UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO AF 060- Biotecnologia Vegetal Ácidos Nucleicos e suas propriedades Prof a. Renata FaierCalegario
GENE Conceito: Sequência ordenada de nucleotídeos - DNA Expressão Codifica um produto funcional (proteína ou molécula de RNA)
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR A informação genética: Perpetuada através da replicação do DNA Expressa através de dois processos: Transcrição e Tradução
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR Replicação Transcrição DNA DNA Tradução RNA PROTEÍNA
Composição química: ÁCIDOS NUCLEICOS NUCLEOTÍDEO Base Nitrogenada Fosfato 5 1 3 Açúcar
FOSFATO RNA e DNA 5 Nucleotídeo
AÇÚCAR PENTOSES RNA: Ribose DNA: Desoxirribose
BASES NITROGENADAS Bases Púricas e Pirimídicas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos PURINAS Bicíclicas Adenina Guanina PIRIMIDINAS Monocíclicas Citosina Uracila Timina
BASES NITROGENADAS DNA RNA A C G T A C G U PAREAMENTOS _ A T C G A U
DNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS NUCLEOTÍDEOS Filamento de nucleotídeos 5 Ligação fosfodiéster HO 3 HO 3
DNA : ESTRUTURA Estrutura Plana 2 Filamentos de nucleotídeos 2 pontes H A = T G C 3 pontes H
Extremidade 5 = Fosfato (PO 4 ) DNA: estrutura tridimensional Duas fitas enroladas, complementares entre si e invertidas Cada fita: composta por uma sequência linear de nucleotídeos Estrutura Helicoidal em dupla hélice Leitura e Escrita 5 3 Extremidade 3 = Hidroxila (HO) (Watson & Crick, 1953)
COMO O DNA SE REPLICA? Replicação: capacidade do DNA de originar cópias idênticas (auto duplicação) O processo é dividido em 3 etapas: Etapa Enzima Função 1ª DNA Helicase Desenrola as duas hélices e rompe as pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos => separa fitas 2ª DNA Polimerase Encaixa os nucleotídeos na fita molde 3ª DNA Ligase Realiza a ligação dos nucleotídeos (fragmentos de Okasaki) Primase (RNA polimerase) : confecção de primers para que a DNA polimerase inicie a síntese
DNA : DUPLICAÇÃO Origem de Replicação: regiões ricas em AT = início da replicação DNA polimerase: requer primers para iniciar a síntese (5-3 ) Cadeia líder = fita contínua Helicase Primers Cadeia atrasada DNA Ligase Forquilha de replicação DNA polimerase
DNA : DUPLICAÇÃO Semiconservativa
TRANSCRIÇÃO: DNA => RNA RNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS 1. DNA se abre: RNA polimerase (bolha de transcrição ) 2. Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e uracila) na fita molde de DNA 3. RNA pronto se solta e migra para o citoplasma 4. DNA se recompõe
TRANSCRIÇÃO Enzima responsável: RNA polimerase Início da Transcrição: Região Promotora pequena sequência de nucleotídeos reconhecida pela RNA polimerase como ponto onde deve se ligar ao DNA Exemplos promotores: Região TATA box => -10: 5 -TATAAT- 3 => -35: 5 -TTGACA- 3
Término da Transcrição: TRANSCRIÇÃO RNA polimerase encontra um Terminador Sequência nt que determina o desligamento da RNA polimerase Região com pares consecutivos de A/U Região rica em G+C (dependente de proteína) O complexo de transcrição se dissocia e há liberação da molécula de RNA
RNA : ESTRUTURA RNA: Uma fita simples de nucleotídeos
RNA : ESTRUTURA Bolha de Transcrição
RNA : ESTRUTURA Fita simples, helicoidal Regiões complementares Formando grampos e alças
TIPOS DE RNA RNA mensageiro => informação genética para a sequência de aminoácidos das proteína RNA ribossômico => constituinte dos ribossomos RNA transportador => identifica e transporta os aminoácidos até os ribossomos
TRADUÇÃO Síntese de proteínas Converte trincas de nt RNA => Aminoácidos => Proteína Local: Ribossomos (citoplasma) Início da Tradução: Códon de iniciação => AUG (Metionina) Término da Tradução: Códon de terminação => Não codifica aminoácido Ex: UGA, UAG, UAA
TRADUÇÃO
BIOLOGIA MOLECULAR Possibilita a manipulação de moléculas => introdução de genes em um genoma receptor Depende: Tecnologia do DNA recombinante Enzimas replicar, cortar e ligar o DNA Bases nitrogenadas
DNA RECOMBINANTE Ferramenta permite: Clivar DNA com enzimas de restrição Inserir DNA eucariótico em bactérias Determinar a sequência de nt de um fragmento de DNA Amplificar e sintetizar DNA Recombinar fragmentos de DNA, etc.
