PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS

PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS Disciplinas de Investigação do Mestrado Integrado em Medicina Orientador responsável (docente ou investigador doutorado da FMUC): Prof. Doutora Ana Cristina Carvalho Rego Colaboração: Dr. Ana Isabel Duarte Centro/Serviço/Instituto: Instituto de Bioquímica EMAIL: acrego@cnc.cj.uc.pt; anaimduarte@gmail.com Área Temática do Projecto:Neurociências, neurotoxicidade/neuroprotecção. Duração do projecto: Um ano, com possibilidade de continuação ao longo do curso. (indicar especificamente se o projecto é susceptível de ser continuado ao longo do tempo do curso) Financiamento: Sim x Não Agência Financiadora: Fundação para a Ciência e a Tecnologia Exigência de competências prévias aos alunos? Sim Não x Quais? (não aplicável a alunos do 1º e 2º anos do mestrado integrado) 1.1 Título do projecto: Papel neuroprotector da insulina e IGF-1 num modelo celular de diabetes associado à doença de Huntington Resumo (Max. de 300 palavras): A diabetes mellitus parece estar envolvida na doença de Huntington (DH), uma patologia causada por uma mutação na huntingtina (Htt), uma proteína ubíqua de 350 kda. O decréscimo na síntese e secreção de insulina parecem estar na origem da intolerância à glucose associada à DH. A insulina e o IGF-1 (insulin-like growth factor-1) têm sido associados à neuroprotecção contra o stresse. Adicionalmente, o IGF-1 protege contra os efeitos deletérios da Htt

mutante. No entanto, pouco se sabe acerca da protecção induzida pela insulina ao nível do metabolismo energético e neurodegenerescência em neurónios de DH. Nesta perspectiva, este projecto tem como objectivo analisar a neuroprotecção pela insulina e IGF-1 contra as alterações do metabolismo da glucose e viabilidade celular em neurónios de estriado imortalizados (STHdh Q7/Q7, wild-type, e STHdh Q111/Q111, mutantes, obtidos de ratinhos knock-in para a DH), que serão submetidos a hiperglicémia. Pretende-se que o aluno aprenda a manipular neurónios estriatais imortalizados em cultura e que contacte com as diferentes metodologias para avaliar as alterações metabólicas e de viabilidade neuronal, nomeadamente imunocitoquímica, imunoprecipitação, western blotting e real-time RT-PCR. Adicionalmente, o aluno realizará experiências de espectrofluorimetria e espectrocolorimetria e cromatografia líquida de elevada pressão (HPLC), no sentido de clarificar o efeito protector da insulina e IGF-1 nas alterações metabólicas associadas à hiperglicémia. Uma vez que o cérebro depende do metabolismo da glucose, este estudo permitirá avaliar se o restabelecimento das vias de sinalização desencadeadas pela insulina/igf-1 previne o stresse metabólico e a perda de viabilidade neuronal associados à DH, prevenindo a neurodegenerescência, diabetes e a morte prematura associada a esta patologia. (área, importância, meios, metodologias, etc.) Objectivos (Max de 500 palavras): A DH é a doença neurodegenerativa poliglutamínica mais devastadora, afectando 4-8/100000 indivíduos [1]. É uma doença hereditária, autossómica dominante, que se manifesta cerca dos 40 anos de idade, culminando na morte 15-20 anos depois [2]. Clinicamente, caracteriza-se por movimentos coreáticos, rigidez, convulsões, demência progressiva, instabilidade emocional e caquexia [3]. Neuropatologicamente, ocorre degenerescência progressiva e morte dos neurónios espinhosos médios (GABAérgicos) no estriado, núcleo caudado (precedida de alterações no metabolismo da glucose), córtex cerebral e hipotálamo [4,5]. A DH resulta da expansão anómala (>39 repetições) de resíduos de poliglutamina (poliq) no terminal amínico, codificados pelo trinucleótido CAG no exão-1 do gene htt [6]. A toxicidade da Htt mutante resulta da clivagem e acumulação dos fragmentos contendo poliqs, originando agregados intranucleares, citoplasmáticos e neuríticos, envolvidos na morte neuronal [3,7]. A acumulação destas inclusões no pâncreas parece impedir a secreção de insulina [7], conduzindo à diabetes e intolerância à glucose na DH [8]. Apesar de 2

