EVELINE JUNQUEIRA SILVA ESPECTROSCOPIA RAMAN E HISTOPATOLOGIA CLÁSSICA NA AVALIAÇÃO DE TENDINITE INDUZIDA POR COLAGENASE EM RATOS WISTAR

EVELINE JUNQUEIRA SILVA ESPECTROSCOPIA RAMAN E HISTOPATOLOGIA CLÁSSICA NA AVALIAÇÃO DE TENDINITE INDUZIDA POR COLAGENASE EM RATOS WISTAR Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Promoção de Saúde. Orientador: Prof. Dr. César Mello Co-Orientador: Prof. Dr. Márcio Botelho FRANCA 2005

DEDICO aos meus pais, Paulo e Maria do Carmo, ao meu noivo, Gilney, e à minha irmã, Viviane, pelo amor, dedicação, incentivo e apoio em todas as etapas da minha vida, pela compreensão nos momentos de ausência e pela amizade sem fim. Vocês são os meus Anjos...

AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. César Mello, pelo incentivo, ensinamentos e orientação durante a execução deste trabalho e pelo entusiasmo em aceitar novos desafios. Ao Prof. Dr. Márcio Botelho, meu co-orientador, pelas importantes contribuições ao trabalho e pela disponibilidade e gentileza com que sempre me recebeu. Ao Prof. Ms. José Alexandre Bachur, pela inestimável ajuda, pelos valiosos conselhos, pela amizade e pelo exemplo. Aos colegas do Grupo de Espectroscopia Vibracional e Quimiometria da UNIFRAN, em especial ao Diórgenes por toda a ajuda e direcionamento durante a obtenção e tratamento dos espectros Raman, e à Márcia, pelo companheirismo, participação e empenho durante a execução do experimento. Ao Sr. Luís, funcionário do Laboratório de Dissecação de Peças, pela grande disponibilidade em compartilhar comigo um pouco da sua arte. Aos funcionários do Laboratório de Patologia, Alexandre e José Luís, pela valiosa ajuda, durante e depois da realização do experimento, e pela preparação das lâminas. Às funcionárias do Biotério, Marta e D. Hermelinda, pela alegre disposição em colaborar, aprender e ensinar. Aos Professores, estagiários e funcionários do Departamento de Química, Hospital Veterinário e Clínica de Fisioterapia da Universidade de Franca. Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação, em especial às secretárias Ana Maria e Tatiana, sempre atenciosas, competentes e dispostas a ajudar. A todos os colegas da Pós-Graduação pela amizade e convivência gratificante, especialmente Álvaro, Virgínia e Elaine, nosso Trem das Dez. Aos meus pais, pelo exemplo, pelos sacrifícios, por acreditarem em mim e por me proporcionarem alcançar mais uma conquista. Ao meu noivo, pelo carinho, por seus conselhos, por torcer por mim, pela paciência em me ouvir naquelas horas em que só você me entende e por me compreender e me esperar. À minha irmã, companheira e amiga, por dividir comigo a bagunça, as contas e a limpeza da casa, mas também pela companhia, conversas e risadas. Aos amigos e familiares, grandes incentivadores. A Deus, por tudo isso e por todos vocês... Obrigado!

RESUMO SILVA, Eveline Junqueira. Espectroscopia Raman e histopatologia clássica na avaliação de tendinite induzida por colagenase em ratos Wistar. 2005. 78 f. Dissertação (Mestrado em Promoção de Saúde) Universidade de Franca, Franca. Neste trabalho utilizou-se uma nova abordagem ainda pouco explorada para a avaliação e quantificação da tendinite através da espectroscopia Raman, com espectrômetros de baixa resolução (785 nm), e métodos quimiométricos. Para isso empregou-se o modelo experimental de tendinite produzida pela colagenase intratendínea em Rattus norvegicus variedade Wistar. A avaliação do processo inflamatório intratendíneo foi feita, além dos métodos espectroscópicos, através de estudo histopatológico clássico utilizando-se avaliação microscópica de tecidos corados com hematoxilina-eosina (HE). Propôs-se o uso de métodos matemáticos para o pré-processamento dos espectros (remoção de efeitos de matriz dos tecidos e identificação de bandas) e o uso de métodos quimiométricos de classificação para o modelamento eficiente do método desenvolvido, devido à baixa resolução do espectrômetro e similaridade estrutural do tecido avaliado, o que acarreta forte similaridade espectral. A análise dos resultados nos mostrou que é possível avaliar a evolução do processo de tendinite através da espectroscopia Raman cujos resultados foram fortemente correlacionados com os achados. Palavras-chave: Tendinite; Colagenase; Histopatologia; Espectroscopia Raman.

