REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 Volume 8 - Número 2-2º Semestre 2008 Efeito das concentrações de vitaminas e reguladores de crescimento no superbrotamento da cultivar BRS-verde Nara Wanderley Pimentel 1, Lívia Wanderley Pimentel 2, Priscila Simone Ribeiro Aires 1 e Julita Maria Frota Chagas Carvalho 3 RESUMO A propagação in vitro oferece condições para obter plantas em menor espaço de tempo comparado ao melhoramento convencional. Uma das metodologias empregadas no processo de cultivo de tecidos e propagação in vitro é o superbrotamento, com o qual, a partir de um explante, possam ser obtidas várias plantas geneticamente idênticas à plântula matriz. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito dos complexos vitamínicos e das concentrações dos fitorreguladores 6-benzylaminopurina (BAP) e N6- furfurilaminopurina (KIN) no superbrotamento in vitro da cultivar de algodão BRS- Verde. Na desinfestação das sementes, fez-se uso de soluções de hipoclorito de sódio a 1% de cloro ativo mais 1mL de Tween 20. Na indução de múltiplos brotos analisou-se o explante gema cotiledonar em três complexos vitamínicos: MS; LS e Sais de MS acrescidos de vitaminas do meio B5, suplementados com combinações de BAP e KIN nas concentrações: 0,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 e 4,5 mg.l -1 com 10 frascos por tratamento, cada um contendo três explantes, em um delineamento inteiramente casualizado. As avaliações foram realizadas após 60 dias de cultivo, foi considerado o parâmetro NBE (número de brotos por explante). Observou-se que o meio MS apresentou um efeito diferencial e promissor, quando suplementado com 3,0 mg.l -1 de BAP e 3,0 mg.l -1 de KIN, alcançando média de 6,29 brotos por explante. Verificou-se que o meio MS suplementado com BAP e KIN, proporcionou boa capacidade organogênica na cultivar BRS-Verde, para o explante gema cotiledonar. Palavras chaves: algodão; micropropagação; citocininas Effect of the concentrations of vitamins and growth regulators in the multiple shots of cultivating BRS-Verde ABSTRACT The propagation in vitro offers conditions to obtain plants in smaller space of time compared to the conventional improvement. One of the employed methodologies in the process of cultivation of fabrics and propagation in vitro is the induction multiple shots, with which, starting from an explants, they can be obtained several plants genetically identical to the main seedling. The objective of that study was to evaluate the effect of the compounds vitamins and of the concentrations of the growth regulators 6-benzylaminopurine (BAP) and N6 - furfurilaminopurine (KIN) in the induction multiple shots in vitro of cultivating of BRS-verde cotton. In the desinfested of the seeds, it was made use of solutions of hypochlorite of sodium to 1% of active chlorine more 1mL of Tween 20. In the induction of multiple sprouts the explants was analyzed cotyledonary moans in three complex vitamins: MS; LS and salts of MS added of vitamins of half B5, 152
supplemented with combinations of BAP and KIN in the concentrations: 0,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 and 4,5 mg.l -1 with 10 flasks for treatment, each one containing three explants, in completely randomized design. The evaluations were accomplished after 60 days of cultivation, the parameter was considered NBE (number of sprouts for explants). It was observed that the MS way presented an effect differential and promising, when supplemented with 3,0 mg.l-1 of BAP and 3,0 mg.l-1 of KIN, reaching average of 6,29 sprouts for explants. It was verified that the way MS supplemented with BAP and KIN, provided good capacity organogenic in cultivating BRS-verde, for the explant cotyledonary moans. Keywords: cotton; micropropagation, cytokinins 1 INTRODUÇÃO O algodoeiro é uma das