manterem o apetite, os doentes de Huntington apresentam uma perda de peso (caquexia) [9]. Recentemente, relacionou-se a morte neuronal associada à DH com a inibição da glicólise em astrócitos estriatais [10]. A expressão dos IR e IGF-1R tem sido demonstrada em neurónios do córtex cerebral, bolbo olfactivo, hipotálamo, cerebelo, hipocampo, amígdala e estriado [11,12]. A insulina liga-se ao IR com maior afinidade que o IGF-1, enquanto o IGF-1R liga preferencialmente IGF-1 [13]. Desta ligação resulta a activação de vias de sinalização intracelulares envolvidas na regulação do transporte e metabolismo da glucose [14], crescimento e diferenciação neuronais [15], neuromodulação [14] e neuroprotecção [16,17]. Recentemente, demonstrámos que a neuroprotecção da insulina contra o stresse oxidativo poderá resultar da estimulação das vias de sinalização da cinase-3 do inositol-fosfato (PI-3K)/Akt e cinase regulada extracelularmente (ERK) e pela inibição da cinase-3β da sintetase do glicogénio (GSK-3β), modificando a síntese de proteínas relacionadas com as defesas antioxidantes, o metabolismo da glucose e a apoptose neuronal [16-18]. Evidências recentes sugerem que o IGF-1 poderá proteger contra a morte neuronal associada à DH através da activação da Akt [3,19]. Adicionalmente, a activação do insulin receptor substrate-2 (IRS-2) parece proteger contra a agregação da Htt, provavelmente através da clearance da Htt mutante, num processo mediado pela activação da PI-3K [20,21]. Nesta perspectiva, a insulina e IGF-1 poderão constituir potenciais estratégias terapêuticas contra a DH. Esta hipótese parece ser reforçada pela observação que a insulina inibe os movimentos coreáticos [4] e modula a transmissão sináptica GABAérgica (afectada na DH) em condições de stresse oxidativo e/ou diabetes [22,23]. Com este projecto pretende-se que o aluno investigue o papel neuroprotector da insulina e IGF-1 nas alterações metabólicas e de viabilidade neuronal em neurónios de estriado imortalizados obtidos de ratinhos knock-in para a DH, submetidos a hiperglicémia. Dado que o cérebro depende essencialmente do metabolismo da glucose, o restabelecimento das vias de sinalização mediadas pela insulina/igf-1 poderá proteger os neurónios contra o stresse metabólico e a perda de viabilidade associados à DH, prevenindo a neurodegenerescência, a diabetes e a morte prematura associadas a esta patologia. 3

Plano de trabalhos (Max de 1500 Palavras): Fase I - Introdução à investigação científica Duração Setembro a Dezembro de 2007. Nesta fase pretende-se que o aluno se integre num projecto de investigação básica em curso no nosso laboratório e que entenda as bases dessa linha de investigação. Assim, o aluno aprenderá a pesquisar bibliografia relacionada com o tema, utilizando a PubMed, b-on e Encyclopedia of Life Sciences, e também revistas e livros da especialidade. O aluno aprenderá ainda a analisar e discutir criticamente artigos científicos, bem como a preparar apresentações em suporte informático (powerpoint), pois terá de apresentar regularmente artigos ou os seus resultados nas reuniões semanais de grupo. Com vista a uma melhor consolidação dos conhecimentos, propomos que o aluno escreva uma pequena monografia (máximo 5 páginas A4 e 20 referências bibliográficas) acerca do tema, que serivirá de base para a Introdução do relatório final. Paralelamente, o aluno iniciará o contacto com o projecto que irá desenvolver, através do desenho, com o apoio de um investigador doutorado, das experiências laboratoriais. Ainda nesta fase, o aluno tomará conhecimento das regras de funcionamento e segurança no laboratório. Fase II - Protecção da insulina e IGF-1 contra as alterações metabólicas e morte celular em neurónios estriatais imortalizados submetidos a hiperglicémia Duração Janeiro a Maio de 2008. A morte neuronal associada à DH parece ocorrer por apoptose, observada quer em doentes quer em modelos animais da patologia [24]. No entanto, Ruan et al. [25] observaram que, apesar de os neurónios estriatais wild-type sofrerem apoptose, os de ratinhos knock-in (STHdh Q111/Q111 ) para a DH morrem por um processo não apoptótico quando submetidos à inibição do complexo II da cadeia respiratória mitocondrial II, provavelmente devido a uma sobrexposição das mitocôndrias a cálcio, à abertura do poro de permeabilidade transitória e consequente despolarização da mitocôndria. Estes resultados estão de acordo com o défice dos complexos II, III e IV da cadeia respiratória mitocondrial descrito em cérebros de doentes post mortem [26]. Adicionalmente, outros autores mostraram recentemente que a capacidade de tamponização do cálcio mitocondrial se encontra afectada em neurónios estriatais STHdh Q111/Q111. No entanto, outros autores descreveram que o decréscimo da produção de ATP associado ao tratamento de 4