ABSTRACT SILVA, E.J. Raman spectroscopy and classical histology to evaluation a collagenaseinduced model of tendinitis in Wistar rats. 2005. 78 f. Dissertação (Mestrado em Promoção de Saúde) Universidade de Franca, Franca. In this work was used a new approach for the evaluation of tendinitis through Raman spectroscopy and chemometrics methods. For so much was used the experimental model of tendinitis induced by collagenase in Rattus norvegicus variety Wistar. The evaluation of the inflammatory process was done by Raman spectroscopy and classical Histological methods using microscopic evaluation of tissues stained with hematoxylin and eosin (HE). It proposes the use of mathematical methods for preprocessing of the spectra and the use of classification chemometrics methods for efficient modeling of the data, due to low resolution of the spectrometer and high similarity of the tissue evaluated. The analysis of the results showed that it is possible to evaluate the evolution of the tendinitis through Raman spectroscopy whose results were highly correlated with the histological findings. Key words: Tendinitis; Collagenase; Histology; Raman spectroscopy.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Em A temos um modelo da alfa-hélice da molécula de colágeno ilustrando os átomos de carbono (C), incluindo o Galfa. Em B temos um modelo da alfa-hélice da molécula de colágeno com inclusão dos outros átomos que compõem a estrutura principal. Em C está representada a molécula de colágeno, evidenciando a conformação de tríplice hélice incluindo os radicais que formam as cadeias laterais. Notar as ligações intermoleculares por meio de pontes de hidrogênio (H) 18 Figura 2 Em A temos a representação esquemática da tríplice hélice da molécula de colágeno e seu auto-enrolamento organizado. A conformação estrutural é resultado das forças intra e inter-moleculares. A figura B representa um corte transversal do esquema A localizando as ligações intramoleculares realizadas por intermédio das pontes de hidrogênio 19 Figura 3 Espectros Raman no infravermelho próximo de tecido cancerígeno de pulmão humano fresco. (a) Estimulado a 785nm [tempo exposto, 1 minuto; potência do laser, 46mW; largura da fenda, 50 µm (5 cm -1 )]; (b) Estimulado a 1064nm [tempo exposto, 5 minutos; potência do laser, 38mW; largura da fenda, 150 µm (9 cm -1 )] 32 Figura 4 Padrão dos espectros Raman no infravermelho próximo obtidos de tecidos de pulmões humanos cancerígenos e normais 32 Figura 5 Exemplos de bandas Raman de tecidos de artérias coronárias, excitados a 830nm, em vários estágios de aterosclerose. Notar o proeminente estiramento fosfato de hidroxiapatita de cálcio a 960 cm -1, presente somente no espectro da placa calcificada 33

Figura 6 Espectro Raman de tecido mamário (a) normal, (b) benigno e (c) maligno 34 Figura 7 Embalagem de Colagenase Sigma, C6885 39 Figura 8 Cabine Plástica com algodão embebido em Halothano 40 Figura 9 Halothano 40 Figura 10 Dissecação do tendão calcâneo comum esquerdo, Grupo II 41 Figura 11 Espectrômetro Raman 42 Figura 12 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo I (Controle). Notar aparência normal da fibras colágenas, fibroblastos e substância básica. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 47 Figura 13 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo II, lado D (1 dia após a injeção de colagenase). Notar presença de infiltrado inflamatório intenso. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 48 Figura 14 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo II, lado E (1 dia após a injeção de solução fosfato). Notar presença de infiltrado inflamatório peritendíneo moderado. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 49 Figura 15 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo III, lado D (3 dias após a injeção de colagenase). Notar presença de células inflamatórias mononucleares. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 50 Figura 16 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo III, lado E (3 dias após a injeção de solução fosfato). Notar presença de infiltrado inflamatório peritendíneo discreto HE (A e B 100x) 51

Figura 17 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo IV, lado D (7 dias após a injeção de colagenase). Notar atividade fibroblástica e neovascularização. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 52 Figura 18 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo IV, lado E (sete dias após a injeção de solução fosfato). Notar aspecto normal do tecido. HE (A 100x e B 400x) 53 Figura 19 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo V, lado D (14 dias após a injeção de colagenase). Notar produção de fibras colágenas. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 54 Figura 20 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo V, lado E (14 dias após a injeção de solução fosfato). Notar ausência de indícios de lesão (A e B) e foco degenerativo discreto (C, D, E e F). HE (A 100x; B 400x; C 40x; D 100x; E e F 400x) 55 Figura 21 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo VI, lado D (28 dias após a injeção de colagenase). Notar tentativa de reorganização tecidual. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 56 Figura 22 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo VI, lado E (28 dias após a injeção de solução fosfato). Notar ausência de indícios de lesão. HE (A 40x; B e C 100x; D 400x) 57 Figura 23 Esquema de fotos das lâminas histológicas dos grupos I [(controle) A], II [B], III [C], IV [D], V [E] e VI [F], perna D. HE (100x) 58 Figura 24 Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos estimulados a 785nm (tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW), antes de realizar o tratamento dos dados 59

Figura 25 Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos estimulados a 785nm (tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW), após tratamento quimiométrico. Notar o pico da banda amida apontado pela seta 60 Figura 26 Dendograma de dados com processamento centrado na média dos espectros dos Grupos I, II, III, IV, V e VI, lado direito 61 Figura 27 Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos do Grupo I, lado direito, e Grupo II, lado esquerdo, plotados juntos, estimulados a 785nm [tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW; largura da fenda, 150 µm (15 cm -1 )], antes de realizar o tratamento dos dados 61

