Extração de ADN: a molécula da vida!
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Este Manual pretende auxiliar o(a) professor(a) na preparação prévia da atividade Extração de ADN de Morango e na posterior execução em salade-aula/laboratório. Encontra-se organizado de forma a que o(a) professor(a) possa: 1) RECORDAR alguns conceitos de Biologia que estão na base da atividade; 2) tomar nota do material que deverá PREPARAR e procedimentos que deverá ter em conta antes de executar a atividade; 3) CONHECER os procedimentos experimentais que dizem respeito à atividade. Pretende-se com esta atividade envolver ativa e autonomamente os alunos na aprendizagem. Assim, sugerimos que o(a) professor(a) utilize métodos análogos aos do processo científico, de modo a: ENVOLVER Envolva os seus alunos, trabalhando as questões-chave que estão na origem da atividade experimental, e que refletem os objetivos pretendidos. Capte os conhecimentos prévios da turma, identifique potenciais erros de conceito e incite a curiosidade para a descoberta de respostas às questões-chave. EXPLORAR Explore as questões-chave, experimentando com os alunos a atividade que lhe propomos. Crie na turma um ambiente de aprendizagem por si-próprio, garantindo que os alunos fazem realmente algo e participam ativamente em todo o processo de experimentação. O(a) professor(a) não deve ser o demonstrador mas o mediador/orientador das várias etapas de cada atividade. EXPLICAR Num diálogo direto com a turma, dê lugar à discussão sobre os resultados obtidos individualmente ou em grupo. Elabore formas para a apresentação geral dos resultados permitindo que os alunos observem e expliquem os resultados da turma e, deste modo, elaborem conclusões finais, e as comuniquem à turma. SIMBOLOGIA Chamada de atenção Sugestão Conceito teórico Nota Para pensar Nota explicativa Exercício Informação adicional Website/ link Referência bibliográfica 3
Nesta atividade os alunos aprendem um dos procedimentos experimentais mais comuns num laboratório de Biologia Molecular - a extração de ADN de seres vivos. A atividade consiste na extração do ADN de células de morango seguindo um protocolo experimental análogo ao que é utilizado nos laboratórios, mas usando simplesmente reagentes e materiais disponíveis em casa. ANO(S) ESCOLAR(ES) Ensino secundário LIGAÇÃO AO CURRÍCULO Biologia ÁREA CIENTÍFICA Biologia Molecular Palavras-chave Células ADN Extração Morango Biotecnologia DNA recombinante Objetivos 1. Recordar e/ou explorar conhecimentos sobre o ADN como constituinte básico das células de todos os seres vivos (desde o Homem ao morango); 2. Recordar e/ou reforçar o conceito de ADN como a molécula responsável pela transmissão da informação genética de geração em geração; 3. Adquirir práaticas de laboratório; 4. Compreender e descrever as transformações físicas e químicas que ocorrem em cada passo da extração de ADN. 5. Ordenar a sequência de passos que constituem o processo de extração de ADN. 6. Relacionar a extração do ADN com a sua utilização em algumas tecnologias de ADN recombinante: clonagem (em bactérias), manipulação genética (de plantas, de mamíferos), biotecnologia, sequenciação. Material necessário (para uma extração): 1 saco de plástico (de congelar, ou de sandes); 1 morango fresco ou congelado; 10 ml de solução de extração de ADN (previamente preparada); 1 funil; 1 proveta / tubo de plástico limpo; 1 filtro de café ou 1 ou 2 camadas de gaze cortadas aos quadrados; Álcool etílico (pelo menos a 90%) gelado; 1 vareta de vidro ou um pau de madeira (palito); Um pedaço de cartolina preta. Duração Preparação do material e introdução da atividade aos alunos: 10 minutos Extração do ADN: 10 minutos (por cada grupo de 5 alunos, no máximo) Tempo total necessário: 20 a 60 minutos (dependendo do número de grupos formados) 4