neurónios estriatais STHdh Q111/Q111 com ácido 3-nitropropiónico (inibidor do complexo II) não era acompanhado de alterações dos complexos mitocondriais [27]. Tem sido postulado que o decréscimo precoce do metabolismo da glucose e da produção de energia poderá estar subjacente à disfunção mitocondrial e morte neuronal associadas à DH [10]. No entanto, outros estudos mostraram um aumento dos níveis de lactato no córtex cerebral e gânglios da base na DH e, assim, a estimulação da glicólise poderia constituir um mecanismo de compensação face à redução da produção de ATP pela fosforilação oxidativa [28]. Curiosamente, existe uma elevada incidência de diabetes e anomalias da tolerância à glucose na DH [8]. Tal facto poderá advir de um défice na secreção de insulina resultante da acumulação de inclusões intranucleares no pâncreas [7]. Curiosamente, os pacientes de Huntington mantêm o apetite mas sofrem uma perda acentuada de peso (caquexia) [9]. Ao nível do sistema nervoso central, a insulina tem sido envolvida na regulação da actividade cerebral, nomeadamente no transporte e metabolismo da glucose cerebral e periférica [14], na promoção do crescimento e diferenciação neuronais [15], na neuromodulação [14] e na neuroprotecção [16,17]. Com efeito, demonstrámos recentemente que a insulina poderá exercer um papel neuroprotector em condições de stresse oxidativo através da estimulação das vias de sinalização da PI-3K/Akt e ERK e pela inibição da GSK-3β, modificando a síntese de proteínas associadas às defesas antioxidantes, metabolismo da glucose e protecção contra a apoptose neuronal [16-18]. Desta forma, a insulina estimula a captação e metabolismo da glucose, aumentando os níveis energéticos e de adenosina intracelular [17], que pode ser convertida em ácido úrico [16], um importante antioxidante intracelular. Evidências recentes sugerem que a insulina e o IGF-1 poderão constituir potenciais estratégias terapêuticas contra a DH. Verificouse que o IGF-1 previne a disfunção neuronal através do aumento dos níveis e actividade da Akt [3,19]. Além disso, a agregação da Htt parece ser prevenida pela activação do IRS-2, num processo mediado pela activação da PI-3K [20,21]. Esta hipótese parece ser reforçada pela observação que a insulina inibe os movimentos coreáticos [4] e modula a transmissão sináptica GABAérgica (afectada na DH) em condições de stresse oxidativo e/ou diabetes [22,23]. As linhas celulares STHdh Q7/Q7 (wild-type) e STHdh Q111/Q111 (mutantes) têm sido consideradas modelos particularmente úteis para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos da DH. Estas linhas celulares derivam de neurónios do estriado de ratinhos knock-in para a DH, tendo sido estabelecidas por Marcy MacDonald e 5

colaboradores [29]. As células STHdh Q111/Q111 expressam níveis endógenos da Htt mutante com uma expansão de 111 glutaminas, tornando-se um modelo da doença geneticamente preciso. Além disso, sendo o estriado a região cerebral mais afectada na DH, a origem estriatal destas linhas celulares torna-as indicadas para os estudos da patologia [27]. Nesta fase do trabalho, o aluno aprenderá a trabalhar com culturas de linhas celulares de neurónios estriatais STHdh Q7/Q7 (wild-type) e STHdh Q111/Q111 (mutantes), que serão submetidas a um estímulo hiperglicémico (35 mm glucose) durante 2h. Seguidamente, o aluno aprenderá a estabelecer as condições experimentais necessárias à prossecução do trabalho, nomeadamente a concentração e tempo de pré-tratamento com insulina e IGF-1 com efeito neuroprotector contra a hiperglicémia induzida