Título: Sistema de Apoio à Análise Automática de Comportamento Animal em Laboratório

TOPOLINO - Sistema de Apoio à Análise Automática de Comportamento Animal em Laboratório Albert Schiaveto de Souza 1, Hemerson Pistori 2, João José Neto 3 1 Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, CCBS 2 Grupo de Pesquisa em Engenharia e Computação, GPEC Universidade Católica Dom Bosco, UCDB, Av. Tamandaré, 6000, Jardim Seminário, Campo Grande, MS, Brasil, 79117-900 3 Laboratório de Linguagens e Técnicas Adaptativas, LTA Universidade de São Paulo, USP, Av. Prof. Luciano Gualberto. Trav. 3 N. 158, São Paulo, SP, MS, Brasil, 05508-90 Resumo Uma fase importante no desenvolvimento de um novo fármaco consiste na avaliação de seu efeito no comportamento de ratos e camundongos. Experimentos com ratos e camundongos exigem a observação visual desses animais em ambientes controlados e a extração de informações relacionadas, por exemplo, com a trajetória, velocidade e o tipo dos movimentos realizados. Esse projeto tem por objetivo o desenvolvimento de um software livre capaz de processar as imagens capturadas através de um dispositivo de captura de baixo custo, como uma webcam, e extrair automaticamente as informações relevantes para a análise de determinados comportamentos. 1 Dados do Projeto Sigla: TOPOLINO Título: Sistema de Apoio à Análise Automática de Comportamento Animal em Laboratório 1

Área de concentração (CNPq), Alternativa I: 3.00.00.00-9 Engenharias, 3.04.00.00-7 Engenharia Elétrica, 3.04.02.00-0 Medidas Elétricas, Magnéticas e Eletrônicas; Instrumentação, 3.04.02.05-0 Sistemas Eletrônicos de Medida e de Controle. Área de concentração (CNPq), Alternativa II: 1.00.00.00-3 Ciências Exatas e da Terra, 1.03.00.00-7 Ciência da Computação, 1.03.04.00-2 Sistemas de Computação, 1.03.04.03-7 Software Básico. Duração 24 meses. 2 Antecedentes e Justificativa O estudo do comportamento de animais é de suma importância para responder questões etológicas básicas [1]. Além disso, um dos passos no desenvolvimento de novos fármacos ou terapias consiste na avaliação destes tratamentos sobre o comportamento de animais de laboratório, antes que eles sejam testados clinicamente em seres humanos. A observação visual e o registro manual do comportamento têm sido amplamente utilizados, pois eles podem ser implementados com um investimento relativamente baixo, além de que para alguns comportamentos, esta pode ser a única maneira de documentar a sua ocorrência. Todavia, por causa das diferenças inter-observadores, os resultados obtidos por este método de estudo nem sempre são suficientemente reprodutíveis. Outro problema freqüentemente observado é que o registro manual dos comportamentos pode, em alguns casos, demandar um grande período de tempo e exigir um trabalho exaustivo do pesquisador. Embora existam no mercado alguns softwares para ajudar o pesquisador na sumarização dos resultados, as anotações dos comportamentos de interesse permanecem sendo um trabalho quase que totalmente manual, além de que esta análise pode apresentar vários problemas. Primeiro, a documentação do comportamento pode continuar sendo um trabalho exaustivo. Além disso, mesmo com a ajuda de algum software mais recente, o observador deve ainda decidir na classificação de cada comportamento. Por causa disso, um outro problema é adicionado, o componente subjetividade ou viés, que pode ocorrer quando vários indivíduos classificam o comportamento [2]. Por outro lado, sistemas de observação totalmente automatizados podem freqüentemente prover muitas vantagens. Entre elas, o sistema não sofre de fadiga do observador, assim, as observações podem ser mantidas por tempo indefinido [3, 4], além de que os eventos são registrados de forma mais fidedigna, pois os algoritmos sempre trabalham da mesma forma, sem qualquer influência da subjetividade do observador. Portanto, desde que foram inicialmente introduzidos no início de 1990, os sistemas de rastreamento computadorizado de animais de laboratório, oferecem grandes vantagens de flexibilidade, 2

