Ciclo de Krebs - Parte 1 13

A U L A Ciclo de Krebs - Parte 1 13

BIOQUÍMICA II Ciclo de Krebs - Parte 1 INTRODUÇÃO Como vimos na aula anterior, o resultado da genialidade de Lavoisier, somada ao trabalho de Laplace e Priestley, resultou na seguinte equação geral da respiração celular: Matéria orgânica + O 2 CO 2 + H 2 O + ENERGIA Mas a história não parou por aí. A partir de agora você conhecerá outros personagens da história da Bioquímica. Eles contribuíram para a descoberta dos passos da respiração celular. A HISTÓRIA DO CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO O T T O HEINRICH WA R B U R G Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1931, por suas descobertas a respeito da natureza e do modo de ação das enzimas respiratórias. Comecemos com OTTO WARBURG, um eminente bioquímico alemão durante a primeira metade do século XX. Filho de militar da mais alta patente do exército, era possuidor de uma disciplina rígida e personalidade forte. Alguns relatos contam que, para dar continuidade a seus experimentos no período recessivo da Primeira Grande Guerra, dividia boa parte de seus ganhos com a alimentação de suas cobaias. Estava interessado em entender as etapas da equação de Lavoisier, em diferentes tecidos. Para esta finalidade, desenvolveu, por volta de 1918, um método manométrico (baseado em medidas de pressão) para medir o consumo de oxigênio e a produção de CO 2. Este aparelho foi, mais tarde, batizado de respirômetro de Warburg, em sua homenagem (Figura 13.1). O respirômetro de Warburg teve ampla aplicação na Bioquímica e, ainda hoje, é utilizado na determinação de CO 2 produzido por diferentes preparações biológicas. Em 1935, Albert Szent-Györgyi, um pesquisador húngaro, começou a publicar uma série de importantes trabalhos sobre a respiração de suspensões de músculo de peito de pombo. Sendo um músculo muito solicitado no vôo, ele requer muita energia e possui uma capacidade oxidante excepcionalmente alta. Szent-Györgyi estudou, em particular, o comportamento metabólico dos ácidos dicarboxílicos C4 (ácidos com quatro carbonos que possuem dois grupos carboxílicos). Ele também estava interessado em estabelecer a conexão entre fermentação e oxidação, como fica claro na seguinte passagem: 18 CEDERJ

AULA 13 MÓDULO 4 OXIDAÇÃO E FERMENTAÇÃO ALBERT SZENT- GYÖRGYI Nasceu em Budapeste. Em 1937 recebeu o Prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina por suas descobertas na área dos processos de combustão biológica, particularmente com respeito à vitamina C e ao ácido fumárico. Ele não é uma gracinha? É o meu favorito. Tomemos como exemplo a fermentação láctica em células musculares. Neste processo, a molécula de hexose é fragmentada em duas moléculas de ácido láctico. Juntas, estas duas moléculas de ácido láctico contêm menos energia que a molécula de hexose original. Esta pequena diferença de energia é o ganho da célula. Alternativamente a molécula de hexose pode ser submetida à combustão, gerando CO2 e H2O. No último caso, grande quantidade de energia livre é desperdiçada. A fermentação é o mais simples dos dois processos. Ao mesmo tempo ele é pouco econômico, pois a maior parte da energia da molécula de hexose permanece nas moléculas de ácido láctico. Por volta de 30 vezes mais energia é liberada por oxidação. Conseqüentemente, a fermentação pode manter somente as formas de vida mais simples. Nesse ponto, pode existir uma pequena dúvida de que a fermentação não é somente o mais simples, mas também o processo mais antigo, precedendo a oxidação na história da vida. O desenvolvimento de formas de vida mais complexas tornou-se possível somente depois que a oxidação pelo oxigênio molecular foi inventada pela natureza. Esta seqüência de eventos se reflete em nossas células, nas quais nós encontramos oxidação e fermentação intimamente misturadas e entrelaçadas em um sistema produtor de energia. A íntima relação entre os dois processos tem ocupado muitos bioquímicos, como Pasteur, a descobrir suas interdependências quantitativas, agora conhecidas como Reação de Pasteur. Pasteur descobriu que existe algum tipo de equilíbrio entre oxidação e fermentação. Se a oxidação é suprimida por remoção do oxigênio, a fermentação se inicia. Se nós promovemos outra vez a oxidação, a fermentação cessa. O mecanismo desta relação tem sido um dos mais atraentes quebra-cabeças da Bioquímica desde então. ALBERT VON SZENT-GYÖRGYI, Ph. D., M.D. Professor de Química Orgânica e Biológica, Universidade de Szeged, Hungria. CEDERJ 19