SUMÁRIO INTRODUÇÃO... 13 REVISÃO DE LITERATURA... 15 1 ESTRUTURA TENDÍNEA... 15 1.1 TECIDO CONJUNTIVO DENSO... 15 1.2 COLÁGENO... 16 1.3 TENDÕES... 20 1.4 TENDINITE... 22 1.5 MODELO EXPERIMENTAL DE TENDINITE BIOQUÍMICA... 26 1.6 DIAGNÓSTICO... 26 2 ESPECTROSCOPIA RAMAN... 29 OBJETIVO... 37 MATERIAL E MÉTODOS... 38 1 ANIMAIS... 38 2 TENDINITE EXPERIMENTAL... 38 3 ESPECTROSCOPIA RAMAN... 40 4 HISTOPATOLOGIA... 43 RESULTADOS... 45 1 RESULTADOS DA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA... 45 2 RESULTADOS DA ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA RAMAN... 59 DISCUSSÃO... 62

CONCLUSÃO... 68 REFERÊNCIAS... 69 ANEXOS... 74

13 INTRODUÇÃO Tendinite é uma condição na qual o tendão agredido exibe uma resposta inflamatória (KHAN et al., 1999; HYMAN, RODEO, 2000). Deve-se levar em conta, porém, que em todos os casos de lesões tendíneas a inflamação é a parte inicial do processo de reparação tecidual (SALATE, 2002). Estima-se que lesões tendíneas por sobrecarga, incluindo-se as tendinites, correspondam de 30 a 50% do total das lesões esportivas (ALMEKINDERS, TEMPLE, 1998; WOO et al., 2000). Entretanto, até hoje, os métodos tradicionalmente empregados para a análise de processos inflamatórios teciduais (observação microscópica, p. ex.) têm fornecido somente uma visão qualitativa destes processos, não sendo possível quantificar as alterações ultra-estruturais e moleculares dos tecidos sob análise, dificultando o conhecimento detalhado destes processos. Assim sendo, o desenvolvimento de novos métodos de análise que permitam a identificação e a quantificação destas alterações, principalmente àquelas que se referem ao colágeno, é extremamente desejável e importante. Saindo-se da dimensão tecidual clássica (macro e microscopia) e direcionando para a dimensão molecular, a espectroscopia Raman possibilita quantificar a inflamação e a fibroplasia das lesões tendíneas, visto que os espectros Raman são fingerprints da estrutura das moléculas que compõem os tecidos avaliados. Este fato é de grande relevância, pois se abre a possibilidade de comparar a eficiência de diferentes métodos de análise de tecidos em diferentes

14 escalas, partindo-se da microscopia óptica para o nível molecular. É possível assim comparar as alterações químicas ocorridas, obviamente, no nível molecular, com as alterações morfológicas microscópicas observadas no desenvolvimento da tendinite, resultando no conhecimento mais detalhado deste processo. A perspectiva de utilização da espectroscopia Raman (SALA, 1995) de baixa resolução (MELLO, 1997; CLARKE et al., 1998; CLARKE et al., 1999; WOMBLE et al., 1999) para a quantificação do processo inflamatório tendíneo e alteração na estrutura colágena é extremamente atraente dada à possibilidade se obter um fingerprint, ou seja, uma impressão digital das transformações teciduais, podendo-se detectar além das alterações ultra-estruturais, alterações moleculares. Acrescenta-se a isso os baixos limites de detecção possíveis de serem alcançados e, principalmente, a diferenciação química a ser obtida. Contudo, a sobreposição de bandas espectrais (FURUSJO et al., 1998; BIJLSMA, SMILDE, 1999) e os efeitos de fluorescência da matriz (HIRSCHFELD, CHASE, 1986; SCHRADER et al., 1999; HANLON et al., 2000; MAQUELIN et al., 2000), conferem ao sistema características não lineares que podem dificultar a quantificação do processo inflamatório em questão. Uma alternativa bastante viável para a quantificação da tendinite, utilizando espectroscopia Raman, é a aplicação de métodos não lineares de classificação/calibração multivariada (SEKULIC et al., 1993; ZUPAN et al., 1994; CHAN et al., 1997; CLADERA et al., 1997). Dentre os métodos não lineares de classificação/calibração multivariada, destacam-se os métodos quimiométricos de reconhecimento de padrões, como, por exemplo, Hierarchical Cluster Analysis (HCA), que permite desenvolver sistemas automatizados para o reconhecimento de padrões diagnósticos (MELLO et al., 1999).