resolução espacial e precisão temporal em estudos etológicos e de análise comportamental em resposta a novos tratamentos ou manipulações [4]. 3 Objetivos 3.1 Geral Desenvolvimento de um sistema computadorizado de segmentação e rastreamento de animais de laboratório, em ambientes controlados, utilizando técnicas de visão computacional, por meio de um software livre capaz de processar as imagens capturadas e de extrair automaticamente as informações relevantes para a análise de comportamentos específicos. 3.2 Específicos 1. Determinar parâmetros qualitativos e quantitativos, em experimentos com camundongos, cuja extração e cálculo sejam passíveis de automatização através de técnicas de visão computacional. 2. Desenvolver sistemas automáticos para rastreamento de camundongos em ambientes controlados. 3. Implementar módulos de extração e cálculo de parâmetros para análise comportamental de camundongos. 4. Desenvolver sistema de controle de experimentos e laboratórios. 5. Capacitar recursos humanos na área em estudo. 4 Revisão de Literatura A análise computadorizada do comportamento animal tem sido baseada nos trabalhos pioneiros de estudo do movimento (para uma revisão, veja [5, 6]). Os fundamentos de tal sistema são que os animais se relacionam com o seu ambiente tanto espacial quanto temporalmente [7]. Segundo Fentress [7] e Golani & Fentress [8], tais sistemas computadorizados de registro do comportamento facilitam estudos quantitativos do comportamento animal, contanto que os padrões do comportamento normal e anormal estejam bem estruturados. A tecnologia para detecção automatizada e registro do comportamento animal e movimento tem evoluído dramaticamente na última década [9]. Entre os vários métodos desenvolvidos pode-se citar aquele em que o movimento animal é detectado por uma trama de raios infravermelhos ou por uma série de transdutores de pressão sob a arena para estimar a posição do animal [10]. O movimento do animal pode ainda ser estimado, dentre muitos métodos disponíveis, usando vários tipos de detectores sensíveis ao toque, medindo a quantidade de giros em uma roda de exercícios, avaliando a capacitância de uma placa de quando o animal está próximo a ela [11] ou até mesmo mensurando a 3

resistência elétrica do corpo do animal [12]. Outros métodos de detecção comparáveis incluem o uso de ultra-som [13] e de microondas [14]. Os sistemas desenvolvidos mais recentemente são baseados em softwares mais flexíveis e podem rastrear múltiplos animais simultaneamente em uma variedade de superfícies complexas [9]. A aplicação de rastreamento por vídeo é particularmente apropriada para medir três tipos de comportamentos: comportamentos que ocorrem de forma breve e então são sucedidos por longos períodos de inanição (comportamentos raros [15]), comportamentos que ocorrem por várias horas (análise da variação diurna de determinado comportamento [16, 17]), e de medidas espaciais (por exemplo, distância, velocidade, giros, etc. [18, 19]) que o observador humano é incapaz de estimar exatamente. Portanto, se um comportamento puder automaticamente ser detectado, o uso do rastreamento por vídeo pode reduzir em muito o esforço humano requerido [17]. Isto reduz não somente custos, mas permite uma replicação maior das respostas, com menor variação interindivíduos, o que poupa tempo e reduz o número total dos animais a serem utilizados em uma pesquisa (porque cada rato pode ser usado muito mais eficientemente). Uma grande vantagem do rastreamento automatizado é que ele força que os investigadores definam exatamente o que significa um determinado comportamento, permite assim uma padronização das metodologias [3], que é uma das maiores necessidades dos estudos etológicos [20 22]. 5 Metodologia A metodologia básica de desenvolvimento do Sistema de Apoio à Análise Automática do Comportamento Animal em Laboratório (TOPOLINO) é a de projeto e programação orientada a objetos. O reaproveitamento de códigos livres também é uma outra característica central da metodologia. Dois pacotes livres, com fontes em linguagem Java, serão intensivamente utilizados: o ImageJ, para processamento digital de sinais e o SIGUS, para implementação de sistemas de visão computacional 1. A linguagem Java foi escolhida por ser altamente portável e por possuir boas ferramentas automáticas, livres e gratuitas, que facilitam a geração de documentação de programas-fonte. Definimos abaixo as etapas metodológicas relacionadas com cada um dos objetivos específicos definidos na seção 3.2. As siglas AS, HP e PM, entre colchetes, referem-se aos pesquisadores Albert Schiaveto [AS], Hemerson Pistori [HP] e João José Neto [JJ], e estão sendo utilizadas para indicar os responsáveis pela tarefa. 1. Determinar parâmetros qualitativos e quantitativos, em experimentos com camundongos, cuja extração e cálculo sejam passíveis de automatização através de técnicas de visão computacional. (a) Entrevistas com especialistas e revisão de literatura para identificação dos principais parâmetros, visualmente identificáveis, utilizados na análise do comportamento de camundongos. [AS] 1 O pacote SIGUS está sendo desenvolvido pelos pesquisadores do grupo de pesquisa em engenharia e computação da UCDB, o GPEC 4

