MEIOS DE CONGELAÇÃO PARA CONSERVAÇÃO DE SÊMEN DE PEIXES DA FAMÍLIA CHARACIDAE (Cryopreservation extenders for fishes sperm of Characidae family) Carminda Sandra Brito SALMITO-VANDERLEY 1* ; Marcelo José da Ascensão Feitosa VIEIRA 2 ; Liliane Veras LEITE 1 ; Fátima de Cássia Evangelista de OLIVEIRA 1 ; Francisco Renan Aragão LINHARES 1 ; Cristiane Clemente de Mello SALGUEIRO 1 ; José Ferreira NUNES 1. 1-Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) - Universidade Estadual do Ceará (UECE); 2- Departamento de Obras Contra as Secas (DNOCS) *sandra.salmito@uece.br RESUMO Os peixes caracídeos possuem grande diversidade de espécies, considerável importância ecológica e expressivo valor comercial. A criopreservação de sêmen é uma técnica utilizada para contribuir na operacionalização dos programas de reprodução dessas espécies cultivadas ou em vias de extinção. Para garantir a sobrevivências dos espermatozóides durante a criopreservação é necessário adicionar soluções diluidoras e crioprotetoras, que reagem com o sêmen de forma peculiar dependendo da espécie animal. Portanto, o objetivo dessa revisão foi buscar identificar diluentes adotados para criopreservação de sêmen de alguns peixes caracídeos. Os diluidores mais utilizados são glicose, BTS e, mais recentemente, a água de coco em pó (ACP ) associados aos crioprotetores DMSO, glicerol ou metilglicol. Diante da grande variedade de protocolos, conclui-se que é de grande importância incentivar o estudo das particularidades do sêmen de caracídeos e dos meios de congelação, para padronizar a técnica de criopreservação de sêmen de peixes deste grupo. Palavras-chave: criopreservação, sêmen, diluentes, Characidae. ABSTRACT The Characidae fish family has a great diversity of species, an enormous ecological importance and commercial value. The sperm cryopreservation is a technique used to 27 a 29 de junho de 2012. 255
assist reproductive programs of cultivated or endangered species. To ensure the sperm survival during cryopreservation, it is necessary to add extenders and cryoprotective solutions, which react with the sperm in a peculiar way, depending on the animal specie. Thus, the objective of this review was to identify extenders used in the cryopreservation technique for Characid fishes. The sperm cryopreservation review in Characid fishes report that the most commonly used extenders are glucose, BTS and powder coconut water (PCW ) associated with glycerol, DMSO and methyl glycol. Due to the wide range of protocols, it can be concluded that is very important to encourage the study of the particularities of Characid fish semen and freezing substances to standardization of cryopreservation techniques of semen in this particular fish group. Keywords: cryopreservation, semen, extenders, Characidae. INTRODUÇÃO O desenvolvimento de um bom método de congelação de sêmen de peixes é imprescindível não só para promover um bom programa de seleção e melhoramento animal como também para poder suprir a demanda de sêmen e reprodutores de alta produção. A contribuição do macho para a eficiência reprodutiva e produtiva do cultivo é de grande importância, uma vez que além do aporte genético, neles pode se aplicar uma pressão de seleção maior e mais rápida (Vieira et al, 2011). A criopreservação de sêmen tornou-se uma ferramenta de auxílio à aqüicultura comercial, pois permite a possibilidade de selecionar reprodutores, desenvolver plantéis em programas de melhoramento genético (Verstegen et al., 2002) e aperfeiçoar várias atividades através da obtenção de sêmen em tempos e locais diferentes. Embora a criopreservação tenha beneficiado a produção de pescado, estudos ainda buscam diminuir e eliminar os fatores que reduzem a viabilidade e a fertilidade do espermatozoide após descongelação (Streit Jr et al, 2009). Nos últimos anos, vários pesquisadores têm tentado adicionar soluções criodiluidoras ao sêmen, também conhecidas como meios de congelação ou diluidores, com a finalidade de manter a viabilidade espermática pós-descongelado. Entre estas soluções, a água de coco vem se tornando um meio de congelação inovador, pois esta 27 a 29 de junho de 2012. 256