RECORDAR No texto seguinte encontram-se brevemente listados alguns conceitos-chave que serão necessários para a realização desta atividade. I. O ADN Graças aos avanços científicos, hoje sabemos que o ADN está presente praticamente em todas as células de todos os organismos vivos: animais, plantas, bactérias e fungos. E também em muitos vírus - organismos que precisam de infectar células para se manterem vivos. Em todos, tem a mesma estrutura química. Nos Humanos, assim como na maioria dos vertebrados, os glóbulos vermelhos são as únicas células que não têm ADN. (Nota: os eritrócitos de galinha têm vestígios de DNA.) À exceção das bactérias e das arqueobactérias, é no núcleo das células que o ADN se encontra distribuído e na forma de estruturas compactas, os cromossomas. Cada cromossoma não é mais do que uma única molécula de ADN ligado e enrolado em proteínas, as histonas. Cada célula dos diferentes seres vivos pode conter várias cópias de cada cromossoma: nos humanos existem duas cópias - as células são diplóides (à exceção dos gâmetas femininos e masculinos - óvulos e espermatozóides - que contêm apenas uma cópia de cada cromossoma - dizem-se haplóides); existem organismos com 4 cópias de cada cromossoma por célula - tetraplóides (como por exemplo, o sapo africano e a batata branca), e outros com oito cópias - octaplóides (como por exemplo, o morango). As células estão organizadas em compartimentos, os organelos, separados uns dos outros por membranas e alguns micrómetros de distância e suspensos num fluido de água, sal e moléculas orgânicas, o citoplasma; cada organelo está especializado em desempenhar uma determinada função na célula, sendo um desses, o núcleo, o armazenador da informação genética. Em cada célula humana existem cerca de 2 metros de ADN. De organismo para organismo, o número total de cromossomas por célula varia. É de notar que um organismo mais complexo, como o humano, não tem necessariamente mais cromossomas do que um organismo mais simples, como um morango. Senão vejamos o exemplo: à exceção dos gâmetas, as células humanas contam 46 cromossomas (23 pares); já um morango tem 56 cromossomas em cada uma das suas células. É nos cromossomas, mais especificamente no ADN, que se encontra armazenada a informação que codifica a vitalidade de cada um de nós, seres vivos. Ou, no caso de alguns vírus, as instruções que permitem a sua replicação no hospedeiro que infetam. Recordar conceitos da síntese proteica: transcrição e tradução Através de um processo complexo e finamente regulado, o ADN é continuamente lido e codificado sob a forma de proteínas, assegurando dessa forma as funções vitais das células. Apenas uma pequena parte do ADN, a correspondente aos genes, é codificada em 5
proteínas, sendo que a respetiva percentagem varia com a complexidade do organismo. Por exemplo no humano, apenas ~ 1,5% do seu genoma (~ 25,000 genes) é expresso e codificado em proteínas. O restante ADN não é transcrito nem traduzido em proteínas; no entanto, desempenha um importante papel na regulação da expressão dos genes, nomeadamente na transcrição. Atua também na condensação da cromatina e durante o processo de replicação do ADN. Quimicamente, todas as células são constituídas por macromoléculas (para além de outras moléculas mais pequenas): proteínas, lípidos, hidratos de carbono e ácidos nucleicos. Cada uma destas classes de macromoléculas tem a sua função na célula, podendo estar envolvidas em diversos mecanismos de sinalização, comunicação, transporte, suporte, expressão e regulação II. Estrutura química do ADN Quando Gregor Mendel, baseado nas suas experiências com a ervilheira, estabeleceu os 3 princípios da transmissão dos caracteres hereditários (1865), ainda nada se sabia sobre a existência do ADN (ou DNA, na sigla inglesa) e muito menos conhecida era a sua composição e estrutura. Foi passado quase um século (1953) que James Watson e Francis Crick descobriram a estrutura de dupla-hélice do DNA, sendo descrita com as seguintes características (que ainda hoje prevalecem): A molécula de DNA tem uma estrutura tridimensional enrolada em forma de dupla hélice. As duas cadeias que a constituem estão unidas através de ligações de pontes de hidrogénio