num modelo neuronal de DH (e sem efeitos tóxicos per se). Para tal, realizar-se-ão curvas de tempo- e dose-resposta para analisar o efeito neuroprotector do prétratamento com insulina ou IGF-1 (1-10 nm, 24-48h). Assim, avaliar-se-á o papel da insulina e IGF-1 na viabilidade neuronal em condições de hiperglicémia, mediante a determinação da libertação da enzima desidrogenase do lactato (LDH) para o meio extracelular e por marcação com a sonda fluorescente iodeto de propídio (associados à perda de integridade da membrana celular), bem como a condensação/fragmentação de DNA (sonda fluorescente Hoechst 33342). Para analisar se a hiperglicémia induz apoptose nestas células e eventual papel anti-apoptótico da insulina/igf-1, determinar-se-á a actividade das caspases-3, -8 e -9, utilizando substratos específicos e anticorpos contra a forma activa das caspases. Uma vez estabelecidas as concentrações e tempos de tratamento com insulina e IGF-1 em que se observa neuroprotecção, clarificarse-á o do efeito protector da insulina e IGF-1 nas alterações metabólicas associadas à hiperglicémia nas células STHdh Q7/Q7 e STHdh Q111/Q111. Nesse sentido, determinar-se-á a acumulação intracelular de glucose (através da determinação da captação de 2- [ 3 H]-D-desoxiglucose). Quantificar-se-ão ainda os níveis intracelulares de piruvato e lactato (com recurso a kits apropriados), bem como os níveis intra- e extracelulares de nucleótidos de adenina (ATP, ADP e AMP) e de adenosina, por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Espera-se que a hiperglicémia induza alterações no metabolismo da glucose (nomeadamente na glicólise) e nos níveis energéticos das células do estriado STHdh Q111/Q111, culminando na disfunção e morte neuronal. Em contrapartida, esperamos que a insulina e o IGF-1 previnam algumas destas alterações, exercendo desta forma um papel protector contra a hiperglicémia associada à DH. 6

Fase III Elaboração de um relatório final e avaliação Duração Junho de 2008 Após a conclusão do trabalho experimental, o aluno terá de elaborar um relatório na forma de um pequeno artigo científico. O aluno terá ainda que apresentar os seus resultados finais numa reunião do Serviço. A avaliação terá como base a: - Elaboração do relatório em formato de artigo científico (35%) - Apresentação oral e discussão dos resultados obtidos (35%) - Execução experimental durante o ano lectivo (30%) (fases, objectivos, metodologias, resultados de cada fase, calendarização, etc.) Competências específicas do projecto a adquirir pelo aluno: Após este projecto científico, o aluno deverá ser capaz de: pesquisar e analisar criticamente bibliografia científica, sistematizar os conceitos aprendidos, formular uma hipótese científica e elaborar um projecto científico para testar a sua hipótese. O aluno deverá ser ainda capaz de identificar experiências relevantes para o trabalho, devendo saber preparar soluções químicas, manipular culturas de linhas celulares e aprender a utilizar as diferentes técnicas e aparelhos disponíveis num laboratório de investigação científica. Paralelamente, o aluno deverá saber analisar estatisticamente os resultados obtidos e apresentar os mesmos em gráficos e tabelas, interpretando-os e discutindo-os de forma crítica, integrando-os no estado actual do conhecimento. Finalmente, o aluno deverá ser capaz de escrever uma pequena monografia e um artigo científico, bem como elaborar apresentações em powerpoint e expôr oralmente os resultados obtidos. Bibliografia: [1] Blum D, Hourez R, Galas M-C, Popoli P, Schiffmann SN. Adenosine receptors and Huntington s disease: implications for pathogenesis and therapeutics. Lancet Neurology 2:366 374, 2003. [2] Cattaneo E, Zuccato C, Tartari M. Normal huntingtin function: an alternative approach to Huntington's disease. Nat Rev Neurosci 6:919-930, 2005. [3] Colin E, Regulier E, Perrin V, Durr A, Brice A, Aebischer P, Deglon N, Humbert S, Saudou F. Akt is altered in an animal model of Huntington's disease and in patients. Eur J Neurosci 21:1478-1488, 2005. [4] Schulingkamp RJ, Pagano TC, Hung D, Raffa RB. Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications. Neurosci Biobehav Rev 24:855 872, 2000. 7