15 REVISÃO DE LITERATURA 1 ESTRUTURA TENDÍNEA 1.1 TECIDO CONJUNTIVO DENSO O tecido conjuntivo denso fornece a matriz de suporte para praticamente todos os órgãos (WEISS; GREEP, 1981). Ele é composto por células (fibroblastos, macrófagos e mastócitos); fibras (colágeno e elastina) e substância de sustentação (glicosaminoglicanas, proteoglicanas e glicoproteínas) (KOEKE, 2003). Muitas vezes as fibras predominantes são responsáveis por certas propriedades do tecido (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). O comportamento mecânico como resistência à compressão, tensão, extensibilidade e torção são influenciados pelas propriedades físicas do colágeno e outras fibras; organização da arquitetura das fibras; tipo de fibras de colágeno; proporção de colágeno e outras fibras; maturidade de fibras de colágeno; orientação das fibrilas; diâmetro e comprimento dessas fibrilas e quantidade, tipo, arranjo e hidratação das substâncias de sustentação (BIRK et al., 1997; CULAW; CLARK; MERRILEES, 1999; KOEKE, 2003). A substância de sustentação, também chamada matriz extracelular do

16 tecido conjuntivo, é um gel incolor, muito hidratado e transparente que preenche o espaço entre as células e as fibras do conjuntivo, constituindo um veículo para a passagem de células, moléculas hidrossolúveis e íons diversos, e uma barreira à penetração de microrganismos. Por sua hidratação, as moléculas de proteoglicanas ocupam enorme espaço, tornando-se muito eficientes para resistir a forças de compressão, enquanto as fibras colágenas são muito resistentes a forças de distensão (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). 1.2 COLÁGENO O colágeno é a proteína mais abundante no corpo humano, representando 30% do total das proteínas do organismo (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). Ele compõe a matriz extracelular dos animais multicelulares, com cerca de 19 tipos distintos de colágeno, todos com características individuais que determinam as funções específicas dos diferentes tecidos (CULAW et al., 1999). Assim como outros tecidos conectivos fibrosos, os tendões são compostos primariamente por colágeno tipo I, com quantidades menores dos tipos III, IV, V e VI (HYMAN; RODEO, 2000). O colágeno provê ao tendão resistência tênsil, enquanto a matriz extracelular fornece suporte estrutural para as fibras colágenas e regula a transformação extracelular de procolágeno em colágeno maduro (KHAN et al., 1999). A unidade protéica que se polimeriza para formar fibrilas colágenas é uma molécula alongada denominada tropocolágeno, que mede 280 nm de

17 comprimento por 1,5 nm de espessura. A molécula de tropocolágeno consiste em três cadeias polipeptídicas dispostas em hélice. As diferenças na estrutura química dessas cadeias são responsáveis pelos vários tipos de colágeno (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). Essa estrutura molecular relativamente simples é insolúvel em água, uma propriedade que lhe é conferida pela grande concentração de aminoácidos hidrofóbicos, quer no interior da proteína, quer na sua superfície (LEHNINGER; NELSON; COX, 1995). Nos colágenos dos tipos I, II e III, as moléculas de tropocolágeno se agregam em unidades miofibrilares que se juntam para formar fibrilas. Pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas são importantes para a união dessas unidades que, posteriormente, são reforçadas por ligações covalentes, catalisadas pela atividade da enzima extracelular lisil-oxidase, que oxida moléculas do aminoácido lisina, estabelecendo pontes entre elas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). O colágeno tem a seguinte composição: 35% em glicina, 11% em alanina, 21% em prolina e hidroxiprolina. O conteúdo incomum em aminoácidos do colágeno é devido às restrições estruturais únicas da hélice do mesmo. A seqüência de aminoácidos no colágeno é, em geral, uma unidade tripeptídica, glicina-x-prolina ou glicina-x-hidroxiprolina, onde X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos padrão (LEHNINGER; NELSON; COX, 1995). Sua resistência mecânica é aumentada pelo enrolamento helicoidal de múltiplos segmentos em uma super-hélice. O percurso helicoidal da superestrutura é, em sentido oposto ao enrolamento das hélices polipeptídicas individuais, uma conformação que permite o enrolamento mais apertado possível das múltiplas cadeias polipeptídicas. O enrolamento, em super-hélice é provavelmente orientado à direita. O enrolamento apertado da hélice tríplice do colágeno fornece uma grande

18 resistência a forças de tensão, sem nenhuma capacidade para o estiramento. As fibras do colágeno podem suportar até dez mil vezes o seu próprio peso e são ditas possuir resistência à tensão maior que a de um fio de aço de igual área de secção (LEHNINGER; NELSON; COX, 1995). A resistência dessa estrutura é também aumentada por ligações covalentes entre as cadeias polipeptídicas no interior das cordas multi-helicoidais e entre aquelas que estão adjacentes (LEHNINGER; NELSON; COX, 1995) (Figuras 1 e 2). Figura 1 Em A temos um modelo da alfa-hélice da molécula de colágeno ilustrando os átomos de carbono (C), incluindo o Galfa. Em B temos um modelo da alfa-hélice da molécula de colágeno com inclusão dos outros átomos que compõem a estrutura principal. Em C está representada a molécula de colágeno, evidenciando a conformação de tríplice hélice incluindo os radicais que formam as cadeias laterais. Notar as ligações intermoleculares por meio de pontes de hidrogênio (H). Fonte: Modelo modificado de OKUYAMA et al., 1981 apud KOEKE, 2003, p. 20.