entre nucleótidos complementares, estes por sua vez unidos entre si por grupos fosfato. Cada nucleótido no DNA é composto por uma base azotada (adenina, timina, citosina ou guanina), um açúcar (desoxiribose) e um grupo fosfato, todos ligados por ligações covalentes. As adeninas (A) de uma cadeia ligam-se sempre às timinas (T) da cadeia complementar e as citosinas (C) emparelham sempre com as guaninas (G) e vice-versa. É através de ligações de hidrogénio entre as bases azotadas, 2 ou 3 ligações dependendo do par de bases emparelhado, que as duas cadeias se unem. Todas as células de um organismo têm a mesma composição genética. Em cada tipo celular, é a ativação (i.e., a transcrição) de uns genes em deterimento de outros, que vai determinar a identidade da célula. Por exemplo, uma célula da pele é uma célula da pele e não uma célula nervosa porque os mesmos genes são expressos (estão ligados ) na célula da pele mas não são expressos (estão desligados na célula nervosa, e viceversa. Cada cadeia de DNA tem uma extremidade 5 e outra 3. Cada grupo fosfato liga o carbono na posição 3 de um açúcar ao carbono 5 do açúcar seguinte. A informação contida na sequência de DNA (os genes e sequências reguladoras) lê-se da extremidade 5 para a 3. As duas cadeias de DNA estão dispostas paralelamente e correm em sentidos opostos dizem-se antiparalelas: o nucleótido da extremidade 5 de uma cadeia liga-se ao nucleótido da extremidade 3 da cadeia complementar. A composição química das bases azotadas permite, através de ligações de hidrogénio, que outras moléculas se liguem ao DNA, nomeadamente proteínas importantes na sua replicação e na expressão dos genes. III. Regulação da expressão génica Os processos de regulação da expressão dos genes determinam a identidade e funcionamento das células. 6
Sequências de nucleótidos não-codificadores (p.ex. promotores e reguladores situados a montante dos promotores) funcionam como locais de ligação a proteínas (RNA polimerase, indutores e repressores) cuja interação com o DNA determina a transcrição dos genes (a jusante dos promotores). Nos eucariontes existem outros mecanismos celulares que também regulam a expressão génica. São eles: 1) o estado de condensação da cromatina uma maior ou menor condensação da cromatina aumenta ou diminui o acesso da RNA polimerase ao promotor e, consequentemente, ativa ou inibe a transcrição de um determinado gene; 2) o processo de excisão alternativa a remoção de diferentes intrões a uma mesma molécula de pré-mrna -, permite que um mesmo gene transcrito origine duas proteínas distintas. IV. Mutações Qualquer dano, à estrutura química do DNA, se não for reparado, resultará na perda da integridade e, potencialmente, da estabilidade da molécula. Alterações na identidade dos nucleótidos resultam em mutações, com efeitos benéficos ou prejudiciais para o indivíduo (ou ser vivo). Entre as mutações benéficas incluem-se aquelas que conferem vantagens na adaptação ao meio ambiente (p.ex. mutações que tornam bactérias resistentes a antibióticos). Várias doenças, por outro lado, resultam diretamente de mutações, (p.ex. a anemia falciforme). Uma mutação nem sempre resulta num efeito no organismo. As células (eucarióticas e procarióticas) ao longo da evolução desenvolveram mecanismos capazes de detetar e reparar os vários erros que podem ocorrer no DNA, sejam eles provocados por condicionantes externas, como a radiação UV ou o fumo do tabaco, ou factores internos, como erros na replicação do DNA durante a divisão celular. A membrana celular, que separa cada célula do exterior, constitui uma dupla barreira para a célula: por um lado, mantém a integridade dos seus constituintes e, por outro, impede os compostos de passarem livremente de e para a célula. V. Extração de DNA e a Biotecnologia A descoberta do DNA permitiu não só compreender como as células regulam o seu metabolismo mas também como as características hereditárias são transmitidas entre gerações. Para além das implicações diretas no conhecimento da