BIOLOGIA MOLECULAR NAS HEPATITES B e C

BIOLOGIA MOLECULAR NAS HEPATITES B e C XV WORKSHOP INTERNACIONAL DE HEPATITES VIRAIS DE PERNAMBUCO IV SIMPÓSIO DE TRANSPLANTE HEPÁTICO E HIPERTENSÃO PORTA BRASIL/INGLATERRA 2011 André Castro Lyra Prof. Adjunto e Livre Docente da Univ. Federal da Bahia Coordenador do Serviço de Gastro-Hepatologia do Hospital São Rafael

O VÍRUS DA HEPATITE C

Biologia Molecular do Vírus da Hepatitis C Vírus com uma única fita de RNA positiva com envelope de lipídio Tamanho do genoma: 9.5 Kb Família Flaviviridae Partículas virais de 50-75 nm Partículas virais de baixa densidade (1.03 g/ml) são mais infecciosas; partículas de alta densidade (1.20 g/ml), menos infecciosas

Estrutura do Genoma do VHC 81 bp HVR1 5 UTR NS4a 3 UTR C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b Estruturais Não-estruturais

Região Não-codificante 5 (5 UTR) 341 nucleotídeos Altamente conservada É a suposta região do IRES (internal ribosome entry site) Alvo de testes diagnósticos HCV-RNA por PCR Genotipagem por RFLP 5 UTR NS4a C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b 3 UTR Estruturais Não-estruturais

Região aberta para leitura (ORF) Codifica uma grande poliproteína Processada em 10 polipeptídeos Processamento mediado pelo hospedeiro: core, E1, E2, NS2 Processamento mediado pelo vírus: NS3, NS4, NS5 5 UTR NS4a C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b 3 UTR Estruturais Não-estruturais

Proteínas estruturais Proteína do capsídeo/core Ligação com RNA viral Indução de esteatose em camundongos transgênicos Indução de CHC? Quantificação do core por Elisa se correlaciona com níveis séricos de RNA 5 UTR NS4a C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b 3 UTR Estruturais Não-estruturais

Proteínas estruturais Duas proteínas do envelope (E1, E2) 31 kd and 70 kd Inclui a HVR1 - epitopos neutralizantes Escape imunológico Ligação com membranas celulares E1 - Padrão-ouro para genotipagem por sequenciamento para a aplicação clínica 5 UTR NS4a C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b 3 UTR Estruturais Não-estruturais

Vírus C da Hepatite Região Hipervariável (HVR1) 81 bp nt 1491 HVR1 1571 5 UTR NS4a 3 UTR C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b Estruturais Não-estruturais

Ligação do VHC com a CD81 CD81 é uma proteína de superfície celular A alça extracelular principal é altamente conservada em humanos e chimpanzés CD81 expressa em hepatócitos e linfócitos Proteína E2 do envelope do VHC se liga especificamente ao CD81 5 UTR NS4a C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b 3 UTR Estruturais Não-estruturais

Proteínas Não-estruturais NS2 Protease de cisteína - cliva NS2/3 NS3 70 kda Protease de serina NTPase/helicase NS4A Proteína pequena (8 kda) co-fator NS4B Proteína de 27 kda, inibição da tradução de proteínas celulares? 5 UTR NS4a C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b 3 UTR Estruturais Não-estruturais

Três Domínios da Helicase do HCV-RNA:

HCV Protease

NS5A Fosforilada Função? Interação com PKR? Mutações adaptativas? interferon-sensitivity determining region (ISDR) NS5B Proteínas Não-estruturais motif GDD característico de RNA-polimerase RNA dependente Genotipagem por sequenciamento (Padrão-Ouro) ou RFLP para a aplicação clínica 5 UTR NS4a C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b 3 UTR Estruturais Não-estruturais

New Antiviral Targets C E1 E2 p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B NS3 Protease domain NS3 Helicase domain NS3 Bifunctional protease / helicase NS5B RNA-dependent RNA polymerase

Região não codificante 3 3 UTR Consiste de: Área não conservada Cauda poly(u) Elemento conservado de 98 bp Estrutura secundária muito estável? importante para a iniciação da da replicação da fita RNA negativa 5 UTR NS4a C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b 3 UTR Estruturais Não-estruturais

Resumo Alvos da terapia antiviral para o VHC Ribozimas Antisense Ligação CD81 Inibidores da Protease, Helicase Inibidores da RNA Polimerase 5 UTR 3 UTR C E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b Estruturais Não-estruturais

Variabilidade Genética do VHC

Diversidade Genética do VHC Graus de diversidade Genotipos (1 a 6) 31-35% Subtipos 20-23% Quasispecies 1-9%

Definição de Quasispecies População de variantes do VHC diferentes, porém muito relacionadas, as quais diferem entre si por apenas poucos nucleotídeos nos seus genomas, sendo observadas em um único indivíduo infectado.

Quasispecies do VHC #cd-0-8 TTG ATT GTG TTG CTA CTC TTT ACC GGC GTT #cd-0-7......... C.A.................. #cd-0-6..............g............... #cd-0-5.............................. #cd-0-4..............g............... #cd-0-3..............g............... #cd-0-2..............g............... #cd-0-1..............................