tem demonstrado grande viabilidade no processo de refrigeração e congelação seminal (Nunes, 1987, Vieira, 2010; Leite, 2011; Viveiros et al, 2011). Muitos estudos sobre qualidade seminal de caracídeos pós-criopreservação têm sido realizados utilizando diferentes protocolos de congelação, com diferentes resultados, o que sugere uma revisão de literatura para detecção de lacunas existentes com relação à perda da motilidade dos espermatozóides criopreservados em programas de inseminação artificial em algumas espécies. Congelação Seminal (Criopreservação) A criopreservação de sêmen é uma boa alternativa para a melhoria da reprodução de peixes em cativeiro, tendo em vista que seus benefícios são variados, dentre eles: sincronização na disponibilidade de sêmen, facilidade no transporte, retardo no envelhecimento dos gametas, conservação da variabilidade genética, eliminação dos custos com a manutenção dos machos (Suquet et al., 2000). Segundo Hunter (1982) fatores como a concentração de espermatozoides ou taxa de diluição; o tempo e temperatura de equilíbrio; a natureza da curva de resfriamento; a natureza da curva de descongelação, dentre outros, são estresses sob quais os espermatozoides são submetidos durante o congelamento, que comprometem sua viabilidade pós-descongelação. Porém uma das maiores dificuldades na congelação do sêmen é evitar a formação de cristais de gelo intra e extracelulares, e o aumento da concentração de solutos (Mateos-Rex & Aguillar, 1996). Isso ocorre porque quando os espermatozóides são submetidos a temperaturas abaixo de 0ºC, cristais de gelo extracelulares começam a se formar, resultando em aumento da concentração de sais no líquido extracelular. Inicialmente a água do interior do espermatozoide não se congela, levando a perda de água para o meio extracelular, desidratando progressivamente o espermatozoide. Se a velocidade de congelamento é muito lenta, o aumento da concentração de sais intracelulares causada pela desidratação pode danificar o espermatozoide. Se a velocidade de congelamento for muito rápida, cristais de gelo intracelular podem se formar. A taxa de congelamento adequada é um equilíbrio entre esses fatores. 27 a 29 de junho de 2012. 257
Para minimizar a formação desses cristais durante o processo de criopreservação do sêmen, são adicionados diluidores que devem proporcionar proteção aos espermatozoides contra o choque térmico (Salmito-Vanderley, 2010). Desta forma é importante o conhecimento da composição deste meio de congelação, pois este é um fator determinante da qualidade seminal após o descongelamento, apesar de outros fatores também influenciarem o sucesso da criopreservação. A etapa de congelação inicia-se após a coleta do sêmen com a adição do diluente, em seguida, o envasamento do sêmen diluído em palhetas ou criotubos, submetidos à diminuição de temperatura, até serem finalmente mergulhados e armazenado em nitrogênio líquido (NL). Existem vários equipamentos para congelar as amostras de sêmen, sendo os mais utilizados as geladeiras de isopor (conhecida como rampa de congelamento); o botijão de vapor de nitrogênio líquido conhecido como dry shippers; ou freezers programáveis. Esta visão geral do protocolo de criopreservação de sêmen de peixe é uma reunião de alguns dos protocolos comumente utilizados, mas a comparação entre eles é muito difícil devido à diversidade de parâmetros envolvidos. Meios de congelação (Diluidores e Crioprotetores) O sêmen puro é praticamente impossível de ser congelado por causar danos à maioria dos espermatozóides, necessitando, portanto, da adição de soluções que mantenham a viabilidade das células espermáticas durante a redução da temperatura. (Pickett et al., 1987). Essa solução deve ser composta por uma substância para diluir e nutrir as células, e crioprotetores, para protegê-las contra o choque térmico. Condições mínimas são requeridas para um diluidor ser adequado, tais como: isotonicidade, para que não haja ativação prévia da motilidade espermática, pois a mesma pode exaurir a reserva energética necessária à fertilização; estabilidade, pois suas características físico-químicas não devem ser alteradas durante o contato com o sêmen; condutividade térmica elevada, permitindo a rápida transferência de temperatura do meio externo para os espermatozóides; esterilidade, ou seja, não devem vincular microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas; proporcionar nutrientes como fontes de energia; além de aumentar o volume do sêmen (Legendre & 27 a 29 de junho de 2012. 258