19 Figura 2 Em A temos a representação esquemática da tríplice hélice da molécula de colágeno e seu auto-enrolamento organizado. A conformação estrutural é resultado das forças intra e intermoleculares. A figura B representa um corte transversal do esquema A localizando as ligações intramoleculares realizadas por intermédio das pontes de hidrogênio. Fonte: Modelo modificado de OKUYAMA et al., 1981 apud KOEKE, 2003, p. 21. Os fibroblastos são os principais responsáveis pela síntese de colágeno tipo I. Contudo, outras células como os mastócitos, os macrófagos e algumas células indiferenciadas originadas do tendão, epitendão e paratendão podem sintetizá-lo (CHAN et al., 1997; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). A renovação do colágeno é, em geral, muito lenta, e em muitos órgãos, como tendões e ligamentos, ela é praticamente estável. A degradação, para renovação, é iniciada por enzimas específicas, as colagenases. Essas enzimas quebram as moléculas em dois pedaços que são suscetíveis ao ataque de proteases não específicas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). A forma dos fibroblastos é normalmente estrelada com poucas projeções citoplasmáticas correndo entre os feixes de colágeno adjacentes (KOEKE, 2003). É o conjunto de eventos, intracelulares e extracelulares, que determina o controle da biossíntese do colágeno. Além de colágeno, o fibroblasto produz outros componentes da matriz extracelular (KOEKE, 2003). Próximo à superfície dos fibroblastos, dentro do espaço extracelular, as moléculas de colágeno são secretadas. Para cada conjunto de cinco moléculas de

20 colágeno há uma compactação para a formação da menor unidade de organização da fibra de colágeno: a microfibrila. A próxima unidade da organização é a subfibrila, que agrupadas constituirão as fibrilas. Esta hierarquia reflete a alta organização da estrutura molecular do colágeno (KOEKE, 2003). 1.3 TENDÕES Os tendões são estruturas anatômicas densas, bem organizadas e fibrosas, interpostas entre músculos e ossos, que transmitem a força gerada dentro do músculo ao osso, tornando possível o movimento articular (KAINBERGER et al., 1997; KHAN et al., 1999; KOOB; SUMMERS, 2002; RITTY; HERZOG, 2003). Comparados à maioria de outros sistemas orgânicos, os tendões têm baixa celularidade e a força é transmitida através de uma cadeia densa de fibras de colágeno tipo I, fortemente alinhadas através do eixo da força, somadas com várias proteoglicanas e outras proteínas não colagenosas (RITTY; HERZOG, 2003). Os tendões normais têm uma superfície branca brilhante, geralmente coberta por uma fina camada de tecido conectivo. Histologicamente, eles consistem em fibras colágenas onduladas com fileiras dispersas de fibroblastos com núcleo alongado. A substância extracelular é esparsa, com fibras longitudinais frouxamente arranjadas e escassos vasos sanguíneos (LEE et al., 1997). As fibras são unidas em feixes em uma rede tridimensional por um septo do endotélio chamado peritendão. Eles se originam de uma fina bainha de tecido conectivo, chamado epitendão, que envolve o tendão inteiro. Em tendões maiores, vasos sanguíneos, linfáticos e terminações nervosas passam dentro deste

21 septo, enquanto que tendões pequenos são quase avasculares (KAINBERGER et al., 1997). O tendão é inteiramente coberto pelo epitendão, uma bainha fina, frouxa, de tecido conectivo contendo o suprimento vascular, linfático e nervoso. O epitendão se estende profundamente dentro do tendão entre o feixe terciário como o endotendão. Mais superficialmente, o epitendão é envolvido pelo paratendão, tecido conectivo frouxo, formado essencialmente por fibrilas de colágeno tipo I e tipo III, algumas fibrilas elásticas e um revestimento interno de células sinoviais. Juntos, o paratendão e o epitendão são, às vezes, chamados de peritendão (KHAN et al., 1999). Bainhas tendíneas também cobrem completa ou parcialmente as porções do tendão que atravessam uma fáscia ou túnel ósteo-fibroso. Elas promovem o deslizamento e contribuem para a nutrição do tecido tendíneo. Considerando que o próprio tendão é pobremente provido de sangue e linfa, a bainha tendínea, ou paratendão, exerce um papel ativo no remodelamento do tecido (KAINBERGER et al., 1997). As fibras colágenas dos tendões são orientadas de modo a oferecer o máximo de resistência às forças que normalmente atuam sobre o tecido (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). Por isso, essas fibras de colágeno são orientadas longitudinalmente, transversalmente e horizontalmente com fibrilas de colágeno longitudinais formando cordões espirais. Esta complexa estrutura proporciona ao tendão uma capacidade de equilibrar forças longitudinais, transversais, horizontais e rotacionais durante os movimentos e atividades (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000; KOEKE, 2003). Porém, grande parte das fibras é orientada em paralelo ao eixo longitudinal do tendão, o que permite resistir e transmitir eficientemente às forças