[5] Chong ZZ, Li F, Maiese K. Oxidative stress in the brain: Novel cellular targets that govern survival during neurodegenerative disease. Prog Neurobiol 75:207 246, 2005. [6] Gusella JF, Wexler NS, Conneally PM, et al. A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington s disease. Nature 306:234 238, 1983. [7] Andreassen OA, Dedeoglu A, Stanojevic V, Hughes DB, Browne SE, Leech CA, Ferrante RJ, Habener JF, Beal MF, Thomas MK. Huntington's disease of the endocrine pancreas: insulin deficiency and diabetes mellitus due to impaired insulin gene expression. Neurobiol Dis 11:410-424, 2002. [8] Lüesse H-G, Schiefer J, Spruenken A, Puls C, Block F, Kosinski CM. Evaluation of R6/2 HD transgenic mice for therapeutic studies in Huntington s disease: behavioral testing and impact of diabetes mellitus. Behav Brain Res 126:185-195, 2001. [9] Pratley RE, Salbe AD, Ravussin E, Caviness JN. Higher sedentary energy expenditure in patients with Huntington s disease. Ann Neurol 47:64 70, 2000. [10] Powers WJ, Videen TO, Markham J, McGee-Minnich L, Antenor-Dorsey JV, Hershey T, Perlmutter JS. Selective defect of in vivo glycolysis in early Huntington s disease striatum. Proc Natl Acad Sci USA 104:2945 2949, 2007. [11] Zhao W, Chen H, Xu H, Moore E, Meiri N, Quon MJ, Alkon D. Brain insulin receptors and spatial memory. Interrelated changes in gene expression, tyrosine phosphorylation, and signalling molecules in the hippocampus of water maze trained rats. J Biol Chem 274:34893 34902, 1999. [12] Garcia-Segura LM, Rodriguez JR, Torres-Aleman I. Localization of the insulin-like growth factor I receptor in the cerebellum and hypothalamus of adult rats: an electron microscopic study. J Neurocytol 26:479-490, 1997. [13] Conejo R, Lorenzo M. Insulin signaling leading to proliferation, survival, and membrane ruffling in C2C12 myoblasts. J Cell Physiol 187:96-108, 2001. [14] Gasparini L, Xu H. Potential roles of insulin and IGF-1 in Alzheimer s disease. 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J Biol Chem 280:22021 22028, 2005. [20] Ravikumar B, Vacher C, Berger Z, Davies JE, Luo S, Oroz LG, Scaravilli F, Easton DF, Duden R, O Kane CJ, Rubinsztein DC. Inhibition of mtor induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nature Genet 36:585-595, 2004. [21] Yamamoto A, Cremona ML, Rothman JE. Autophagy-mediated clearance of huntingtin aggregates triggered by the insulin-signaling pathway. J Cell Biol 172: 719 731, 2006. [22] Duarte AI, Santos MS, Seiça R, Oliveira CR. Insulin affects synaptosomal GABA and glutamate transport under oxidative stress conditions. Brain Res 977:23 30, 2003. [23] Duarte AI, Santos MS, Seica R, Oliveira CR. Oxidative stress affects synaptosomal gammaaminobutyric acid and glutamate transport in diabetic rats: the role of insulin. Diabetes 53:2110-2116, 2004. [24] Kiechle T, Dedeoglu A, Kubilus J, Kowall NW, Beal MF, Friedlander RM, Hersch SM, Ferrante RJ. Cytochrome C and caspase-9 expression in Huntington s disease. Neuromol Med 1:183 195, 2002. [25] Ruan Q, Lesort M, MacDonald ME, Johnson GVW. Striatal cells from mutant huntingtin knock-in mice are selectively vulnerable to mitochondrial complex II inhibitor-induced cell death through a nonapoptotic pathway. Human Mol Genet 13:669 681, 2004. [26] Browne SE, Bowling AC, MacGarvey U, Baik MJ, Berger SC, Muqit MM, Bird ED, Beal MF. Oxidative damage and metabolic dysfunction in Huntington's disease: selective vulnerability of the basal ganglia. Ann Neurol 41:646 653, 1997. [27] Milakovic T, Quintanilla RA, Johnson GVW. Mutant huntingtin expression induces mitochondrial calcium handling defects in clonal striatal cells: functional consequences. J Biol Chem 281:34785 34795, 2006. [28] Jenkins BG, Koroshetz WJ, Beal MF, Rosen BR. Evidence for impairment of energy metabolism in vivo in Huntington's disease using localized 1H NMR spectroscopy. Neurology 43:2689 2695, 1993. [29] Trettel F, Rigamonti D, Hilditch-Maguire P, Wheeler VC, Sharp AH, Persichetti F, Cattaneo E, MacDonald ME. Dominant phenotypes produced by the HD mutation in STHdh (Q111) striatal cells. Hum Mol Genet 9:2799 2809, 2000. 8