(b) Classificação dos parâmetros quanto ao tipo de métricas ou características utilizadas em sua medição ou determinação (e.g. distâncias, quantidades, localizações, formas, etc). [AS] (c) Identificação das técnicas computacionais que deverão ser utilizadas na extração dos diferentes tipos de parâmetros. [HP] (d) Criação de um banco de imagens digitais, manualmente rotuladas, para identificar os principais parâmetros a serem extraídos pelo sistema automático. [HP] 2. Desenvolver sistemas automáticos para rastreamento de camundongos em ambientes controlados. (a) Identificação dos filtros de processamento digital de imagens, como por exemplo, filtros de eliminação de ruído e melhoria de contraste, que serão utilizados para pré-processar as imagens que alimentarão o sistema TOPOLINO.[HP] (b) Projeto, implementação e teste dos filtros. [HP] (c) Projeto, implementação e teste de um módulo para segmentar imagens contendo camundongos.[hp,jj] (d) Projeto, implementação e teste de um módulo para rastrear o camundongo em seqüências de imagens.[hp,jj] (e) Integração dos filtros com os módulos de segmentação e rastreamento.[hp] (f) Teste com os módulos integrados. [HP] (g) Produção de documentação para os módulos implementados.[hp] 3. Implementar módulos de extração e cálculo de parâmetros para análise comportamental de camundongos. (a) Projeto, implementação e teste dos algoritmos de extração de parâmetros que exigem a análise de movimento.[hp,jj] (b) Projeto, implementação e teste dos algoritmos de extração de parâmetros atemporais.[hp,jj] (c) Integração dos módulos de extração com o módulo de rastreamento.[hp] (d) Identificação, a partir de experimentos em campo, das condições em que o sistema de extração de atributos obtem o melhor desempenho. [AS] (e) Produção de documentação para os módulos. [AS] 4. Desenvolver um sistema de controle de experimentos e laboratórios. (a) Projeto, implementação e teste do banco de dados contendo informações sobre experimentos com animais. [AS] (b) Projeto da interface do sistema TOPOLINO com base em entrevistas com usuários e análise de sistemas similares. [AS] 5

(c) Implementação e testes da interface [AS] (d) Integração da interface com o banco de dados e com os módulos de rastreamento e extração de atributos. [AS] (e) Testes do sistema TOPOLINO com o experimento do campo aberto. [AS] (f) Testes com o experimento do labirinto em cruz. [AS] (g) Realização de ajustes com base nos resultados dos testes. [AS] (h) Produção de documentação técnica para o sistema TOPOLINO. [AS] (i) Produção do manual de utilização do sistema TOPOLINO. [AS] 5. Capacitar recursos humanos na área em estudo. (a) Criação e manutenção de um Website dedicado aos assuntos relacionados com o projeto. [AS,HP] (b) Produção de material didático para a área de visão computacional aplicada à automatização de análise comportamental de animais. [AS,HP] (c) Realização de minicursos e cursos de extensão sobre o tema do projeto. [AS,HP] (d) Elaboração e apresentação de artigos técnicos/científicos com resultados intermediários. [AS,JJ,HP] (e) Elaboração e apresentação de artigos técnicos/científicos com resultados finais. [AS,JJ,HP] 6

6 Cronograma Ano I Ano II Etapa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1.a X 1.b X X 1.c X X 1.d X X X 2.a X 2.b X X X X 2.c X X X 2.d X X X X 2.e X X X X 2.f X X X 2.g X X X 3.a X X X X X X 3.b X X X X X 3.c X X X 3.d X X X 3.e X X X 4.a X X X 4.b X X X X X X 4.c X X X X X 4.d X X X X 4.e X X X X 4.f X X X 4.g X X X 4.h X X X 4.i X X X 5.a X X X X X X X X X X X X 5.b X X X X X X 5.c X X 5.d X X 5.e X X 5.f X X 7 Resultados Esperados Desenvolvimento de um sistema de visão computacional que: Seja flexível e permita a análise de vários aspectos relevantes do comportamento locomotor de animais de laboratório; Tenha uma resolução tal que produza resultados fidedignos e com alta reprodutibilidade; 7