Alguns objetivos que a tecnologia do DNA recombinante tornou possível Isolar um gene em particular, parte de um gene ou uma região do genoma; Produzir proteína de interesse em larga escala; Aumentar a eficiência da produção de enzimas e drogas para comercialização; Modificar organismos existentes para que expressem uma característica de interesse que não seja codificada pelo genoma
Plantas tolerantes à Doenças e a Pragas Feijão resistente ao vírus do mosaico dourado e Mamão papaya resistente ao vírus da mancha anelar Milho, algodão, batata (Bt) = resistentes ao ataque de insetos Plantas tolerantes à Herbicidas Soja e Milho (RR) = tolerante ao glifosato Soja = tolerante ao 2,4-D AGRICULTURA Plantas tolerantes ao estresse ambiental (Seca, frio, calor, salinidade e acidez) Cana-de açúcar tolerante à seca Plantas com melhorias nutricionais (vitaminas e aa) Arroz dourado (Golden rice), rico em betacaroteno, precursor da vitamina A - evitar a cegueira noturna e desnutrição
PROPRIEDADES DO DNA DESNATURAÇÃO rompimento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA RENATURAÇÃO reanelamento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA => Fenômenos físicos fundamentais para os processos de replicação e transcrição Esses processos podem ser realizados in vitro
MANIPULAÇÃO DO DNA A Desnaturação pode ser obtida através de: Aumento de temperatura Agentes desnaturantes (formamida e dimetil-sulfóxido) Titulação com ácido ou base Tm ( C) = 69,3 + 0,41 (GC%) Temperatura média de fusão
MANIPULAÇÃO DO DNA A Renaturação pode ser obtida através de: Diminuição lenta de temperatura Resfriamento abrupto: colapso do DNA T (anelamento) ( o C) = Tm 25 o C
MANIPULAÇÃO DO DNA Enzimas => replicar, cortar e ligar Replicação: DNA polimerase e helicase Transcrição: RNA polimerase Corte do DNA: Enzimas de Restrição Ligação de DNA: DNA-ligases Acesso a vários tipos de enzimas: => Tornou possível transferir sequências específicas de DNA de uma molécula para outra
MANIPULAÇÃO DO DNA Enzimas de Restrição Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivar moléculas de DNA exógeno) Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA Reconhecem sequências de 4 a 8 nt Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência das duas cadeias é igual quando for lida de 5 para 3 5... 3......3...5 5......3 3......5
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta) Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com extremidades coesivas > eficiência de ligação
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas: Denominação Origem Sequência de Reconhecimento Abreviação de 3 letras do nome da espécie Seguida da designação da linhagem Número Romano: se mais de uma enzima é produzida
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Isoesquisômeros: enzimas provenientes de organismos diferentes que reconhecem e cortam a mesma sequência de bases
ENZIMAS DE LIGAÇÃO Restabelecem as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos (hidroxila 3 + fosfato 5 ) Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma enzima de restrição O DNA 3 OH + - O P O 5 DNA O - O DNA-Ligase ATP ou NAD Ex: T4 DNA ligase DNA 3 O P O 5 - O DNA
DNA RECOMBINANTE
DNA RECOMBINANTE
DNA RECOMBINANTE
COMO ANALISAR O DNA Eletroforese Método para separar ácidos nucleicos e proteínas Base: mobilidade de partículas em um suporte sólido sob ação de um campo elétrico Separação de acordo com: o tamanho, forma e carga elétrica DNA contém carga negativa => migra para o polo positivo DNA com diferentes tamanhos => migram em velocidades diferentes => formam diferentes bandas
ELETROFORESE Meios de suporte sólido Gel Agarose = agarose (polissacarídeo) => separação de fragmentos pequenos e grandes Gel Acrilamida = acrilamida e bisacrilamida (polímeros) => separação de proteínas ou partículas muito pequenas Visualização das bandas: corantes de DNA Brometo de etídio (carcinogênico e teratogênico) SYBRGreen GelRed Moléculas se ligam ao DNA
ELETROFORESE
ELETROFORESE Fonte Gel - Cuba de eletroforese + Luz UV Gel
ELETROFORESE http://www.jove.com/video/3923/electroforese-em-gel-de-agarose-para-separao-dosfragmentos-de-dna?language=portuguese
SOMATÓRIO DE CONHECIMENTO 1. Amplificação do gene de interesse 2. Digestão do DNA e do plasmídeo com enzima de restrição 3. Ligação dos produtos de DNA e do vetor plasmídeo 4. Transformação da planta 5. Confirmação da presença do DNA na planta transformada Próxima Aula
BIBLIOGRAFIA ZAHA, A. Biologia molecular básica. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 416P