Billard, 1980). Porém cada grupo animal possui especificidade própria, tornado de vital importância para a criopreservação de sêmen que a composição do diluidor seja ajustada para as características seminais de cada espécie e a cada tecnologia seminal empregada. Dentre os diluidores mais utilizados em testes de criopreservação de sêmen de peixes caracídeos, um dos mais conhecidos é a solução de glicose numa concentração de 5%, pois esta age como substrato de energia, componente osmótico e agente crioprotetor em função do seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico e atuando como substituto de eletrólitos (Holt, 2000). Outro diluidor utilizado é o BTS (Beeltsville Thawing Solution, MINITUB), composto de glicose, citrato de sódio, acido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), bicarbonato de sódio, cloreto de potássio e sulfato de neomicina, que apresenta osmolaridade de 318 mosm. Esse meio foi produzido, inicialmente, para a criopreservação de sêmen suíno, mas já vem sendo utilizado para outras espécies de animais (Lahnseteiner et al., 1997; Maria et al., 2004). Também já foram testados a eficiências do diluidor seminal M III (Merck III) composto por glicose, citrato de sódio, EDTA, bicarbonato de sódio, e sulfato de gentamicina, de osmolaridade de 348 mosm. Além destes, também já foi testado um diluidor conhecido como Ringer, composto de cloreto de sódio, cloreto de potássio, bicarbonato de sódio e cloreto de cálcio hexahidratado, com 300 mosm (Quadro 1). Uma das inovações mais recentes da biotecnologia do sêmen de peixe é a utilização de água de coco como diluidor para criopreservação, sendo este um meio natural e estéril composto por sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, além de indutores da divisão celular e diversos eletrólitos, podendo exercer uma ação benéfica sobre a conservação celular. Trabalhos realizados por Nunes (1987) demonstraram a viabilidade da água de coco como diluente de refrigeração e congelação do sêmen caprino, o que levou à elaboração de um meio comercial de conservação, padronizado e estabilizado, à base de água de coco em pó (ACP ). Tornando-se, desta forma, mais uma alternativa mercadológica para a área de diluidores tradicionais. Outra função importante do diluidor é servir como carreador de crioprotetores, substâncias que têm como função proteger os espermatozóides contra os efeitos maléficos do congelamento. Toda essa proteção ao espermatozóide é essencial, pois durante os processos de congelação-descongelação os espermatozóides são submetidos 27 a 29 de junho de 2012. 259
a condições desfavoráveis como: a desidratação, as mudanças da fase de transição dos fosfolipídios da membrana, o efeito solução e a formação de cristais de gelo (Parks & Graham, 1992; Vivieros et al, 2011). A conseqüência imediata destes processos é a ruptura da membrana plasmática devido aos estresses térmico, mecânico, químico e osmótico exercidos sobre a célula durante a congelação. Os crioprotetoros podem ser classificados como internos ou externos. Os crioprotetores internos devem evitar a formação de cristais de gelo que comprometem a integridade da membrana espermática interna durante as mudanças de temperatura. Essas soluções criodiluidoras são responsáveis por atuar através de suas propriedades coligativas, na redução do ponto crioscópio intracelular. Esta propriedade favorece um ambiente menos deletério a célula espermática durante a congelação. A adição de crioprotetores internos é imprescindível para a criopreservação de células espermáticas, sendo os mais comumente utilizados Dimetilssufóxido (DMSO); Metilglicol; Metanol; Dimetilacetamida (DMA); Propilenoglicol; Etilenoglicol; Coreto de Potássio; Glicerol; Citrato e outros (Salmito-Vanderley, 2010; Leite, 2011; Viveiros et al 2011; Martínez et al 2012; Viveiros et al 2012). Quadro 1: Motilidade espermática (%) após o descongelamento do sêmen de algumas espécies de peixes characiformes em diferentes diluentes. Motilidade pós Espécies Meios de congelação descongelação (%) Referências Piracanjuba (Brycon orbinyanus) M III Metilglicol + Gema de ovo 63 NaCl Metilglicol + Gema de ovo 60 BTS Metilglicol 68 Maria et al. (2004) Yamú (Brycon amazonicus) ACP-104 60* Nascimento Metilglicol BTS 70* et al. (2007) Velasco-Santa Glicose DMSO 35 Maria + Gema de ovo et al. (2006) 27 a 29 de junho de 2012. 260
Matrixã (Brycon cephalus) Glicose + Gema de ovo Glicose NaCl; NaHCO3; KCl;; DMSO 68 35 Ninhaus- Silveira et al. (2006) gema de ovo Matrixã (Brycon orthotaenia) Glicose + Gema de ovo NaCl + Gema de Ovo DMSO 70 Melo & Godinho DMSO 89 et al. (2006) Pirapitinga (Brycon nattereri) Pirapitinga (Brycon nattereri) Tambaqui (Colossoma macropomum) Pirapitinga (Piaractus brachypomus) NaCl (154mM) NaCl (200mM) DMSO 51* Metilglicol 68* DMSO 68* Metilglicol 57* BST MetilGlicol 72* Água de coco (in natura) Ringer Glicose Glicerol DMA < 5 DMSO 5-10 Metanol 20-25 PropilenoGlicol 20-25 EtilenoGlicol <5 DMSO 32* MetilGlicol 30* ACP-104 DMSO 55* Metilglicol 46* Glicose DMSO 41* Metilglicol 62* Ringer DMSO 50* ACP-104 Glicose BTS Metilglicol 26* DMSO 57* Metilglicol 37* DMSO 52* Metilglicol 81* DMSO 51* Metilglicol 57* 5 Oliveira et al. (2007) Oliveira et al (2007) Farias et al. (1999) Menezes et al. (2008) Vieira, 2010 Velásquez- Medina (2008) Nascimento et al 2010 Piabanha Glicose + Gema DMSO 86 Shimoda 27 a 29 de junho de 2012. 261
