Relatório da disciplina de Biologia Celular 2011/12 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Influência da concentração inicial de etanol na fermentação alcoólica de leveduras Saccharomyces cerevisae Joana Marques 1, João Oliveira 2, Miguel Oliveira 3, Sara Paulo 4 1 joana.amc.marques@gmail.com, 2 johny_eduardex@hotmail.com, 3 miguel_ferreira_oliveira@sapo.pt, 4 sara.lnp@gmail.com Introdução Uma grande variedade de organismos vivos pode utilizar vias metabólicas fermentativas para produzir e obter energia (sob a forma de ATP). Estes processos ocorrem em meios anaeróbios e provocam a degradação de glicose ou outros compostos orgânicos em moléculas mais simples, obtendo energia. O tipo de produto resultante destes processos depende não só do tipo de organismo como também do ambiente em que estão inseridos. Consoante o principal produto obtido, podemos destacar dois tipos de fermentação: a fermentação láctica (produção de ácido láctico), que ocorre, por exemplo, em organismos eucariontes e a fermentação alcoólica (produção de etanol e libertação de CO 2 ), como acontece nas leveduras e em algumas bactérias. No caso da fermentação alcoólica, a partir da quebra de uma molécula de glicose em duas moléculas de piruvato (glicólise), ocorre libertação de energia, sendo parte desta conservada sob a forma de ATP e NADH. As moléculas de piruvato sofrem então descarboxilação, libertando-se dióxido de carbono, e de seguida redução, originando etanol e levando à oxidação de NADH a NAD +, que pode ser novamente utilizado na glicólise. [1] Equação geral da glicólise: Glucose + 2 NAD + + 2 ADP + 2 P i 2 Piruvato + 2 NADH + 2 H + + 2 ATP + 2 H 2 O [1] Equação geral da fermentação alcoólica: C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 [2]
Figura 1: Esquema representativo da fermentação alcoólica. [3] As leveduras degradam a glicose em duas moléculas de piruvato, durante a glicólise, ocorrendo a fosforilação de duas moléculas de ADP em ATP e a redução de duas moléculas de NAD + a NADH. Cada molécula de piruvato é depois convertida, via acetaldeído, numa molécula de etanol e outra de dióxido de carbono, ocorrendo a regeneração de NAD + a partir da oxidação de NADH. O mecanismo de fermentação alcoólica é um processo bastante importante para o Homem, pois tem diversas aplicações no dia-a-dia e a nível industrial, como é o caso do fabrico de pão e a produção de bebidas alcoólicas. Conhecem-se vários factores que podem limitar este processo, entre eles a temperatura, o tipo e a concentração de substrato e a concentração de etanol. Sabe-se que um ambiente com elevadas concentrações de etanol tem um impacto negativo na actividade da fermentação alcoólica, quer pela inibição desta, quer pela sua toxicidade para as leveduras, pois ataca e interfere na estrutura lipídica das membranas. [4] Pretende-se então estudar e determinar especificamente a forma como a variação da concentração de etanol poderá influenciar a actividade da fermentação alcoólica em leveduras Saccharomyces cerevisae, presentes em fermento de padeiro. Relatório da disciplina de Biologia Celular 2011/12 2
Material e Métodos Material Biológico Leveduras desidratadas Saccharomyces cerevisae, provenientes de Maizena. Determinação da actividade da fermentação alcoólica A determinação da actividade de fermentação alcoólica foi feita através da medição do volume de dióxido de carbono (um dos produtos da reacção) libertado e acumulado dentro de cada tubo graduado (Figura 2). Para tal, procedeu-se à pesagem da mesma quantidade de leveduras para cada um dos cinco tubos utilizados e à sua ressuspensão numa pequena quantidade de água. De seguida, foi adicionado, a cada tubo, uma solução de Sacarose 20% (p/v) de forma a que a concentração final de substrato fosse 2% e ainda diferentes volumes de Etanol 60% (p/v) a quatro dos cinco tubos, de forma a obter as seguintes concentrações de etanol em cada um: tubo 1-0%; tubo 2-6%; tubo 3-12%; tubo 4-18%; tubo 5-24%. Preencheram-se os tubos com água, e inverteram-se, após terem sido selados com parafilme, de forma a se misturar o substrato e as leveduras. Posteriormente, procedeu-se à montagem dos tubos como esquematizado na Figura 2, depois de se ter retirado o parafilme do tubo graduado e se inverter cuidadosamente ambos os tubos. Incubaram-se os cinco tubos durante 45 minutos, a uma temperatura de 37 o C. As condições experimentais de cada tubo são apresentadas na Tabela 1, em anexo. Figura 2 Esquema da montagem dos tubos. [2] O aparato permite medir o volume de dióxido de carbono libertado durante a fermentação alcoólica que se acumulou no topo do tubo graduado invertido, contendo a levedura na presença de substrato. Relatório da disciplina de Biologia Celular 2011/12 3