biologia das células, as conclusões de estudos do DNA têm permitido grandes avanços na compreensão da genética de doenças. Paralelamente, tem possibilitado o aparecimento de inovadoras práticas biotecnológicas com impacto relevante, não só em procedimentos de investigação básica como aplicada - a Biotecnologia. Recordar: Organismos geneticamente modificados; Clonagem; Sequenciação O sector da indústria farmacêutica, por exemplo, tem beneficiado de todo o conhecimento desde que se descobriu o DNA e o código genético: hoje em dia é possível, a partir do DNA, produzir grandes quantidades de proteínas importantes para o tratamento de doenças, acessíveis a todos na forma de vacinas e/ou medicamentos. Repercussões semelhantes foram sentidas nas áreas do ambiente e agricultura. 7
Isolar e purificar DNA de células animais ou plantas, de fungos ou bactérias é tarefa diária dos investigadores em Biologia Molecular, quer para aqueles que procuram compreender a origem de certas doenças humanas como os que, por exemplo, procuram melhorar a produtibilidade de determinada planta. Através do seu isolamento, os cientistas conseguem obter e estudar genes que de outro modo seriam difíceis de aceder, devido às restrições impostas pela própria constituição química e biológica das células. Mais sobre ratinhos knockout em http:// learn.genetics.utah. edu/content/tech/transgenic/ 1. Uma vez isolado o DNA os cientistas conseguem por deleção de determinado gene inativar a função desse gene nas células. A inserção do gene mutado nas células faz-se com a produção de organismos designados knockout (é comum utilizar-se o ratinho, a mosca da fruta, bactérias e plantas). É assim que os cientistas conseguem estudar o efeito daquele gene mutado no funcionamento das células. 2. Uma vez isolado o DNA é possível aumentar a função de determinado gene, quer por inserção de cópias extra do gene ou por aumento da síntese da proteína por si expressa. Desta forma, os cientistas conseguem analisar em maior detalhe a função do gene. A técnica comummente usada para extrair DNA é a prova viva de que, algures na história recente da ciência, foram ultrapassadas as barreiras impostas pela célula e que nos separavam do DNA. Desde que esta possibilidade surgiu, as técnicas de biologia molecular foram melhoradas e novas foram introduzidas Biotecnologia -, sendo hoje possível manipular, modificar, clonar e/ou multiplicar genes Engenharia Genética. Outro tipo de técninas usadas em Biotecnologia: Técnica de DNA recombinante Produção de bactérias geneticamente modificadas Síntese de DNA complementar Electroforese PCR Prepare-se para explicar o que está acontecer ou o que significa cada passo durante a extração de ADN do morango. Em baixo seguem as respostas às perguntas mais importantes. 1. Porquê utilizar morangos? É possível extrair DNA de qualquer célula, animal ou vegetal, mas não com a mesma facilidade. As plantas são excelentes fontes de ADN: existem, geralmente, em numerosos lugares e em grandes quantidades. Para além disso, a maioria das plantas possui oito cópias de cada cromossoma por cada célula (octoplóides), o que significa que possui muito ADN - mais do que a maioria das células animais que têm apenas duas cópias (diplóides) ou das células germinativas (óvulos e espermatozóides) que têm apenas uma cópia (haplóides). Os morangos maduros, para além de possuírem muito ADN, produzem pectinases e celulases, enzimas que ajudam a degradar a parede celular. 2. Qual a função do detergente? A solução de extração do ADN contém detergente: shampô ou detergente da loiça. As membranas das células são formadas por lípidos, que são gorduras. Tal como acontece quando lavamos loiça, o detergente atua na membrana das células e do envelope do 8