BIOQUÍMICA II Ciclo de Krebs - Parte 1 HANS ADOLF KREBS, um bioquímico alemão, testou os mesmos ácidos orgânicos que Szent-Györgyi (ácidos dicarboxílicos C4) em fatias de córtex de rim e obteve o seguinte resultado (veja a Tabela 13.1): Tabela 13.1: Oxidação e formação de bicarbonato a partir de ácidos orgânicos em lâminas de rins de porquinho-da-índia. S I R HANS ADOLF K RE B S Nasceu em Hildesheim, Alemanha. Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1953. O que sugere este experi mento? Substrato adicionado Consumo de O2 (µmols/g de peso seco) Bicarbonato formado (µmols/g de peso seco) Sem adição 670 0 Acetato 1340 393 Succinato 1520 555 Fumarato 1290 705 Malato 1340 756 Piruvato 1070 318 Note que Krebs usou o respirômetro de Warburg e mediu tanto o consumo de O 2, pela diminuição da pressão e conseqüente deslocamento da coluna do respirômetro, quanto a formação de CO 2, pela medida da quantidade de bicarbonato formada no poço central do respirômetro. Desta forma, Krebs mostrou que qualquer um dos substratos utilizados aumentava a taxa de respiração em relação ao controle (sem adição do substrato). Como nos músculos de pombo de Szent-Györgyi, Krebs viu que o rim também era capaz de respirar, utilizando como substratos ácidos dicarboxílicos de quatro carbonos (succinato, fumarato e malato), além de acetato (dois carbonos) e piruvato (três carbonos). Enquanto isso, no laboratório de Warburg, após um acidente experimental com um de seus respirômetros, os tecidos de músculo foram carbonizados e, por descuido do seu técnico, o mesmo respirômetro foi utilizado em um outro experimento. Qual não foi a surpresa de Otto Warburg, quando constatou um grande aumento na respiração do tecido. Análises do material contido nas paredes do respirômetro mostraram altos níveis de um composto orgânico associado ao ferro. Warburg prosseguiu seus estudos com a intenção de identificar este fator, que chamou Atmungsferment (enzima), pois, uma vez inativado, todo o processo de respiração cessava. 20 CEDERJ

A próxima etapa desse quebra-cabeça foi resolvida por David Keilin, em 1925, que redescobriu uma substância que ele denominou cytochrome (CITOCROMO). Esta substância, como o Atmungsferment, estava intimamente ligada aos processos oxidativos. Segundo Keilin, o citocromo era diretamente oxidado na sua forma divalente para a forma trivalente (férrica). Os dois sistemas, Atmungsferment e Cytochrome, foram denominados sistemas W.K. (sistema Warburg-Keilin). Szent-Györgyi sabia do envolvimento do O 2 nos processos oxidativos e ficou intrigado com o fato de que a oxidação do succinato era especialmente bloqueada por um ácido dicarboxílico (C3), o ácido malônico. Resolveu, então, investigar o que aconteceria com a respiração em duas situações: 1) ao bloquear a oxidação do succinato; 2) ao incluir pequenas quantidades de fumarato, normalmente presente no tecido. Assim Szent-Györgyi descreveu seus resultados: C I T O C RO M O S Os citocromos foram primeiro descritos como mio-hematina e histo-hematina por MacMunn. Essa história você verá com mais detalhes na Aula 15. AULA 13 MÓDULO 4 Os resultados foram surpreendentes. Pequenas quantidades de malonato envenenam a respiração quase como o cianeto. Ácido fumárico estimula fortemente a respiração. A respiração rapidamente declinante dos tecidos in vitro pode ser mantida constante por longos períodos pelo ácido fumárico. Como Baumann & Stare têm mostrado no Laboratório de Keilin, igualmente alguns poucos γ de fumarato (γ γ = uma milionésima parte do grama) foram ativos. Foram consumidos vários anos de trabalho pesado para ajustar as observações contraditórias em uma teoria. A teoria é esta: os ácidos dicarboxílicos C4 são uma ligação na cadeia respiratória entre o alimento e o sistema W.K. Sua função é transferir o hidrogênio do alimento ao citocromo e reduzir por este hidrogênio seu ferro trivalente à forma divalente. Falando mais precisamente, o citocromo oxida dois átomos de hidrogênio da molécula de ácido succínico. Pela perda de dois átomos de hidrogênio, o ácido succínico é convertido a ácido fumárico. Estes dois átomos de H perdidos são recolocados novamente por hidrogênios oriundos do alimento. O alimento, entretanto, não cede seus dois hidrogênios imediatamente ao ácido fumárico. Ele cede seus 2 átomos de hidrogênio para o ácido oxaloacético, que é também um ácido dicarboxílico (C4). Por tomar 2H, o ácido oxaloacético volta a ácido málico. Ácido málico, então, cede seus dois hidrogênios ao ácido fumárico, e, assim, o ácido fumárico é convertido a ácido succínico. Este pode ser outra vez oxidado por citocromo, enquanto o ácido málico, após ceder seus 2Hs, torna-se ácido oxaloacético, que pode tomar hidrogênio do alimento novamente, e assim o jogo recomeça, hidrogênios sendo transmitidos todo o tempo do alimento via oxaloacético málico fumárico succínico ao sistema W.K. CEDERJ 21

