RIDASCREEN Chlamydia IgG/IgM

RIDASCREEN Chlamydia IgG/IgM N.º do art.: KGM3101 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Alemanha Tel.: +49 61 51 81 02-0 / Fax: +49 61 51 81 02-20

1. Finalidade Para diagnóstico in vitro. O teste RIDASCREEN Chlamydia é um enzima-imuno-ensaio para a detecção de anticorpos IgG ou IgM contra espécies de clamidia no soro humano. O teste deve ser feito no caso de suspeita fundada de uma infecção com clamidias ou para o esclarecimento do estado imunitário. 2. Resumo e explicação do teste No grupo das chlamydias, há três agentes patogênicos encontrados em humanos: Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci e Chlamydophila pneumoniae. Chlamydia trachomatis é o mais comum agente patogênico bacterial transmitido sexualmente e é frequentemente a causa de uma uretrite, cervicite ou salpingite. Os recém-nascidos de mães infeccionadas podem desenvolver uma conjuntivite ou uma pneumonia. Certos serovares causam o lymphogranuloma venereum. Outros servorares são a causa para o Trachom transmitido por infecção da área. Até há poucos anos atrás, Chlamydia pneumoniae era considerada uma sub-espécie de Chlamydia psittaci. Em 1989 foi confirmada a existência desta terceira espécie de Chlamydia. Novas pesquisas levaram à descoberta do próprio gênero Chlamydophila. Dependendo de fatores específicos do hospedeiro, Chlamydophila pneumoniae pode causar doenças graves do aparelho respiratório superior, brônquios e pulmões. Resultados de pesquisa lançam a suspeita da participação de Chlamydophila pneumoniae na asma, doenças pulmonares e outras doenças crônicas. Chlamydophila psittaci é um agente patogênico muito comum em pássaros e mamíferos. Nos humanos, ele aparece raramente e normalmente causa doenças respiratórias. Para o diagnóstico de uma infecção por clamidia é necessário um exame do útero (coleta) ou uma dose do anticorpo do soro. Se o enriquecimento com antígnos for difícil ou se os antígenos só existirem em uma quantidade não detectável, deve-se dar preferência à detecção de anticorpos. Através sa utilização do antígeno LPS (LPS = Lipopolysaccharid) específico da clamidia, são reconhecidos anticoropos contra todas as três espécies simultaneamente. 3. Princípio do teste O LPS limpo é colocado em uma microplaca. Nas amostras dos pacientes, os anticorpos presentes se ligam ao antígeno e são, numa segunda etapa, comprovados com um anticorpo anti-humano marcado com enzima (conjugado). Através da enzima, um substrato sem cor (H 2 O 2 /TMB) é convertido em um produto final azul. A reação enzimática é finalizada com a adição de ácido sulfúrico. Com isso, ocorre simultaneamente a mudança da cor de azul para amarelo. A posterior medição é feita com um fotômetro a 450 nm (comprimento de ondas de referência 620 nm). RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 2

4. Conteúdo da embalagem Os reagentes de uma embalagem são suficientes para 96 doses. Plate 96 doses Microplaca; 12 tiras (divisíveis) no quadro de suporte; revestidas com antígenos LPS de clamidia Diluent 25 ml Tampão de amostra, pronto para o uso; tampão de fosfato tingido de azul; contém estabilizadores de proteína, Neolone e Bronidox Wash 50 ml Tampão de lavagem, (conc. 20X); Tampão de fosfato Control IgG + 500 µl Controle positivo IgG, soro humano, contém Neolone e Bronidox Control IgM + 500 µl Controle positivo IgM, soro humano, contém Neolone e Bronidox Control IgG - 500 µl Controle negativo IgG, soro humano, contém Neolone e Bronidox Control IgM - 500 µl Controle negativo IgM, soro humano, contém Neolone e Bronidox Cut Off IgG 500 µl Controle Cut Off IgG, soro humano; contém Neolone e Bronidox Cut Off IgM 500 µl Controle Cut Off IgM, soro humano; contém Neolone e Bronidox Conjugate IgG 15 ml Conjugado IgG anti-humano, pronto para o uso; anticorpos conjugados com peroxidase em solução de tampão tingida de laranja, contém Neolone e Bronidox Conjugate IgM 15 ml Conjugado IgM anti-humano, pronto para o uso; anticorpos conjugados com peroxidase em solução de tampão tingida de laranja, contém Neolone e Bronidox Substrate 15 ml Substrato, H 2 O 2 / tetrametilbenzidina; pronto para o uso Stop 15 ml Reagente bloqueador, 0.5 M ácido sulfúrico; pronto para o uso 5. Reagentes e a sua armazenação O kit deve ser armazenado de 2-8 C e pode ser utilizado até a data de validade impressa no rótulo. Solução de lavagem diluída pode ser utilizada por no máximo 4 semanas quando armazenadas de 2-8 C ou por 5 dias quando armazenados em temperatura ambiente (20-25 C). A garantia do kit não é válida após o vencimento do kit. O saco de alumínio, no qual a microplaca se encontra, deve ser aberto de um modo que o fecho zipper não seja arrancado. As tiras não necessárias devem imediatamente ser armazenadas em um saco de alumínio a 2 8 C. Após a abertura, as tiras podem ser armazenadas, sob as respectivas condições, por três meses. RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 3

