Disciplina: Bioquímica Clínica Curso: Análises Clínicas 3º. Módulo Docente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini

Fundamentos da Espectrofotometria Uma maneira boa de cutucar moléculas, é com radiação eletromagnética (luz) A espectrofotometriafaz parte da classe dos métodos analíticos que baseiam-se na interação da matéria com a energia radiante Boa sensibilidade Baixo custo de análise Fácil operação Equipamentos robustos Luz incidente Luz absorvida Luz emergente Perdas: -reflexões -dispersão -absorção

Fundamentos da Espectrofotometria (a) (b) Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma: (a) esquema e (b) fotografia. Arco-Íris: exemplo de difração de luz produzida na natureza.

Fundamentos da Espectrofotometria Porque ocorre o fenômeno da absorção? Moléculas que apresentam elétrons que podem ser promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia.

Cores de Radiação Região do Visível

Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer Quando uma radiação monocromática passa através de uma solução, uma parte da energia é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é transmitida.

Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer Grandezas: 1- Transmitância 2- Absorbância

Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer Grandezas: 1- Transmitância: quantidade de energia radiante transmitida pela solução. A transmitância é dada pela relação entra a intensidade da radiação transmitida (I) e a intensidade da radiação incidente(io),ouseja,t=i/io. Seuvalorvariadezeroa1(ou0a100%) T=O todaaluzincidenteéabsorvida(i=o) T=1 todaaluzincidenteétransmitida(i=io). 2- Absorbância

Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer Grandezas: 1- Transmitância: 2- Absorbância quantidade de energia radiante absorvida pela solução. A absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente proporcional à concentração da amostra. Para se determinar a concentração de uma determinada solução, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibração), o qual é obtido através da relação entre a concentração e a absorbância de uma solução padrão de concentração exatamente conhecida.

Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer 2-Absorbância Uma vez conhecido o Fator de Proporcionalidade, fica fácil se descobrir a concentração da solução teste. Basta realizar a seguinte equação:

Praticando: 1-Determine o Fator de Proporcionalidade de uma amostra, sabendo: [padrão] = 12,4 g/dl abs. padrão = 0,52

Praticando: 2-Sabendo que o Fator de Proporcionalidade de uma amostra é 22,4. Qual o valor da [padrão] se a abs. padrão for de 0,33?

Lei de Lambert-Beer A espectroscopia de absorção molecular está baseada na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que estão relacionadas através das equações: Io I T= I/Io(%T = 100x T) A = log(1/t) = log(i/io) A=0 T= 1 100% Transmissão A=0,9 T=0,1 10 % transmissão 90% Absorção

Lei de Lambert-Beer A absorbância é muito importante porque ela é diretamente proporcional à concentração de espécies absorventes de luz na amostra.

Partes Essenciais de um Espectrofotômetro Fontes de radiação; Monocromador; Compartimento de amostra; Detector.

Fontes de Radiação Fonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda. Lâmpada de tungstênio: utilizada para região UV próximo e visível Lâmpada de deutério: utilizada para a região do UV

Filtros de vidro: transmitem faixa ampla de comprimento de onda; Prismas: transmitem pequena faixa de onda; Redes de difração: transmitem pequena faixa de comprimento de onda. Sistema Óptico

Cubetasde Medida

Detectores Utilizados para receber a energia radiante transmitida através da solução e transformá-la em energia elétrica.

Espectrofotômetros Feixe Simples Feixe Duplo

Espectrofotômetros com duplo feixe

Análises Quantitativas

Análise Qualitativa Lo og ε 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 D C A ou B 240 250 260 270 280 290 300 Comprimento de onda (nm) C 5 H 11 R OH C 5 H 11 OH (A) (C) OH OH C 5 H 11 R OH OH (B) (D) OH C 5 H 11 OH Espectro de absorção do canabidiol comparado com outros fenóis.