BIOQUÍMICA II Ciclo de Krebs - Parte 1 O resumo esquemático da história está a seguir: Fermentação Ácido láctico C O HCOH Esquema 13.1: Esse esquema geral você já conhece. Respiração Esquema 13.2 Levando em conta o esquema proposto por Szent-Györgyi, que transformações você verifica em cada etapa desta seqüência de reações? Qual o papel das trioses nos processos fermentativos e oxidativos propostos por Szent-Györgyi? O que ocorreria nesta seqüência de reações na presença e na ausência de O2? 22 CEDERJ

Chegamos então ao primeiro esquema que tentava explicar como ocorre a respiração celular (ver Esquema 13.2). O próximo passo foi a observação de que a adição de pequenas quantidades de ácidos orgânicos ativava tremendamente essa via. Este efeito, chamado efeito catalítico, já havia sido observado por Krebs durante a descoberta do ciclo da uréia (que você conhecerá na Aula 18). A respeito da oxidação dos ácidos orgânicos e o efeito catalítico do ácido succínico, Krebs escreveu: AULA 13 MÓDULO 4 Szent-Györgyi reportou experimentos em 1935 e 1936 que sugeriam que o ácido succínico e seus derivados ácido fumárico, ácido málico e ácido oxaloacético cataliticamente promovem oxidação em tecidos musculares. Provas conclusivas deste efeito catalítico foram apresentadas por Stare & Baumann em dezembro de 1936. Estes autores mostraram que pequenas quantidades destas substâncias eram suficientes para provocar um aumento na respiração e que o aumento é um múltiplo da quantidade de oxigênio necessária para a oxidação das substâncias adicionadas. Além disso, a substância adicionada não foi usada, mas pode ser subseqüentemente detectada no meio. Assim, não permanece nenhuma dúvida de que o ácido succínico e substâncias relacionadas podem atuar como catalisadores na respiração. Fonte: KREBS H. A.; CAMBRIDGE, M. A.; HAMBURG M. D. The intermediate metabolism of carbohidrates. De acordo com esta passagem, tal efeito catalítico exercido pelos ácidos orgânicos C4 pode ser explicado com a seqüência de reações proposta por Szent-Györgyi? A seqüência de reações de Szent-Györgyi explica convenientemente a equação de Lavoisier? EFEITO CATALÍTICO DO ÁCIDO CÍTRICO O passo seguinte foi a descoberta de que o ácido cítrico também atua como ativador catalítico (Krebs e Johnson, 1937). Adicionado ao músculo em pequenas quantidades, ele acelera a oxidação de carboidratos da mesma maneira que o ácido succínico. A análise experimental deste efeito revelou não somente o mecanismo da ação catalítica do ácido cítrico, mas também do ácido succínico e compostos relacionados. Em adição, isto levou à elucidação dos principais passos na degradação oxidativa de carboidratos. CEDERJ 23

