BIOTECNOLOGIAS EMPREGADAS NA MEDICINA VETERINÁRIA Biotecnologia
O que é isso??? É qualquer técnica que utilize organismos vivos ou suas partes, para fazer ou modificar produtos, melhorar plantas ou animais ou desenvolver microorganismos para usos específicos.
Amplificação reprodutiva Reprodução animal: Limitação na capacidade natural na reprodução Capacidade de serviço Produção e qualidade de sêmen Número de progênie por reprodutoras
Inseminação Artificial Processo de espermatogênese: Bovinos 61 dias; Eqüinos 55 dias; Ovinos 47 dias e Suínos 39 dias; Fatores que afetam a produção de espermatozóides Idade Ambiente Níveis hormonais Tamanho do testículo
Etapas da Inseminação Artificial Seleção de machos» Informações sobre os animais ( DEP) Coleta do sêmen» Vagina artificial» Eletro ejaculação» Métodos manuais Avaliação do sêmen» Motilidade» Concentração» Morfologia» volume Diluição do sêmen Utilização do sêmen» Fresco» Refrigerado» Congelado
Usos da Inseminação Artificial Melhoramento genético Diminuir a relação macho/fêmea Organização de Testes de progênie Acasalamento em diferentes raças Absorção de raças que se deseja criar Conservação de raças em perigo de extinção Controle de doenças Eliminação de custos de produção e manutenção de machos no estabelecimento Facilidade de coletas de dados sobre paternidade Disseminação de genes superiores de animais corretamente avaliados que levam ao aumento de produção
Transferência de embrião (TE) Definição: Implantar em fêmeas receptoras embriões produzidos por fêmeas doadoras (0 até 30 Embriões) No que consiste a TE???» Estimulação hormonal superovulação» Inseminação Artificial ou fecundação Natural» Coleta e armazenamento de embriões» Preparação das receptoras e transferência
ETAPAS DA TE Seleção de doadoras para TE Machos e fêmeas com genótipo comprovadamente superiores Escolha das características a serem melhoradas Escolha das receptoras Aspectos sanitários Superovulação Resposta das doadoras ( 10-15 % não respondem) Hormônio mais utilizado FHS
ETAPAS DA TE Inseminação Artificial 7 dias após o inicio da superovulação; Utiliza-se sêmen congelado. Coleta de embriões 6-7 dias após a IA; Recuperação de embriões (transcervical) Sonda de coleta, fixada num dos cornos Taxa embrião x corpo lúteo : 70 %
Etapas da TE Isolamento e classificação de embriões Avaliação morfológica: microscopia óptica Observa-se» Tamanho;» Forma ;» Cor ;» Citoplasma;» Membrana pelúcida e vesículas 6 categorias ( excelente e não fecundado)
Etapas da TE Estocagem de embriões Objetivo: Manter a viabilidade dos embriões por varias horas ou dias fora do trato reprodutivo da fêmea A fresco: fêmeas aptas a transferência. Congelado (Crio preservação): glicerol, etileno-glicol, ISOCRIOGEN. Técnicas de descongelamento: Banho maria, re-hidratação
Etapas da TE Sincronização do ciclo estral das receptoras Objetivo: conseguir que as fêmeas estejam em cio no momento desejado tanto para a IA como TE. Melhora as chances de implantação, melhora a taxa de prenhes Hormônios utilizados: prostaglandina, progestagenos.
Etapas da TE A transferência do embrião (inovulação) Objetivo: Posicionar o embrião no útero da receptora Técnica: Não cirúrgica ( inovulação trans-cervical) Local da introdução do pailletes: corno uterino com deposição do embrião na junção útero-tubárica. Resultado: 2 a 3 meses após a TE realiza-se o diagnostico de gestação nas vacas receptoras, que 9 meses após a TE darão origem a animais geneticamente semelhantes a progênie das vacas doadoras de embriões e aos touros utilizados na IA.
FATORES QUE AFETAM A EFICÁCIA TE: Resposta individual de cada vaca a estimulação hormonal Nível técnico da equipe que conduz a TE; Escolha das técnicas da coleta e TE; Grau de sincronização do cio entre o ciclo estral das fêmeas doadoras e receptoras; Fertilidade natural das doadoras; Qualidade do sêmen utilizado Qualidade dos embriões Nutrição e manejo dos animais OBS: Embriões normais, equipe capacitada,animais saudáveis e em época de ciclo adequados : taxa de eficiência de 50 %.