Vírus da Hepatite B Vírus DNA, dupla fita, genoma de 3,2 kb; envelope Família Hepadnaviridae Tamanho: 42nm 4 (ORFs) regiões abertas para leitura: S, C, P e X

Genoma do vírus da hepatite B e seus produtos antigênicos PréS1 PréS2 (-) S (+) Produtos Gene C 5 5 Gene P AgHBs DNA Polimerase AgHBx AgHBc/ AgHBe Gene X

Vírus da Hepatite B Genótipos: A-G (divergência de pelo menos 8% nos genomas) Genótipo H (Arauz-Ruiz P; J Gen Virol 2002) Subtipos: adr, adw, ayr, ayw Sorotipos: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, adrq- Chu & Lok, Gastroenterology 2002

Métodos de Genotipagem Região pré-s ou S Sequenciamento direto RFLP Line probe Elisa

Global Distribution of the 8 HBV Genotypes A, B, C, D, G H, F G A, D, E A D D B, C A,D, F, B,C A, B, C, D Arauz-Ruiz P, et al. J Gen Virol. 2002;83:2059-2073. Bell SJ, et al. J Clin Virol. 2005;32:122-127. Chu CJ, et al. Gastroenterology. 2003;125:444-451. Kidd-Ljunggren K, et al. J Gen Virol. 2002;83:1267-1280. Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2004;2:87-106.

Prevalence (%) Prevalence (%) HBV Genotype Prevalence in the US (2001-2002) Nationwide study of 694 consecutive chronic HBV-infected patients seen at 17 US liver centers Prevalence of HBV genotypes Prevalence of HBV genotypes by place of birth/ethnicity 100 80 60 40 20 0 34.7 A 22 B 30.8 C 10.4 D 0.4 0.6 1.1 E F G 100 80 60 40 20 0 China 78 Taiwan 64 60 61 Korea Vietnam 35 32 32 14 2 0 6 3 1 0 2 5 A B C D Chu CJ, et al. Gastroenterology. 2003;125:444-451.

Genótipos do HBV no Brasil Autor/ano n Região Genótipos Araújo, 2004 119 multicêntrico A (78%) Sitnik, 2004 103 multicêntrico Conde, 2004 51 Leste Amazônia A (89,1%) A (49,5), B (2,9%), C (13,6%), D (24,3%) e F (9,7%) Rezende, 2005 50 D (56,5%), A (41,3%), F (2,2%) Ribeiro, 2006 76 Bahia A (87%), F (11%), B (2%) Melo, 2007 303 multicêntrico Gouveia, 2008 (HBV-HDV) 17 Leste Amazônia A (100%) A (48,5%), D sul (84,3%) e centro (47,6%), F (13%) Bottecchia, 2008 32 multicêntrico A (75%), D (9,3%), F (3%), C (1%)

Mutações Mutações que resultam em expressão do HBeAg Mutações que resultam em resistência antiviral Precore e promotor do core Gene da polimerase

Características dos genótipos do HBV A freqüência das mutações nas regiões pré-core e promotor do core promoter varia de acordo com os genótipos do HBV Genótipo Comprimento do genoma (nucleotídeos) Mutação pré-core G1896A Mutações core promoter A1762T e G1764A A 3221 rara comum B 3215 comum comum C 3215 comum comum D 3182 comum comum E 3212 intermediária não descrita F 3215 rara não descrita G 3248 muito comum não descrita H 3215 não descrita não descrita Bartholomeusz et al., 204; Wai et al., 2004; Locarnini et al., 2003; Locarnini et al., 2006

Distribuição dos genótipos e subtipos do VHB na hepatite aguda B Salvador-Bahia Lyra et al J Clin Gastroenterol 2005 adw2 (N=35) A F D ayw2 (N=1) ayw3 (N=2) adw4 (N=2)

Distribution of hepatitis B virus genotypes among patients with chronic infection. Ribeiro NR et al. Liv Int 2006. N= 76 pacientes 65 adw2 1 adw2 10 adw4

0.05 71 95 97 95 79 73 99 85 70 70 HBBA-064_97 HBBA-065_96 HBBA-038_ 99 HBBA-150_97 HBBA-207_96 HBBA-307_99 HBBA-004_98 HBBA-011_96 HBBA-355_99 HBBA-128_98 HBBA-106_97 HBBA-120_97 HBBA-197_98 HBBA-005_95 HBBA-155_98 HHVBA X75666 HBBA-297_99 85 HBBA-048_98 HBBA-035_96 HPBSAG J02205 HBBA-340_99 HBBA-018_97 HBBA-130_96 HBBA-103_97 HBBA-126_96 HBBA-033_97 HBBA-132_98 HBBA-313_99 HBBA-350_99 HHVBAMAM X75669 HBBA-085_97 HBBA-315_99 HBBA-139_98 HBBA-248_99 HBBA-143_97 HBBA-171_99 HBBA-023_95 HBBA-104_97 IG29227 AF160501 81 98 88 98 S74815 S74815 HPBADW3 D00331 HPBADW1 D00329 HBU19777 U19777 HHVBCS X75792 HHVBC1 X75667 HHVBBAS X75657 HHVBE4 X75664 HBVPS12SM X77308 HBBA-030_97 HHVBD X75668 HBBA-027_95 HPBHBVAA M32138 HBBA-138_96 HHVBFFOU X75658 HHVBFS X75661 HBVADW4A X69798 HBBA-072_96 HBBA-294_99 WHV M11082 Genótipo A Genótipo G Genótipo B Genótipo C Genótipo E Genótipo D Genótipo F Vírus do Woodchuck

Importância clínica dos genótipos do HBV História natural da hepatite B Soroconversão do HBeAg Resposta terapêutica ao tratamento com análogos? Remissão espontânea do HBsAg Resposta terapêutica ao tratamento com IFNs Fator de risco para a hepatite fulminante Fator de risco independente para o HCC