Uma contaminação do reagente deve ser evitada bem como a luz direta sobre o substrato incolor. 6. Reagentes e equipamentos adicionais necessários 6.1. Reagentes água destilada ou deionizada RF-Absorbens (ver ponto 9.3.) 6.2. Equipamento Incubador ou câmera úmida a 37 C Tubos de amostra Mixer Vortex Micropipetas para volumes de 10 100 µl e 100 1000 µl Proveta (1000 ml) Cronômetro Aparelho de lavagem para as microplacas ou pipetas de vários canais Fotômetro para as microplacas (450 nm, filtro de referência 620 nm) Filtro de papel (lenços de laboratório) Contentor para lixo com uma solução de hipocloreto de 0,5 % 7. Medidas de precaução Para diagnóstico in vitro. Este teste só deve ser efetuado pelo pessoal de laboratório instruído. As regras de trabalho nos laboratórios médicos devem ser observadas. As instruções de uso para a execução do teste devem ser estritamente observadas. Não pipetar as amostras ou reagentes com a boca, evitar o contato com a pele ferida ou mucosas. Durante o manejo de amostras, deve usar luvas descartáveis e, após o término do teste, deve-se lavar as mãos. Nas áreas, nas quais se trabalha com as amostras ou com os reagentes do teste, não fumar, comer ou beber. RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 4

Os soros de controle contidos no kit (controle positivo, controle negativo, controle Cutt off) foram testados para HIV e HCV-Ak, bem como HbsAg, e considerados negativos. Porém, eles devem, bem como as amostras de pacientes e todos os materiais que entrem em contato com eles, ser considerados como potencialmente infecciosos e manejados de acordo com as respectivas regras de segurança nacionais. H 2 O 2 (Substrato) pode levar à corrosão. Manusear com cuidado! No caso de contato com a pele, enxaguar com água. O reagente bloqueador contém 1 N ácido sulfúrico. Evitar o contato com a pele e com as roupas! No caso de contato com a pele, enxaguar com água. Todos os materiais e reagentes, que vêm junto com as amostras potencialmente infecciosas, devem ser manejados com desinfetantes adequados ou autoclavadas pelo menos 1 hora a 121 C. CUIDADO: para evitar a formação de gases venenosos, o dejto líquido, que contém reagente bloqueador, deve ser neutralizado, antes que seja colocado em uma solução de hipocloreto. 8. Coleta e armazenagem das amostras O teste é desenvolvido para a análise de amostras de soro humano. Após a coleta de sangue, o soro deve ser rapidamente tirado do coágulo para evitar uma hemólise do soro. As amostras devem ser amazenadas frias ou congeladas até serem usadas para o teste. Deve-se absolutamente evitar um novo congelamente e descongelamento, bem como a contaminação microbial. A utilização de amostras escurecidas, ictéricas, hemolíticas, lipêmicas inativadas do calor pode produzir falsos resultados. Tab. 2: Armazenagem das amostras soro não diluído Soro diluído 2 8 C 20 C 2 8 C 1 semana > 1 semana 7 horas 9. Execução do teste 9.1. Generalidades Antes da utilização, todos os reagentes e as tiras deve ser colocados em temperatura ambiente (20 25 C). As tiras só devem ser retiradas do saco de alumínio após a temperatura ambiente tiver sido alcançada. Os reagentes devem ser misturados imediatamente antes da utilização. Após a utilização, o kit deve ser armazenado novamente a 2 8 C. RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 5