22 unidirecionais geradas dos músculos para os ossos (CULAW; CLARK; MERRILEES, 1999). Os tendões assumem a forma de cordões fibrosos rígidos, embora flexíveis e complacentes, consistindo de tecido fibroso denso altamente orientado. O elevado grau de organização e densidade da matriz reflete uma elevada concentração de colágeno (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000). As junções musculotendinosas devem transmitir eficientemente a força da contração muscular ao tendão. A inserção do músculo ao tendão ocorre por meio da continuidade das fibrilas de colágeno das camadas de tecido fibroso do músculo (epimísio, perimísio, e endomísio) nas fibrilas de colágeno do tendão, e por meio de uma elaborada interdigitação da membrana da célula muscular com as fibrilas de colágeno do tendão (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000). Moléstias ou lesões que afetam os tendões podem desestabilizar articulações, ou levar à perda da função muscular. Contraturas com encurtamento desses tecidos limitam os movimentos musculares e articulares, e contribuem para a instalação de deformidade esquelética (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000). 1.4 TENDINITE Lesões tendinosas são comumente vistas na prática esportiva e vêm aumentando sua incidência (LEE et al., 1997; CHAN et al., 1997; SALATE, 2002; DAHLGREN et al., 2002; TSUZAKI et al., 2003). Estimativas do Bureau of Labor Statistics (USA) indicam que lesões tais como tendinites somam 48% das doenças ocupacionais relatadas. Os números na medicina esportiva são similarmente

23 impressionantes. Estima-se que lesões tendíneas por sobrecarga correspondam de 30 a 50% do total das lesões esportivas (ALMEKINDERS; TEMPLE, 1998; WOO et al., 2000). Tendinopatia é um termo genérico usado para descrever todas as doenças que se originam nos tendões e ao redor deles (KHAN et al., 1999). As diferentes maneiras com que o organismo reage frente à agressão tenossinovial são: tendinites, paratendinites, tenossinovites, apofisites ou uma combinação de todas elas (SALATE, 2002). Tendinite é uma condição na qual o tendão agredido exibe uma resposta inflamatória (KHAN et al., 1999; HYMAN; RODEO, 2000). Deve-se levar em conta, porém, que em todos os casos de lesões tendíneas a inflamação é a parte inicial do processo de reparação tecidual (SALATE, 2002). Sua patofisiologia ainda não é completamente compreendida, mas os esforços físicos excessivos e repetitivos provocam micro-traumas nos tecidos, levando, assim, à rupturas tendíneas espontâneas, principalmente nas atividades esportivas; sobrecarga mecânica; hipertermia local; isquemia ou hipoxemia são fatores apontados como as causas mais comuns das lesões tendíneas (ALMEKINDERS; TEMPLE, 1998; WOO et al., 2000; SALATE, 2002; DAHLGREN et al., 2002; MCLAUCHLAN; HANDOLL, 2003). Essas lesões são também chamadas de síndromes por sobrecarga, resultando na inabilidade do tendão em suportar qualquer tensão adicional, ponto onde os elastômeros biológicos apresentam ruptura (no nível molecular), as ligações colágenas começam a se quebrar ou uma situação bioquímica local (por exemplo, acúmulo de radicais ácidos) é criada impossibilitando a continuidade do processo funcional (ALMEKINDERS; TEMPLE, 1998; SALATE, 2002; MCLAUCHLAN; HANDOLL, 2003).

24 Se a lesão causada pelo movimento repetitivo continua até exceder a capacidade de reparação do tendão, uma lesão tendínea sintomática ou tendinite irá se desenvolver. Dessa forma, a estrutura do tendão pode romper-se, resultando em inflamação (ALMEKINDERS; TEMPLE, 1998; SALATE, 2002; MCLAUCHLAN; HANDOLL, 2003). Algumas pesquisas forneceram evidências de que sobrecarga, compressão, degeneração intrínseca, irritação química e tenotomia parcial ou completa, induzem um dano estrutural e inflamação no tendão, que são histopatologicamente semelhantes àqueles observados no músculo esquelético após uma lesão (WOO et al., 2000; MARSOLAIS et al., 2001). O reparo de um tendão lesado é similar ao reparo de outras lesões de tecidos conectivos, onde, num processo ordenado de estágios múltiplos, ocorre a proliferação e a migração de muitos tipos celulares (CHAN et al., 1997; LEE et al., 1997). Porém esta seqüência de aparecimento das células inflamatórias após uma agressão ainda é um processo pouco estudado nos tendões traumatizados, tendo sido pesquisado por apenas alguns autores (MARSOLAIS et al., 2001). O acúmulo de células inflamatórias baseia-se no recrutamento de novas células provenientes do sistema circulatório ou na mitose das células inflamatórias residentes. O recrutamento de novas populações de células inflamatórias através de substâncias quimiotáticas parece ser o mecanismo primário pelo qual as células se acumulam no tecido danificado (MARSOLAIS et al., 2001). Os neutrófilos são normalmente as primeiras células a aparecer nos locais de infecção ou inflamação, onde liberam uma variedade de agentes destrutivos, tais como radicais livres e proteases, e citocinas que atraem macrófagos (MARSOLAIS et al., 2001). A concentração de neutrófilos normalmente declina 24h após a lesão e neutrófilos apoptóticos são fagocitados pelos macrófagos ou