Possa rastrear e registrar o comportamento dos animais por tempo prolongado; Tenha uma linguagem operacional simples e de fácil manuseio aos pesquisadores; Seja apresentado na forma de um software livre; Seja de baixo custo; 8 Impactos 8.1 Tecnológico Permitir a quantificação de comportamentos de medidas espaciais (por exemplo, distância, velocidade, giros, etc.) que o observador humano é incapaz de estimar exatamente na observação apenas visual; 8.2 Científico Permitir em laboratório uma análise mais reprodutível do comportamento motor de animais de laboratório em estudos etológicos ou no desenvolvimento de novos fármacos e terapias; Poupar tempo e trabalho aos pesquisadores na análise do comportamento animal, principalmente em estudos em que a observação do animal deve ser feita por períodos prolongados; 8.3 Econômico Prover aos pesquisadores locais e externos um sistema de rastreamento de animais de laboratório flexível, o qual permita a análise de vários aspectos do comportamento locomotor animal, a um custo razoavelmente baixo, quando comparado com outros sistemas existentes no mercado, desenvolvidos fora do país; Viabilizar a criação de laboratórios regionais para terceirização das fases de testes de fármacos. A própria Universidade Católica Dom Bosco poderá vir a ser tornar uma prestadora de serviços nessa área. 8.4 Social A redução de custos, mesmo com aumento de qualidade, na fase de testes de novos fármacos, poderá se refletir em remédios mais baratos para a população. Além disso, um novo nicho de mercado poderá começar a ser explorado em nossa região, gerando novas possibilidades de negócio e oportunidades de emprego. 8

8.5 Ambiental A automatização e a coleta de imagens digitais, que podem ser reavaliadas sempre que necessário, implicará em uma redução na quantidade de experimentos aos quais os animais deverão ser submetidos. Extensões do sistema que será implementado poderão vir a permitir a automatização de experimentos realizados em campo, envolvendo observação de animais em seu habitat natural. A utilização de filmadoras digitais, acopladas a um sistema computacional de reconhecimento de comportamentos de interesse para uma determinada pesquisa, poderá melhorar a qualidade das observações, ao diminuir o impacto da inserção de seres humanos no local dos experimentos. 9 Estratégias de Difusão dos Conhecimentos Gerados 1. Os resultados deste projeto serão disponibilizados através de um endereço na Internet. 2. Também será criada uma lista de discussão específica para o sistema TOPOLINO, incluindo os desenvolvedores do software, que poderão, através da Internet, esclarecer dúvidas e trocar informações. 3. A equipe deverá participar de eventos, em áreas relacionadas ao projeto, para divulgar os resultados obtidos. 4. Um mini-curso sobre o TOPOLINO deverá ser criado e oferecido. 10 Possíveis Parceiros Universidades e centros de pesquisa que desenvolvem trabalhos em biológica básica, e que hoje utilizam equipamentos importados, de alto custo, ou realizam os experimentos manualmente. Indústria farmacêutica. Órgãos governamentais que tratam de questões relacionadas ao meio ambiente e de cuidados com animais. Referências 1 MORROW-TESCH, J.; DAILEY, J. W.; JIANG, H. A video data base system for studying animal behavior. Journal of Animal Science, v. 76, n. 10, p. 2605 2608, 1998. 2 NOLDUS, L. P.; SPINK, A. J.; A.J, R. Tegelenbosch computerised video tracking, movement analysis and behaviour recognition in insects. Computers and Electronics in Agriculture, v. 35, p. 201 227, 2002. 9