Só deve ser retirada a quantidade de reagente necessária para a execução do teste. O reagente restante não deve ser colocado de volta nos vasos, pois isto pode levar a uma contaminação. As tiras não podem ser usadas mais de uma vez. Os reagentes e as tiras não devem ser utilizadas se a embalagem estiver danificada ou se o vaso não é impermeável. O tampão de amostra, o tampão de lavagem, o substrato e o reagente bloqueador não são específicos para o teste; eles podem também ser utilizados em outros ELISA RIDASCREEN para a detecção de anticorpos contra Chlamydias. 9.2. Fabricação do tampão de lavagem 1 parte do concentrado do tampão de lavagem Wash é misturada com 19 partes de água destilada. Para isso, coloca-se 50 ml do concentrado em um cilindro de mesa de 1000 ml e enche-se com água destilada até chegar a 1000 ml. Cristais eventualmente disponíveis no concentrado devem ser dissolvidos anteriomente com calor (banho-maria a 37 C Solução de lavagem diluída pode ser utilizada por no máximo 4 semanas quando armazenadas de 2-8 C ou por 5 dias quando armazenados em temperatura ambiente (20-25 C). 9.3. Preparação das amostras As amostras de soro a serem examinadas bem como os controles serão diluídas a 1:21 antes do início do teste com o tampão de amostra Diluent. A diluição é feita diretamente na microplaca. O controle Cut Off deve ser feito em dose dupla. Os controles (IgG, IgM), respectivos às doses, devem ser usados. A1 Controle negativo B1 Controle Cut Off C1 Controle Cut Off D1 Controle positivo E1, F1 Soro do paciente 1, 2, etc. Após o inserimento de um número suficiente de cavidades para os controles e a amostras no quadro de suporte, são pipetados, para a dose de IgG, respectivamente 100 µl de tampão de amostra nas cavidades da placa e, depois, é adicionado 5 µl de amostra ou controle. Para a mistura completa, a placa deve ser brevemente agitada: 100 µl de Diluent + 5 µl de soro ou controle RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 6

Para doses de IgM, as amostras devem ser expostas na placa a uma absorção IgG (p. ex. com o RIDA RF-Absorbens, n do art. Z0202) e somente depois são ajustadas com o tampão de amostra com a diluição necessária para o teste. Ao utilizar o RIDA RF-Absorbens o seguinte procedimento deve ser considerado: 1) Colocar 25 µl de RIDA RF-Absorbens nas cavidades para as amostras 2) adicionar 5 µl de soro; misturar 3) depois, colocar 5 µl dos controles nas cavidades respectivas 4) Adicionar 100 µl de Diluent aos controles 5) Adicionar 75 µl de Diluent às amostras; misturar Atenção! Os controles não devem ser absorvidos. 9.4. Primeira incubação Depois a placa será incubada a 37 C por 45 minutos em um incubador ou em uma câmera úmida. O chão das cavidades não deve entrar em contato com os materiais condutores de calor (papel úmido ou metal). A microplaca deve estar tampada durante a incubação. Atenção! A microplaca não deve ser colocada em uma incubadora fria, que só se esquenta até 37 C durante a incubação. A incubadora já deve estar na temperatura de 37 C. 9.5. Lavagem As cavidades devem ser esvaziadas em um contentor de dejetos com solução de hipocloreto para a desinfecção. Depois a placa é batida em papel absorvente para retirar restos de humidade. Então, lava-se 5 vezes, cada vez com 300 µl de tampão de lavagem diluído. Com isso, deve fazer um esvaziamento completo após cada lavagem, batendo em uma parte inutilizada do papel. Com a utilização de uma máquina automática de lavagem, deve-se observar o ajuste correto do equipamento com relação ao tipo de placa utilizado. Depois da lavagem, a placa é batida em papel absorvente para retirar restos de humidade. 9.6. Segunda incubação Adição de 100 µl de conjugado Conjugate IgG ou Conjugate IgM nas respectivas cavidades. Depois a placa é incubada por 30 minutos a 37 C (ver ponto 9.4.). RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 7

9.7. Lavagem Lavar 5 vezes de acordo com o ponto 9.5. 9.8. Terceira incubação Adição de 100 µl do substrato Substrate em todas as cavidades. Depois a placa será incubada a 20 minutos a temperaura ambiente, coberta. Depois, a reação é bloqueada com a adição de100 µl de reagente bloqueador Stop em todas as cavidades. Após a cuidadosa mistura (batida suave na beira da placa) a absorbância é medida em um fotômetro de placa a 450 nm (comprimento das ondas de referência 620 nm). A compensação do valor zero é feita com o ar. A medição deve ser feita dentro de uma hora após a adição do reagente bloqueador. Atenção: ao utilizar uma câmara húmida, para retirar a água condensada, a parte inferior da microplaca deve ser limpa antes da medição. 10. Controle de qualidade Sinais da expiração do reagente Para o controle de qualidade, os controles positivo, negativo e Cut Off devem ser feitos a cada execução de teste. O controle Cut Off é feito em dose dupla e o valor médio é formado de ambas as medições. O teste é validado se o valor de absorbância (O.D.) dos controles estiverem de acordo com os seguintes critérios: Tab. 3. Critérios para o controle de qualidade O.D. Controle negativo < 0,5 Controle positivo > 0,9 Controle Cut Off (valor médio) >0,55 <1,5 Um desvio dos valores necessários, bem como um escurecimento de reagente ou coloração em azul do substrato antes da adição nas cavidades, pode ser uma indicação de expiração do reagente. RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 8