25 fibroblastos (HALL et al., 1994). As populações de macrófagos se tornam as células predominantes até o final do processo inflamatório. Macrófagos ativos podem liberar o fator de crescimento (TGFβ 1 ) que induz a síntese de matriz extracelular e inibe sua degradação e estimula fibroblastos ou células-tronco a proliferar. Colágeno e proteoglicanas são secretados e quaisquer rupturas no tecido são eventualmente reparadas por fibras de colágeno, principalmente do tipo III (CHAN et al., 1997; LEE et al., 1997; MARSOLAIS et al., 2001; HEINEMEIER et al., 2003). Outros componentes da matriz extracelular são sintetizados e depositados no sítio da lesão. Ao mesmo tempo, inicia-se a angiogênese para restabelecer o suprimento vascular. Finalmente, as células tendíneas e as fibras colágenas são orientadas de uma maneira altamente organizada numa tentativa de restaurar, tão próximo quanto possível, a estrutura e a função original do tendão lesado (CHAN et al., 1997; LEE et al., 1997). A resistência e firmeza de um tendão são fornecidas pelas ligações cruzadas que ocorrem entre as numerosas fibras de colágeno. Em decorrência do desarranjo destas fibras pela hemorragia e pelo infiltrado de células inflamatórias a resistência de um tendão tende a diminuir (KUO et al., 1999). Durante esse processo de recuperação, as fibras colágenas destruídas são reparadas para reaver a força e rigidez, enquanto o tecido de granulação gradualmente se condensa em tecido cicatricial e diminui sua celularidade (KUO et al., 1999).

26 1. 5 MODELO EXPERIMENTAL DE TENDINITE BIOQUÍMICA Vários modelos experimentais utilizando animais foram desenvolvidos para tentar entender melhor o processo biológico que conduz a tendinite (WOO et al., 2000), como isquemia provocada no tendão (KUO et al., 1999) ou aplicação de substâncias inflamatórias clássicas (KURTZ et al., 1999). Entretanto, conforme descrito na literatura, a colagenase produzida por fibroblastos e células inflamatórias, é uma enzima altamente específica capaz de induzir a degradação da conformação em tripla hélice do colágeno (KOMSA-PENKOVA; RASHAP; YOMTOVA, 1997; MARSOLAIS et al., 2001; FERNANDES; ALVES; SOUZA, 2003). O modelo de tendinite induzida por colagenase é bem descrito bioquímica, ultrasonográfica e histologicamente, e tem sido usado extensivamente em estudos terapêuticos (DAHLGREN et al., 2002). O edema agudo, a inflamação e a destruição da matriz nos tendões são similares àquelas encontradas nas lesões tendíneas naturalmente ocorridas (WANG et al., 2003). A avaliação do processo inflamatório intratendíneo experimental geralmente é feita através de estudo histopatológico utilizando colorações clássicas, especialmente a hematoxilina-eosina (MARSOLAIS et al., 2001; DAHLGREN et al., 2002; FERNANDES; ALVES; SOUZA, 2003). 1.6 DIAGNÓSTICO A utilização de meios modernos de diagnóstico por imagem possibilita

27 uma melhor identificação das doenças tendíneas, colaborando para o tratamento (SALATE, 2002). O papel da obtenção de imagens de alta resolução parece ser de importância crescente para analisar mecanismos adaptáveis e degenerativos. Alguns autores afirmam que a ultra-sonografia e a ressonância magnética deveriam ser usadas conjuntamente a fim de melhor diagnosticar doenças tendíneas (KAINBERGER et al., 1997). A ultra-sonografia tem sido crescentemente utilizada para examinar lesões tendíneas, pois é um método disponível, rápido, seguro e barato. Sua principal desvantagem é ser um pouco limitada, principalmente em comparação com a ressonância magnética (PAAVOLA et al., 2002). Além disso, existem as dificuldades de documentação das imagens de uma forma padrão, e conseqüentemente, a impossibilidade de diagnósticos exatamente reproduzíveis (KAINBERGER et al., 1997). A ressonância magnética proporciona um alto contraste do tecido, o que permite distinguir entre tendões normais de tendões anormais, além de permitir identificar estruturas anatômicas de forma detalhada (PAAVOLA et al., 2002). Porém, apesar das melhorias técnicas consideráveis, como técnicas de obtenção de imagens rápidas e máquinas de pequeno tamanho, a ressonância magnética permanece como a modalidade mais cara para a obtenção de imagens de estruturas de tecidos moles (KAINBERGER et al., 1997). O exame radiográfico raramente é de valor no estabelecimento de um diagnóstico de tendinite. Ele deveria ser usado como modalidade auxiliar para descobrir espículas ósseas ou outros tipos de calcificação anormal, ou quantificar fatores causais, como o mau alinhamento anatômico. Anormalidades estruturais dentro de um tendão geralmente não são radiograficamente visíveis a menos que