USOS da TE Obtenção de maior número de progênie de fêmeas de alto valor genético; Expansão rápida de núcleos de vacas selecionadas; Controle na transmissão de doenças; Comércio de embriões; Teste de homozigose para genes dominantes. Conservação de raças em perigo de extinção, pela crio-preservação
Limitações da TE Impacto menor no melhoramento genético do que a IA; Tecnologia complexa e mais cara; Uso de mão de obra especializada.
SEXAGEM DE SEMÊN Determinação do sexo do espermatozóide: Y ou X Vantagens: Melhor programação das populações Maior ganho na produção de carne e leite Facilidade em direcionar reposição de matrizes Ganhos genéticos e redução de tempo na seleção de plantéis Garantia de acurácia acima de 85% na determinação do sexo Melhor direcionamento nos testes de progênies Poder de decisão passa para as mãos do pecuarista A aplicação comercial de sêmen sexado já existe no Brasil desde 2004. Atualmente a acurácia fica em torno de 90 %. Devido ao alto custo, em relação ao sêmen não sexado, recomenda-se utilização de fêmeas com bom histórico reprodutivo, e em condições ideais de mineralização, vermifugação, vacinação e conforto
Fertilização IN VITRO Definição : Embriões são produzidos fora do corpo da fêmea Etapas: Coleta de ovócitos na fêmea: Laparoscopia Maturação dos ovócitos in vitro; Capacitação dos espermatozóides; Desenvolvimento do embrião até blastocisto. Implantações de embriões nas fêmeas receptoras. OBS: Eficiência da técnica até 40% (embriões viáveis / ovócito maduro)
Sexagem de embriões É a disponibilidade de embriões cujo o sexo já esteja previamente determinado. Técnica: Amplificação enzimática dirigida de DNA ( PCR), com kit comercial. Vantagem: Produção de machos ou fêmeas de acordo com os objetivos da produção Desvantagens: As técnicas ainda são caras e sujeita a erros
CLONAGEM Definição: a clonagem é um processo de reprodução assexuada, onde são obtidos indivíduos geneticamente iguais (microorganismo, vegetal ou animal) a partir de uma célula-mãe Ocorre de forma natural no caso de gêmeos univitelínos É um meio de propagação comum em plantas, bactérias e protozoários Ainda não existe comercialmente a venda de embriões clonados Uso no melhoramento: Possibilidade da multiplicação de animais geneticamente superiores em larga escala. Desvantagem no melhoramento genético: Perda da variabilidade genética, no aspecto de resistência a doenças, fatores climáticos
Animais trangênico Definição : Possui em seu genoma um DNA estranho (de outra espécie geralmente), integrado de forma estável, em que se transmite a sua descendência de acordo com as leis de genética Mendeliana. Técnica: micro manipulação ou vírus: introdução, modificação ou inativação de um gene. Aplicação no melhoramento: aumento de produção: carne, lã, resistência a doenças, e modificação de produtos (maciez da carne, nível colesterol da carne, lactose) Limitação: técnica ainda em desenvolvimento, aceitação quanto ao consumo dos produtos, pouco conhecimento sobre os efeitos na saúde humana.
Estudo com animais trangênicos Suínos: bgh ( hormônio de crescimento bovino) Vantagens: aumento do crescimento; aumento na conversão alimentar; mudança na composição da carcaça; redução da espessura de gordura subcutânea Efeitos adversos: aumento dos níveis circulantes do plasma ( ulceras, artrites, problemas cardíacos, dermatites e IR: pouco tempo de vida) Bovino: lacto albumina ( proteína humana) Esse leite transgênico é mais nutritivo para humanos que o leite natural, e poderia ser introduzido na alimentação de crianças com carência de nutrientes específicos.
Controle na produção de Animais trangênicos Comissão do Codex alimentarius (Lei alimentar ou Código alimentar, em latim), estabelecida conjuntamente pela FAO (Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a Alimentação) e pela OMS (Organização Mundial da Saúde), está trabalhando em colaboração com vários países, dentre eles o Brasil, com o objetivo de criar normas de aplicação internacional visando a segurança de alimentos produzidos a partir desses animais.