Se os valores prescritos não são alcançados, antes da repetição do teste deve-se controlar o seguinte: Validade dos reagentes utilizados Funcionalidade dos equipamentos utilizados (por ex. calibragem) Execução correta do teste Controle visual dos componentes do kit para verificar se há contaminação ou impermeabilidade; uma solução de substrato tingida de azul não pode mais ser usada Se, após a repetição do teste, as condições não forem alcançadas novamente, entre em contato com o distribuidor R-Biopharm local. 11. Avaliação e interpretação 11.1. Cálculo do índice das amostras 1. O valor médio de absorbância do controle de cut off é calculado. 2. Através da divisão do valor de absorbância das amostras pelo valor médio calculado, obtém-se o índice das amostras. p. ex.: Controle Cut Off 1 O.D. = 0,821 Controle Cut Off 2 O.D. = 0,865 Valor médio = 0,843 Amostra O.D. = 1,508 Índice de amostras = 1,508 0,843 = 1,79 11.2. Resultado do teste Tab. 4: Avaliação do índice das amostras IgG, IgM negativo duvidoso positivo Índice das amostras < 0,9 0,9-1,1 > 1,1 12. Limites do método O ensaio EIA RIDASCREEN Chlamydia indica anticorpos IgG ou IgM contra clamidias. Uma relação entre a altura de um valor de absorbância alcançado e dos sintomas presentes ou altamente clínicos não pode ser ignorada aqui. O teste não é adequado para localizar o local RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 9

da infecção. Os resultados alcançados devem ser interpretados em conjunto com o quadro clínico e outros métodos diagnóstico (p. ex. isolamento do agente patogênico). Um resultado negativo não exclui uma infecção, pois a retirada do soro pode ter sido feita cedo demais, quando od anticoporpos ainda não podem ser comprovados. Se a suspeita clínica continuar, um soro de repetição deve ser examinado depois de duas semanas. Geralmente, para um melhor resultado diagnóstico, nos exames sorológicos dois soros consecutivos de um paciente devem ser paralelamente examinados. Importante para a interpretação de um resultado é o procedimento do título. Resultados de IgG nos recém-nascidos devem ser interpretados com cuidado, pois eles podem ter sido causados por anticorpos maternias. A detecção de anticorpos IgM é útil em bebês menores de seis meses. Através de um título IgG muito alto, podem ocorrer resultados negativos falsos com doses de IgM. Além disso, reultados negativos podem ocorrer com doses de IgM através de fatores reumáticos. Isto pode ser evitado através de uma absorção do soro antes da execução do teste (veja o ponto 9.3). Reações cruzadas com anticorpos contra Chlamydophila psittaci não foram examinadas com o presente teste devido à baixa prevalência desta doença e à falta de amostras positivas. A resposta imunitária com infecção dos olhos com C. trachomatis é baixa. O teste não é validado como adequado para o controle da terapia. O significado do teste nas doenças crônicas em crianças, bem como em pacientes com lymphogranuloma venereum (LGV) e inflamação crônica do útero não foi considerado. Um resultado positivo não exclui a presença de outros agentes patogênicos como causa para uma doença. 13. Características de desempenho Tab. 4: Coeficiente de variação em % da variação inter-ensaio (n=10) Variação inter-ensaio IgG IgM Controle positivo 3,22% 2,62% Controle negativo 10,99% 9,24% Controle Cut Off 5,00% 7,36% RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 10

Tab. 5: Coeficiente de variação em % da variação intra-ensaio (n=10) Variação-intra-ensaio IgG IgM Controle positivo 1,83% 2,16% Controle negativo 6,98% 8,00% Controle Cut Off 6,55% 7,79% Tab. 6: Sensibilidade e especificidade em comparação no teste de microimunofluorescência (MIF) Número de amostras Sensibilidae Especificidade IgG 101 96% 98% IgM 60 92% 100% Além disso, foram examinadas onze amostras de pacientes no teste IgG que estavam infeccionadas com Rickettsia conorii ou outros agentes patogênicos, que causam quadros clínicos similares aos da clamidia (HSV-2, L. pneumophila, C. burnetii, M. pneumoniae). No teste IgM, sete destas amostras foram examinadas bem como dois soropositivos de fatores reumáticos. Nos soros examinados, não foram verificadas reações cruzadas ou resultados ELISA relevantes. RIDASCREEN Chlamydia 2015-11-01 11

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