(Piaractus insignus) Pacu (Piaractus mesopotamicus) de ovo (2004) Glicose + Streit Jr. et al Gema de ovo DMSO 16 (2006) Martínez et al Glicose DMSO 10 2012 DMSO 38 Curimba BTS Metilglicol 94 (Prochilodus DMSO 84 Viveiros et al lineatus) MIII Metilglicol 88 2009 DMSO 1 NaCl Metilglicol 18 Bocachico Glicose +gema Martínez et al (Prochilodus DMSO 71* de ovo 2012 magdalenae) MIII: (Merck III) solução composta de glicose, citrato de sódio, EDTA, bicarbonato de sódio, e sulfato de gentamicina; BTS: (Beeltsville Thawing Solution, MINITUB), solução composta de glicose, citrato de sódio, EDTA, bicarbonato de sódio, cloreto de potássio e sulfato de neomicina; ACP-104 : Água de coco em pó específica para peixes; DMSO: Dimetilssufóxido. * Avaliação da motilidade por sistema computadorizado. Os crioprotetores externos, por sua vez, atuam recobrindo a superfície celular e estabilizando a membrana, além de restituir os fosfolipídeos perdidos pelos espermatozóides durante o choque térmico. Esta combinação ajuda, portanto, a minimizar e reparar os possíveis danos celulares causados durante o processo de congelamento. Os crioprotetores externos mais utilizados são a gema de ovo de galinha e o leite desnatado, já que a fosfatidilcolina (lecitina) e lipoproteínas da gema, e a caseína do leite têm essa propriedade protetora (Navarro et al., 2004). Segundo Leung & Jamieson (1991) a combinação entre crioprotetor interno e o externo promove uma proteção mais completa as células contra o choque térmico. Aparentemente, determinados meios de congelação agem melhor em determinadas espécies do que em outras. Assim, para se estabelecer um protocolo ideal de congelação de sêmen de uma determinada espécie, vários testes devem ser realizados a fim de encontrar a melhor associação entre diluidor e crioprotetores, formando um 27 a 29 de junho de 2012. 262
meio de congelação ideal para a espécie em estudo. No quadro 1 observa-se que o diluente ótimo para uma espécie pode não o ser para outra. Tais diferenças reforçam a ideia de que determinados diluentes podem agir de formas diferentes dependendo da espécie estudada. Uma possível explicação para tal fato é a existência de diferenças na composição lipídica da membrana plasmática de espermatozoides entre espécies e ainda entre indivíduos da mesma espécie. Assim um mesmo meio de congelamento pode conferir maior ou menor proteção aos espermatozoides (Holt., 2000). CONSIDERAÇÕES FINAIS A criopreservação seminal em peixes vem avançando e mostrando sua importância como ferramenta para a contribuição na operacionalização e flexibilização dos programas de reprodução de caracídeos. Porém não há uma padronização nos protocolos de criopreservação. Dessa forma, pode-se encontrar na literatura uma grande variação inclusive nos diluidores utilizados na criopreservação de sêmen de um mesmo grupo de animais, tornando essa técnica inconsistente e de difícil difusão. No caso dos peixes caraciformes citados nessa revisão, os diluidores frequentemente utilizados são solução de glicose, cloreto de sódio ou água de coco em pó (ACP ), associados aos crioprotetores glicerol, DMSO ou metilglicol. É importante ressaltar que, além dos meios de congelação, outros fatores também exercem influência sobre a qualidade do sêmen criopreservado, como a taxa de resfriamento, concentração espermática, tempo e método de adição dos crioprotetores, métodos de envase, condições de congelação, tempo de descongelação, método de análise da motilidade, dentre outros. Além disso, cada um desses fatores influenciam diferentemente os resultados, dependendo da espécie animal da qual provem o sêmen. Nesse sentido, é de grande importância incentivar o estudo sobre as particularidades do sêmen dos peixes caracídeos buscando a padronização da técnica de criopreservação. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS FARIAS, J.O.; NUNES, J.F.; CARVALHO, M.A.M.; SALGUEIRO, C.C.M. Avaliação in vitro e in vivo do sêmen de tambaqui Colossoma macropomum conservado a 27 a 29 de junho de 2012. 263
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