MARCADORES GENÉTICOS Identificar ou etiquetar alguma coisa 1923: feijão com ausência de cor escura no tegumento x tamanho do semente : seleção de forma indireta (tegumento claro = marcador) Qualidade de um bom marcador» Herdável» Fácil observação» Herdabilidade alta» Intimamente relacionado ao alelo que desejamos selecionar OBS: Essas qualidades tornam mas eficientes a seleção indireta Os marcadores genéticos podem ser morfológicos e moleculares.
MARCADORES MORFOLOGICOS Fenótipo de fácil identificação Normalmente determinada por único alelo. Exemplo 1: planta de milho jovem verde clara x esterilidade masculina ( fenótipo importante na produção de híbrido mas de difícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem alta probabilidade de serem herdados juntos) Exemplo 2: cor amarela do milho x teor de vitamina (o mesmo alelo para ambas características: mais fácil selecionar pela cor) Limitação dos marcadores morfológicos: Ocorrência em numero reduzido Muitas características de interesse econômico não tem marcador morfológico Muitos marcadores que apresentam baixa herdabilidade
Marcadores que utilizam o próprio DNA São os próprios genes ou seus vizinhos, isto é seqüências de DNA situadas próxima ao gene que se deseja marcar Vantagens; Grande variabilidade entre indivíduos Numero de marcadores suficientes para marcar todos os alelos de todos os genes que se deseja marcar. Desvantagens: Técnicas laboratoriais mais caras
RFLP Significa polimorfismo de comprimentos de fragmentos de restrição (obtidos por corte de fita dupla de DNA). Isolamento do DNA dos indivíduos Enzimas de restrição que geram milhares de fragmentos Separação por eletroforese ( tamanhos das seqüências) Observa-se polimorfismo entre indivíduos diferentes Hibridização com DNA marcado radioativamante (sonda), P radioativo Fotografia do fragmento identificado pela sonda Admitindo-se que o fragmento de DNA identificado pela sonda esteja intimamante ligado a um alelo de interesse, pode se selecionar esse alelo por meio desse fragmento. Assim o fragmento RFLP funciona como um marcador ou etiqueta do alelo de interesse.
AFLP AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) Significa o Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados. O AFLP combina a especificidade, resolução e poder de amostragem da digestão com enzimas de restrição e a praticidade e velocidade do PCR. ETAPAS Clivagem com 2 enzimas de restrição; Ligação de adaptadores específicos; São sintetizados inicializadores complementares aos adaptadores; Amplificação seletiva ( reação de PCR) Eletroforese.
Microssatélites Seqüências curtas (2 a 5 pb) Repetições em tandem (6 a 8 nucleotídeos = mais comuns TG/AC) Mais utilizada em mapeamento genético Necessita-se de primers específicos para as regiões de DNA que flanqueiam os microssatélites Detectam altos níveis de polimorfismo
SNP(Single Nucleotide Polymorphism) Marcadores moleculares de DNA que identificam polimorfismos com base em um único nucleotídeo São fontes abundantes de variação genética Vantagem: Possibilidade de detecção de grande quantidade de polimorfismos entre alelos De todos os marcadores moleculares, são os de mais cara técnica laboratorial
P= G+A
VP = VG + VA
Uso de marcadores no estudo de caracteres quantitativos Caracteres quantitativos Controlados por vários genes de pequeno efeito Sofrem maior influencia ambiental Não se sabe quanto ele contribui para o fenótipo QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caractere quantitativo identificado por marcadores moleculares. Finalidade: determinar quanto de um caractere quantitativo é explicada por um ou mais marcadores Como os caracteres quantitativos são medidos por meio de médias os variâncias, pode-se ter idéia da porcentagem do fenótipo do caractere que é explicado pelo marcador.
QTL São regiões cromossômicas relacionadas com variação fenotípicas das características quantitativas Limitações: Dificuldade de avaliação dos caracteres quantitativos aliados a necessidade de ligação dos marcadores com os QTL Dificuldade de obtenção dos próprios marcadores Estudo difícil e trabalhoso Obs: Há necessidade de mais pesquisas para tornar mais eficientes o emprego dos marcadores moleculares no estudo das características quantitativas