Resultados Os resultados que obtivemos nesta experiência foram organizados no gráfico seguinte: Gráfico 1 Variação do volume de CO 2 libertado durante a fermentação alcoólica em leveduras Saccharomyces cerevisae em função da concentração inicial de etanol. Tempo de incubação: 45 min.; Temperatura: 37 o C; Substrato: Sacarose 2%. Nota: Todos os valores numéricos são fornecidos na Tabela 2, em anexo. Através da observação do gráfico, verifica-se que, no geral, a actividade da fermentação alcoólica nas leveduras Saccharomyces cerevisae vai diminuindo à medida que a concentração inicial de etanol aumenta, ocorrendo uma diminuição abrupta da actividade da fermentação do tubo 2 para o tubo 3. Contudo, deu-se um ligeiro aumento do tubo 3 para o 4, voltando a decrescer do 4º para o 5º tubo. Discussão Na experiência realizada, seria de esperar que existisse uma produção de etanol cada vez mais baixa pelas leveduras à medida que se usavam concentrações iniciais de etanol mais elevadas, por dois motivos: primeiro, porque o etanol apresenta um grau de toxicidade para as leveduras e segundo, porque sendo a fermentação fundamentalmente uma reacção química, obedece aos mesmos princípios e uma concentração inicial do produto da reacção (neste caso, o etanol) diferente de zero, diminui necessariamente a quantidade formada desse mesmo produto. Relatório da disciplina de Biologia Celular 2011/12 4
Assim, os resultados obtidos vão de encontro ao esperado. No tubo 2, existiu já um decréscimo significativo na produção de etanol em relação ao tubo de controlo (tubo 1) e, tanto no tubo 3 como no tubo 5, a produção foi praticamente nula. O valor obtido no tubo 4 é inesperado dado que, sendo todas as condições iguais excepto a concentração inicial de etanol, o valor à partida, deveria ser mais baixo que no tubo 3. Este valor deve-se provavelmente a algum erro no decorrer da preparação do tubo, pelo que teria sido útil repetir a experiência para comparar resultados e assim confirmar o erro. Para averiguar qual dos motivos inicialmente citados teria um papel mais relevante, seria interessante transferir as leveduras em questão, com os devidos procedimentos laboratoriais, para tubos com meio igual ao de controlo para averiguar se as leveduras foram mortas, se sofreram inibição por parte do etanol em algum tubo ou se é o factor reaccional o mais preponderante. De qualquer forma, é possível concluir que uma concentração inicial de etanol diferente de zero afectou negativamente o rendimento da fermentação alcoólica. Bibliografia [1] Nelson DL & Cox MM, 2008. Glycolysis, Gluconeogenesis, and the Pentose Phosphate Pathway. In Lehninger Principles of Biochemistry, New York, USA: W.H. Freeman & Company, pp. 527-568 [2] Guia das aulas práticas Biologia Celular, FCUP, 2011/12 [3] Lodish H [et al.], 2004. Cellular Energetics. In Molecular Cell Biology, New York, USA: W.H. Freeman & Company, pp 301-351 [4] Página de Internet 1, 10/05/2012. Genome-Wide Identification of Saccharomyces cerevisiae Genes Required for Maximal Tolerance to Ethanol, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2747848/?tool=pmcentrez [5] Alberts B [et al.], 2008. Cell Chemistry and Biosynthesis. In Molecular Biology of The Cell, New York, USA: Garland Science, Taylor & Francis Group, pp. 45-124 [6] Página de Internet 2, 10/05/2012. Influence of the rate of ethanol production and accumulation on the viability of Saccharomyces cerevisiae in "rapid fermentation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc169741/ [7] Página de Internet 3, 08/05/2012. Glycolysis and Alcoholic Fermentation, http://www.icr.org/article/glycolysis-alcoholic-fermentation/ Relatório da disciplina de Biologia Celular 2011/12 5
Anexos Tubos [Etanol] (%) Vol. Etanol Vol. H 2 O Vol. Sol. Sacarose 20% Leveduras (g) 1 (controlo) 0 0 15,3 1,7 0,12 2 6 1,7 13,6 1,7 0,12 3 12 3,4 11,9 1,7 0,12 4 18 5,1 10,2 1,7 0,12 5 24 6,8 8,5 1,7 0,12 Tabela 1 Composição dos tubos utilizados na experiência. Tempo de incubação: 45 min.; Temperatura: 37 o C; Substrato: Sacarose 2%. Tubos [Etanol] (%) Vol. Inicial Vol. Final CO 2 libertado 1 (controlo) 0 1,2 4,0 2,8 2 6 1,4 3,3 1,9 3 12 1,9 2,1 0,2 4 18 1,0 1,7 0,7 5 24 1,7 2,0 0,3 Tabela 2 Influência da concentração inicial de etanol na fermentação alcoólica em leveduras Saccharomyces cerevisae. Tempo de incubação: 45 min.; Temperatura: 37 o C; Substrato: Sacarose 2%. Relatório da disciplina de Biologia Celular 2011/12 6