3 SPRUIJT, B. M. et al. Automatic behavior recognition: what do we want to recognize and how do we measure it? In: Proceedings of Measuring Behavior. Groningen, Netherlands: [s.n.], 1998. p. 264 266. 4 NOLDUS, L. P.; SPINK, A. J.; TEGELENBOSCH, R. A. Ethovision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, v. 33, n. 3, p. 398 414, 2001. 5 ESHKOL, N.; WACHMANN, A. Movement notation. Weiden & Nicholson, 1958. 6 FENTRESS, J. C. Dynamic boundaries of patterned behaviour: Interaction and self-organization. In: P. P. Bateson and R. A. Hinde (Ed.) Growing Points in Ethology. Cambridge, U.K.: [s.n.], 1976. 7 FENTRESS, J. C. Emergence of pattern in the development of mammalian movement sequences. Journal Neurobiol, v. 23, p. 1529 1556, 1992. 8 GOLANI, I.; FENTRESS, J. C. Early ontogeny of face groomingin mice. Developmental Psychobiol, v. 18, p. 529 544, 1985. 9 SPINK, A. J. et al. The ethovision video tracking system - a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiology Behavior, v. 73, n. 5, p. 731 44, 2001. 10 GAPENNE, O.; SIMON, P.; LANNOU, J. A simple method for recording the path of a rat in an open field. Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, v. 22, p. 443 448, 1990. 11 CLARKE, R. L.; SMITH, R. F.; JUSTESEN, D. R. A programmable proximitycontact sensor to detect location or locomotion of animals. Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, v. 24, p. 515 518, 1992. 12 M.TARPY, R.; J.MURCEK, R. An electronic device for detecting activity in caged rodents. Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, v. 16, p. 383 387, 1984. 13 AKAKA, W. H.; HOUCK, B. A. The use of an ultrasonic monitor for recording locomotor activity. Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, v. 12, p. 514 516, 1980. 14 MARTIN, P. H.; UNWIN, D. M. A microwave doppler radar activity monitor. Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, v. 20, p. 404 407, 1988. 15 MARTIN, B. R.; PRESCOTT, W. R.; ZHU, M. Quantification of rodent catalepsy by a computer-imaging technique. Pharmacology Biochemistry and Behavior, v. 43, p. 381 386, 1992. 16 DERRY, J. F.; ELLIOTT, J. H. Automated 3-d tracking of a video-captured movement using the example of an aquatic mollusk. Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, v. 29, p. 353 357, 1997. 10

17 SPRUIJT, B. M.; GISPEN, W. H. Prolonged animal observations by use of digitized videodisplays. Pharmacol, Biochem Behav, v. 19, p. 765 769, 1983. 18 BURESOVA, O.; BOLHUIS, J. J.; BURES, J. Differential effects of cholinergic blockade on performance of rats in the water tank navigation task and in a radial water maze. Behavior Neuroscience, v. 100, p. 476 482, 1986. 19 SPRUIJT, B. M. et al. Org2766 improves performance of rats with unilateral lesions in the fimbria fornix in a spatial learning task. Brain Research, v. 527, p. 192 197, 1990. 20 WHALSTEN, D. Standardizing tests of mouse behavior: reasons, recommendations, and reality. Physiology & Behavior, v. 73, n. 5, p. 695 704, 2001. 21 BROWN, R. E.; STANFORD, L.; SCHELLINCK, H. M. Developing standardized behavioral tests for knockout and inbred mice. Institute for Laboratory Animal Research, v. 41, p. 163 174, 2000. 22 DRAI, D. et al. Phenotyping of mouse exploratory behavior. In: Proceedings of Measuring Behavior. Nijmegen, Amsterdam: [s.n.], 2000. p. 86 88. 11

11 Instituições Participantes Nome Completo da Instituição Sigla CGC/CNPJ Nome do Dirigente E-mail Telefone Universidade Católica Dom Bosco UCDB 03.226.149/0015-87 José Marinoni reitoria@ucdb.br (067) 312-3620 Universidade de São Paulo USP 63.025.530/0001-04 Adolpho José Melfi gr@usp.br (11) 3091-3500 DighitoBrasil Dighito Wilson Silva Pinto wilson@digitobrasil.com.b 12 Equipe do Projeto 12.1 Pesquisadores 12 Nome completo Título CPF Inst./Unidade e-mail Função Albert Schiaveto de Souza Doutor xxx UCDB albert@ucdb.br Pesquisador Hemerson Pistori Doutor xxx UCDB pistori@ec.ucdb.br Coordenador João José Neto Doutor xxx USP joao.jose@poli.usp.br Pesquisador 12.2 Bolsistas e Acadêmicos Nome CPF Instituição e-mail Situação Orientador Bruno Brandoli Machado xxx UCDB - EC. bmachado@acad.ucdb.br Bolsista CNPQ Hemerson Edy Alberth Kamiya xxx UCDB - EC ra082310@acad.ucdb.br TCC Hemerson João Bosco Oliveira Monteiro xxx UCDB - EC joaobmonteiro@globo.com TCC Hemerson Jonathan Andrade Silva xxx UCDB - EC ra093109@acad.ucdb.br Bolsista CNPQ Albert Wesley Nunes Goncalves xxx UCDB - EC ra093267@acad.ucdb.br Bolsista CNPQ Hemerson