BIOQUÍMICA II Ciclo de Krebs - Parte 1 O DESTINO DO ÁCIDO CÍTRICO O ácido cítrico, por longo tempo, foi conhecido como sendo facilmente oxidável em tecidos vivos, embora os detalhes de seu metabolismo intermediário tenham permanecido obscuros até março de 1937, quando Martius e Knoop descobriram que o ácido α-cetoglutárico é um produto da oxidação do ácido cítrico. O destino do ácido no corpo já era bem conhecido. Esta substância tinha grande interesse fisiológico, já que apareceu como um intermediário na degradação de ácido glutâmico, de prolina e de histidina. Já se sabia que ele forma, na oxidação, ácido succínico e dióxido de carbono. 24 CEDERJ

Á C I D O MALÔNICO Ou malonato é um inibidor da respiração celular, no passo de formação do succinato no ciclo do ácido cítrico. Considerando a junção das duas reações imediatamente anteriores, é possível passar do ácido cítrico ao ácido succínico, e esta reação pode ser diretamente demonstrada se ácido malônico é adicionado. ÁCIDO MALÔNICO inibe especificamente a oxidação do ácido succínico, mas não inibe a degradação do ácido cítrico e ácido α-cetoglutárico. Qual a relação entre tais reações e a seqüência de reações de Szent-Györgyi? AULA 13 MÓDULO 4 Krebs sabia que a síntese de ácido cítrico, a partir de ácido oxaloacético, era conduzida pela condensação com uma segunda substância, cuja natureza química não era ainda conhecida. Supunha-se que a segunda substância fosse derivada de um carboidrato e apostava-se que seria o ácido pirúvico. A condensação desta segunda substância com o acido oxaloacético para formar ácido cítrico foi formulada da seguinte maneira por Krebs (veja reação a seguir): 3 PS. A nomenclatura das moléculas apresentadas é aquela utilizada nos trabalhos da época. CEDERJ 25

BIOQUÍMICA II Ciclo de Krebs - Parte 1 Este esquema, ainda que suportado por evidência experimental, é, em parte, hipotético e, por esta razão, vamos abster-nos da discussão de detalhes; mas deve ser enfatizado que o efeito final, que é a síntese de ácido cítrico na presença de ácido oxaloacético, é um fato experimental. Martius e Knoop Baseado nos resultados mostrados acima e nas citações, proponha um esquema de reações que explique o efeito catalítico do ácido cítrico e do α-cetoglutarato, integrando as trioses nesta seqüência. A SUBSEQÜENTE ELABORAÇÃO DO CICLO DOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS O esquema básico de 1937 tem resistido ao teste do tempo. Existem evidentemente grandes vazios em relação ao mecanismo da formação do citrato a partir de oxaloacetato e piruvato. Citado em H. Krebs (1970) The history of the tricarboxylic acid cycle. Perspect. Biol. Med. 14: 151-170 A solução deste problema esperou pela descoberta da coenzima A (CoA) por Lipmann, na década de 1940. No mesmo período, Ochoa e Lynem mostraram que a acetil- coenzima A (acetil-coa) é o intermediário que reage com o oxaloacetato para formar citrato. 26 CEDERJ

Além disso, a coenzima A foi também encontrada como participante na formação de succinato a partir de α-cetoglutarato, formando succinil coenzima A (succinil-coa) como intermediário. AULA 13 MÓDULO 4 Com base nessas informações, construa o seu esquema representando o ciclo do ácido cítrico. Se você acompanhou o texto e conseguiu construir seu ciclo com base nas informações apresentadas, parabéns. Isso não é fácil. Se você não conseguiu, consulte os tutores de Bioquímica e discuta suas dificuldades com eles. Ao chegar ao final desta aula, você já conhece o ciclo do ácido cítrico ou grande parte dele. Neste caso, a próxima aula será apenas para detalhar o que você já sabe. Nela você verá cada reação, o nome das enzimas, co-fatores e outros papéis metabólicos que o ciclo apresenta. Não esqueça que os exercícios virão no final do módulo. R E S U M O Nesta aula nós vimos a história do ciclo do ácido cítrico, seus principais personagens e as etapas iniciais de elucidação dessa via. A evolução do conceito de Lavoisier até chegar aos principais intermediários e reações do ciclo. CEDERJ 27