 50 ml 950 ml 100 ml 900 ml 700 ml 300 ml 930 ml 50 ml 20 ml
Parasito Local de preferência Boca Muco e Músculo e Brânquias Olhos nadadeiras mesentério Intestino Demais órgãos internos Ichthyophthirius - + + multifiliis (Ictio) - - Piscinoodinium pi/lulare + + - - Tricodinas + + - - Mixosporideos + + + + + + Monogenóides + + - + Lernaea - + + (larvas e adultos) - - Perulernea + + + + - - ArguluslDo/ops - + +. - Larvas de molusco + + - - Larvas de digenéticos + + + + Larvas de cestóides - - + + + Larvas de nematóides -.. - + + + Digenéticos, cestóides e - -.. + + nematóides adultos Acantocéfalos + + Tabela. Principais órgãos dos peixes onde os parasitos de peixes podem ser encontrados É necessário muito cuidado durante a manipulação dos reagentes indicados para fixação dos órgãos ou parasitos dos peixes. Recomenda-se utilizar sempre luvas e máscaras para manipulação dos reagentes, pois o formol e ácido acético são altamente tóxicos, cancerígenos e irritantes para as vias respiratórias do homem. Esses produtos quando entram em contato com a pele, podem causar irritação nos olhos, nariz e nas mucosas e em altas concentrações pode causar bronquite, pneumonia e laringite. Os sintomas mais frequentes no caso de inalação são: fortes dores de cabeça, tosse, falta de ar, vertigem e dificuldade para respirar. O contato com o vapor ou com a solução pode deixar a pele esbranquiçada, áspera e causar forte sensação de anestesia e necrose na pele superficial. O ácido acético quando concentrado pode causar queimaduras graves na pele e olhos. Forma correta de transporte de peixes para análise de parasitos em laboratório uma melhor alternativa é enviar peixes com problemas para um laboratório de diagnóstico. Para isso, os peixes podem ser enviados em saco plástico com gelo (Figuras a e b) ou preferencialmente em saco plástico com água do viveiro (Figura c). A coleta de parasitos de peixe pode ser realizada, preferencialmente no Laboratório, no entanto, pode também ser realizada na piscicultura, quando o produtor se sentir seguro para isso. Neste caso, o material deve estar acondicionado em frasco com formol, seguindo a concentração e a quantidade recomendada anteriom1ente, para que a amostra fique totalmente coberta. Assim, um fixador deve ser usado de 5 a 10 vezes o volume do órgão dos parasitos colhidos para análise. Além disso, junto com a amostra deverá ser encaminhado ao Laboratório, algumas informações complementares sobre o material a ser enviado: - ome, endereço e telefone do proprietário da piscicultura; - Data em que foi realizada a coleta dos parasitos ou do peixe; - Nome da espécie de peixe; - Ração utilizada e a frequência que é oferecida aos peixes; - Data em que começou a mortalidade dos peixes; - Se foi utilizado algum tipo de tratamento no viveiro, informar qual o produto usado. Como muitas vezes o técnico ou piscicultor não está treinado para coletar parasitos e não dispor também de regentes, Agradecimentos: Os autores agradecem ao CNPq e Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA), pelo apoio financeiro ao Projeto Aquabrasil e Projeto MAPA/CNPq (Proc. 578159/2008-2). Referências Bibliográficas: CHO, G. K.; HEAT, D. D. Comparison of tricaine methanesulphonate (MS222) and clove oil anaesthesia effects on the physiology of juvenile Chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha (Walbaum). Aquaculture Research, Oxford, n. 31, p. 537-546, 2000. EIRAS, J. c.; TAKEMOTO,R. M.; PAVANELLI,G. C. Métodos de estudo e técnicas laboratoriais em parasitologia de peixes. 2. ed. Maringá: Eduem, 2006.199 p. INOUE, L. A. K. A.; SANTOS-NETO,c.; MORAES,G. Clove oil as anaesthetic for juveniles of matrinxã Brycon cephalus (Günther, 1869). Ciência Rural, Santa Maria, v. 33, n. 5, p. 943-947, 2003. MUNDAY,P. L.; WILSON,S. K. Comparative efficacy of clove oil and other chemicals in anaesthetization of Pomacentrus amboinensis, a coral reef fish. Journal of Fish Biology, London, v. 51, p. 931-938, 1997. WATERSTRAT, P. R. Induction and recovery from anaesthesia in channel catfish Ictalurus punctatus fingerlings exposed to clove oil. Journal of World Aquaculture Society, Baton Rouge, v. 30, n. 2, p. 250-255, 1999. I,I Panorama da AQÜICULTURA, maio,junho, 2011 C 2_9 (~