fibras vegetais mais cultivadas do mundo e um dos produtos de maior importância do grupo das fibras, pelo volume e valor de produção. Seu cultivo é também de grande importância social pelo número de empregos que gera direta ou indiretamente. O aproveitamento da planta é um dos mais completos, pois dos seus subprodutos são utilizados o óleo, o línter, a farinha de torta e a casca, todos extraídos da semente ou do caroço. A cultura do algodão apresenta problemas como um número elevado de pragas e doenças preocupando os pesquisadores que visam obter plantas com qualidade fitossanitária e elevado índice de produtividade. Ribeiro et al., (2002), ressalta que, do potencial de produtividade do algodão, apenas 15,9% têm sido atingido, e o aproveitamento desse potencial poderia ser elevado a 60%. Na biotecnologia vegetal, o domínio da cultura in vitro (ou cultivo de tecidos) de plantas teve importância crucial. A cultura in vitro de tecidos vegetais pode ser definida como um conjunto de técnicas para favorecer o crescimento de um grande número de células em um ambiente estéril e controlado. O maior impacto da cultura de tecidos está na área de multiplicação de plantas, conhecida como micropropagação ou propagação clonal, porque os indivíduos produzidos são geneticamente idênticos (RAVEN et al., 2001). A micropropagação proporciona meios para obtenção de plantas, em curto período de tempo, livres de doenças devido à descontaminação dos explantes e às condições estéreis empregadas. O sucesso de programas de transformação genética de plantas depende do potencial de regeneração da espécie em estudo o qual é influenciado pelo genótipo utilizado, tamanho dos explantes, composição do meio nutritivo, condições de cultivo e pelas concentrações de hormônios vegetais (FERREIRA et al., 1998). Portanto a necessidade de maximizar o número de plantas regeneradas de algodão, com a manutenção da fidelidade genética, contribuiu para uma ampla diversificação das condições do cultivo in vitro, tanto para desenvolver novas cultivares como para fornecer alternativas para programas de melhoramento genético.considerando-se a necessidade de realização de trabalhos básicos que auxiliem os programas de melhoramento genético da cultura do algodão, o presente trabalho tem por objetivo estudar o comportamento da cultivar BRS-Verde de algodão quando estimulado por complexos vitamínicos e concentrações de fitorreguladores no superbrotamento in vitro do explante gema cotiledonar. 2 MATERIAL E MÉTODOS As sementes foram desinfestadas em solução de hipoclorito, a 1% de cloro ativo mais uma gota de Tween 20 para cada 100 ml de solução durante 20 minutos em agitação, seguida de lavagem tripla em água deionizada esterilizada. Posteriormente foram inoculadasem tubos de ensaio contendo meio MS (MURASHIGUE e SKOOG, 1962), suplementado com 3% de sacarose e 0,55% de ágar, os tubos foram fechados com tampa 153
de prolipropileno e vedados com fitafilme. Após 25 dias de plantio os explantes foram separados e excisados e, em seguida, inoculados em frascos contendo sais do meio MS adicionados com os complexos vitamínicos dos meios: I MS; II LS (LINSMAIER e SKOOG, 1965), e/ou III B5 (GAMBORG et al., 1968); todos os frascos foram suplementados com combinações das citocininas BAP e KIN nas seguintes concentrações: 2,5mg.L -1 BAP + 2,5mg.L -1 KIN; 3,0mg.L -1 BAP + 3,0mg.L -1 KIN; 3,5mg.L -1 BAP + 3,5mg.L -1 KIN; 4,0mg.L -1 BAP + 4,0mg.L -1 KIN e 4,5mg.L -1 BAP + 4,5mg.L -1 KIN. Todos os meios foram suplementados com sacarose a 3% e phytagel a 0,55% e o ph ajustado para 5,8. Foi realizado um experimento controle onde não houve a adição de BAP e KIN. Em cada complexo vitamínico foi utilizado o tratamento controle correspondente a ausência de citocininas no meio de cultivo. Utilizaram-se 10 frascos por tratamento, contendo três explantes cada um. A cada 20 dias os explantes foram transferidos em condições estéreis para frascos contendo meios frescos, a fim de se evitar ocorrência de oxidação. A avaliação foi realizada após 60 dias de cultivo. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado no arranjo fatorial 3x5 (3 complexos vitamínicos e 5 concentrações de fitorreguladores). A variável NBE (Numero de Brotos por Explante) foi submetida à análise de variância e análise de regressão linear pelo software Sisvar (FERREIRA, 2000), as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO De acordo com os resultados obtidos em relação à análise de variância para a característica NBE, Tabela 1, observou-se que houve significância para as características estudadas (vitaminas e fitorreguladores), bem como para a interação (vitaminas*fitorreguladores) indicando haver influencia tanto dos maios de cultivo quanto das concentrações de fitorreguladores na multiplicação dos brotos no explante gema cotiledonar da cultivar de algodão BRS- Verde. Indica também que não houve comportamento consistente das concentrações de reguladores de crescimento em todos os complexos vitamínicos, ou seja, existe concentrações ideais de fitorreguladores para cada complexo vitamínico. Tabela 1- Resumo da análise de variância e coeficiente de variação (CV) referente ao parâmetro número de brotos por explante (NBE). Fonte de Variação GL Quadrado médio NBE Vitaminas 2 11.872 Fitorreguladores 4 30.635 Vitaminas*fitorreguladores 8 10.861 Resíduo 135 0.449 CV% 16.49 Na Tabela 2, são apresentados os resultados obtidos na indução de múltiplos brotos em cada complexo vitamínico, para a variável NBE na média de todas as concentrações de fitorreguladores. Pode-se observar que o tratamento com sais do meio MS acrescido de vitaminas do meio LS apresentou maior capacidade organogênica (Figura 1A) com uma média de 4,51 brotos/explante, aos 60 dias de cultivo, quando comparado com os demais tratamentos. Resultados semelhantes foram constatados por Lima (2004), que obteve melhores resultados de multiplicação in vitro de algodão (Gossypium hirsutum L.), utilizando o explante meristema apical e o meio MS, obtendo uma média de 7,4 brotos por explante. 154
Tabela 2- Valores médios da variável número de brotos/ explante, em relação aos complexos vitamínicos. Tratamentos Médias(NBE) 1 Sais do meio MS + Vitaminas do meio B5 3,54c Sais do meio MS + Vitaminas do meio MS 4,14b Sais do meio MS + Vitaminas do meio LS 4,51a 1. Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. Figura 1A e B. Indução da organogênese em algodão. A) Multibrotação obtida no tratamento inoculado com sais do meio MS acrescidos de vitaminas do meio LS. B) Multibrotação obtida no tratamento suplementado com 3,0 mg.l -1 BAP + 3,0 mg.l -1 KIN Na Tabela 3, verifica-se que as maiores médias de brotos foram obtidas no tratamento em que se utilizou 3,0 mg.l -1 BAP + 3,0 mg.l -1 KIN, alcançando uma média de 5,21 brotos/explante (Figura 1B). Observa-se que houve tendência de redução no número de brotos por explante com o aumento das concentrações de fitorreguladores. Provavelmente, estes níveis exógenos de BAP e/ou KIN (ambos apresentavam sempre a mesma proporção), interagindo com o nível endógeno da citocinina, causaram efeito fitotóxico, suprimindo as brotações. Esses resultados foram semelhantes aos obtidos por Sousa et al. (2004), estudando a indução de múltiplos brotos na cultivar de algodão CNPA 97-668, onde elevadas concentrações de BAP promoveram redução no percentual de explantes com brotações, sendo que para o referido autor, a concentração ótima dos fitorreguladores foi de 1,5 mg.l -1 de BAP e 1,5 mg.l -1 de KIN, que é inferior à obtida neste trabalho (3,0 mg.l -1 ). Isto se deve, provavelmente, ao potencial morfogenético inerente a cada variedade. Tabela 3- Valores médios da variável número de brotos/explante em relação às concentrações de fitorreguladores. Concentrações de Fitorreguladores Médias (NBE) 2,5 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN 4,78b 3,0 mg.l -1 BAP + 3,0 mg.l -1 KIN 5,21a 3,5 mg.l -1 BAP +3,5 mg.l -1 KIN 4,27c 4,0 mg.l -1 BAP + 4,0 mg.l -1 KIN 3,21d 4,5 mg.l -1 BAP + 4,5 mg.l -1 KIN 2,83e 1. Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. Observou-se também que os meios sem adição das citocininas BAP e KIN, não induziram a formação de multibrotações, pois o parâmetro NBE foi considerado apenas acima de dois brotos por explante para o superbrotamento. O desdobramento da interação para os diferentes complexos vitamínicos em cada concentração de fitorreguladores, evidenciado 155
pelo teste de Tukey, Tabela 4, demonstra que em concentrações mais baixas (2,5e 3,0 mg.l - 1 de BAP e KIN) o meio MS destacou-se. Em contra partida, para concentrações mais elevadas (3,5; 4,0; e 4,5 mg.l -1 de BAP e KIN), o meio com sais de MS acrescido de vitamina s do meio LS destacou-se. Observase também, que no meio com sais de MS acrescido de vitaminas do meio B5 não proporcionou resultados superiores aos demais. Tabela 4- Resultado das comparações múltiplas para o desdobramento dos complexos vitamínicos em cada concentração de fitorregulador. Concentrações de Vitaminas/Médias(NBE) 1 Fitorreguladores Sais de MS+ Meio MS Sais de MS + Vit. B5 Vit. LS 2,5 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN 4,69b 6,07a 3,89c 3,0 mg.l -1 BAP + 3,0 mg.l -1 KIN 4,20b 6,29a 4,86b 3,5 mg.l -1 BAP +3,5 mg.l -1 KIN 3,50b 3,73b 5,59a 4,0 mg.l -1 BAP + 4,0 mg.l -1 KIN 2,76b 2,66b 4,20a 4,5 mg.l -1 BAP + 4,5 mg.l -1 KIN 2,56b 1,93b 3,99a 1. Médias seguidas das mesmas letras na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. Amaral (2005), estudando alguns fatores que influenciam a organogênese, bem como a regeneração in vitro de alfavaca (Ocimum selloi Benth), visando fornecer subsídios à transformação genética, analisou o efeito de concentrações de sais no cultivo in vitro de segmentos caulinares nodais desta espécie, constatou que a concentração de 100% de sais de MS combinada com a concentração de 2% de glucose foi mais promissora, em razão de se ter obtido brotos mais longos e com raízes grandes, resultando em maior peso do material vegetal. Segundo Alves et al., (2004), o processo de organogênese é complexo, com atuação de múltiplos fatores externos e internos, envolvendo interação entre fonte de explante meio de cultura e fatores do ambiente. 4 CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos, o tratamento que proporcionou uma melhor capacidade organogênica foi o meio com sais de MS acrescido de vitaminas do meio LS. O meio MS, suplementado com 3,0mg.L -1 de BAP e 3,0mg.L -1 de KIN apresenta efeito diferencial e promissor no superbrotamento in vitro do explante gema cotiledonar. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALVES, E. C. S. de C.; XAVIER, A.; OTONI, W. C. Organogênese de explante foliar de clones de eucalyptus grandis e e. urophylla. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, Brasília, v. 39, n. 5, p. 421-430, 2004. AMARAL, C. L. F., Morfogênese in vitro e transformação genética de alfavaca (Ocimum selloi Benth). São Paulo, 2005. Disponível em: http://www.teses.usp.br. Acesso em : 20 de nov. de 2008. FERREIRA, M. E.; CALDAS, L. S.; PEREIRA, E. A. Aplicações da cultura de tecidos no melhoramento genético de plantas. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI / Embrapa-CNPH,1998. v.1., p.21-43. FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão 4.0. In: 45 O REUNIÃO ANUAL DA REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA. Junho 2000, São Carlos: UFSCas, 2000. p. 255-258. 156
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