núcleo emulsionando as gorduras e destruindo as membranas. Este é um passo importante da atividade, não só porque rebenta as células e faz com que os organelos circulem suspensos na solução (de água, sal e detergente) mas principalmente porque permite que o DNA se liberte do núcleo, tornando-se assim mais acessível para o passo seguinte. 3. Qual a função do sal? O DNA é muito solúvel em água devido aos seus iões fosfato (molécula hidrofílica). Para impedir que o DNA liberto do núcleo da célula se dissolva totalmente na solução e se torne invisível, usa-se sal. O sal, cuja fórmula química é NaCl, quando em solução dissocia-se em iões de Na+ e Cl-. Os iões Na+, com carga positiva, vão interagir com os fosfatos, com carga negativa das moléculas de DNA, tornando-as neutras e estabilizadas, e permitindo a sua agregação. Deste modo, as muitas moléculas de DNA das muitas células de um único morango triturado aglomeram-se para mais tarde poderem ser visualizadas a olho-nu. 4. Porque se filtra o extrato? A filtração permite eliminar da solução os restantes constituintes celulares e que só atrapalham : os restos das membranas, os organelos que não rebentaram, etc. Assim, a solução filtrada está tão pura quanto possível, contendo o DNA e outras moléculas, como proteínas, que não interferem com o sucesso da extração. 5. Qual a função do álcool etílico? Para finalmente se poder ver o DNA, usa-se álcool. Este desidrata as moléculas de DNA, ou seja, afasta a água à sua volta retirando-as da solução. Ocorre precipitação do DNA. O precipitado final vê-se como um conjunto de filamentos esbranquiçados. Estes correspondem a milhares de moléculas de DNA, com muitas outras moléculas associadas. A preparação de DNA que se obtém tem um elevado grau de impureza: para além do DNA das células do morango, contém também proteínas e outras macromoléculas. A visualização da estrutura em dupla-hélice da molécula de DNA não é possível a olho-nu e nem mesmo o microscópio mais potente consegue captar essa imagem. Só através de uma técnica de cristalografia por difração de raios-x é possível obter imagens que revelam a sua estrutura. Esta foi a mesma técnica que Rosalind Franklin (conhecida biofísica britânica) usou quando, um pouco antes da publicação do modelo proposto por J. Watson & F. Crick, apresentou, junto da comunidade científica uma fotografia de um cristal de ADN. Foi nesta fotografia que Watson e Crick se basearam em grande parte para construir o modelo teórico da dupla hélice. 9
PROTOCOLO 1. Preparar a Solução de Extracção de DNA (1 litro): 100 ml de champô (sem amaciador) ou 50 ml de detergente de loiça 15 g de sal de cozinha (2 colheres de chá) Água para perfazer um litro 2. Lavar o morango e tirar as sépalas (folhas verdes). A atividade proposta foi planeada de forma a ser realizada com pequenos grupos de alunos (máximo 5), em esquema rotativo mas sequencial. 3. Colocar o morango no saco e esmagá-lo com o punho durante 2 minutos. 4. Adicionar 10 ml da solução de extração de DNA ao conteúdo do saco. 5. Misturar tudo, apertando com as mãos, durante 1 minuto. 6. Colocar o extrato no funil (com o papel de filtro ou a gaze) e deixar verter o líquido filtrante para o tubo até 1/8 do seu volume. 7. Adicionar o álcool, previamente gelado, ao tubo até perfazer metade do volume do tubo Manter o tubo ao nível dos olhos para ver o que acontece; o resultado é visível em poucos segundos mas aconselhamos esperar entre 3 a 10 minutos e ir observando a formação do precipitado de DNA. Verá que à medida que o tempo passa mais precipitado se forma. 8. Mergulhar a vareta de vidro ou o pau de madeira/palito no tubo, onde o álcool está em contacto com o extrato (DNA precipitado). 9. Retirar uma amostra do DNA precipitado, ou todo o DNA, e observar a sua textura viscosa e pegajosa. 10. Colocar a amostra num pedaço de cartolina preta e deixá-la secar ao ar (durante o tempo necessário para que o álcool evapore). 11. Observar a estrutura do DNA: uma rede esbranquiçada que representa o DNA de milhões de células digeridas de um único morango. 10
FOLHA DE REGISTO INDIVIDUAL/ GRUPO Ciência em Três Nome da atividade: Membros do grupo: O que sabemos sobre este tema? O que ainda não sabemos e queremos descobrir? Como podemos descobrir? O que observámos? O que aprendemos?