28 calcificações aconteçam (KAINBERGER et al., 1997). Deve-se ressaltar que, caso não sejam levadas em consideração as propriedades biológicas e mecânicas dos tecidos, as alterações teciduais causadas por moléstia ou lesão, ou as respostas dos tecidos a alterações persistentes por uso, podem ocorrer interpretações equivocadas das informações diagnósticas, decisões terapêuticas inadequadas e resultados indesejáveis no tratamento. Além disso, os futuros avanços no diagnóstico e tratamento dos problemas musculoesqueléticos dependerão de um conhecimento cada vez maior da célula e da matriz biológica dos tecidos musculoesqueléticos (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000). A perspectiva de utilização da espectroscopia Raman (SALA, 1995) de baixa resolução (MELLO, 1997; CLARKE; LHONDE; WOMBLE, 1998; CLARKE et al., 1999; WOMBLE et al., 1999) para a quantificação do processo inflamatório tendíneo e alteração na estrutura colágena é extremamente atraente dada à possibilidade se obter um fingerprint, ou seja, uma impressão digital das transformações teciduais, podendo-se detectar além das alterações ultra-estruturais, alterações moleculares. Acrescenta-se a isso os baixos limites de detecção possíveis de serem alcançados e, principalmente, a diferenciação química a ser obtida. Contudo, a sobreposição de bandas espectrais (FURUSJO et al., 1998; BIJLSMA; SMILDE, 1999) e os efeitos de fluorescência da matriz (HIRSCHFELD; CHASE, 1986; SCHRADER et al., 1999; HANLON et al., 2000; MAQUELIN et al., 2000), conferem ao sistema características não lineares que podem dificultar a quantificação do processo inflamatório em questão. Uma alternativa bastante viável para a quantificação da tendinite, utilizando espectroscopia Raman, é a aplicação de métodos não lineares de classificação/calibração multivariada (SEKULIC et al., 1993; ZUPAN; NOOVI; GASTEIGER, 1994; CHAN et al., 1997; CLADERA et al., 1997). Dentre os métodos

29 não lineares de classificação/calibração multivariada, destacam-se os métodos quimiométricos de reconhecimento de padrões, como, por exemplo, Hierarchical Cluster Analysis (HCA), que permite desenvolver sistemas automatizados para o reconhecimento de padrões diagnósticos (MELLO et al., 1999). 2 ESPECTROSCOPIA RAMAN A espectroscopia estuda a interação da radiação eletromagnética com a matéria, sendo um dos seus principais objetivos a determinação dos níveis de energia de átomos ou moléculas. Diretamente obtêm-se as diferenças entre estes e a partir destas medidas determinam-se as posições relativas dos níveis energéticos (SALA, 1995). A energia total de uma molécula é a soma da energia eletrônica, da energia vibracional e da energia rotacional, sendo a eletrônica muito maior que a vibracional e esta muito maior do que a rotacional: E tot = E ele +E vib +E rot (SALA, 1995). Sendo o movimento dos elétrons muito mais rápido do que o dos núcleos pode-se considerar a posição dos núcleos fixada durante a transição eletrônica. Do mesmo modo, durante o movimento dos núcleos, pode-se considerar uma distribuição média dos elétrons. A interação de radiação eletromagnética com o movimento vibracional dos núcleos origina os espectros vibracionais no infravermelho ou o Raman (SALA, 1995; LORINCZ et al., 2004). Pode-se definir o espalhamento Raman como o espalhamento inelástico de radiação eletromagnética monocromática que interage com as moléculas. As freqüências vibracionais são determinadas pelas diferenças entre as

30 freqüências das radiações espalhadas e a da radiação incidente (SALA, 1995; HANLON et al., 2000). O espectro Raman de uma determinada molécula consiste de uma série de picos ou faixas, cada um transferido por uma freqüência vibracional característica daquela molécula. Cada molécula tem o seu próprio espectro característico, e dessa forma, o espectro Raman pode fornecer uma impressão digital de uma substância da qual a composição molecular pode ser determinada (LORINCZ et al., 2004). No espalhamento Raman uma radiação, geralmente na faixa visível, ultravioleta, ou infravermelho, interage com a molécula e é espalhada com freqüência ligeiramente modificada. Esta variação de freqüência corresponde à diferença de energia entre dois estados vibracionais (SALA, 1995). Os espectros Raman são obtidos irradiando-se uma amostra com uma fonte laser potente de radiação monocromática no visível ou no infravermelho próximo. Durante a irradiação, o espectro da radiação espalhada é medido em um certo ângulo com um espectrômetro apropriado (SKOOG et al., 2002). A espectroscopia Raman tem sido amplamente aplicada no estudo de sistemas biológicos. As vantagens dessa técnica incluem a exigência de amostras pequenas, a sensibilidade mínima no tocante à interferência da água, o detalhamento espectral e a sensibilidade conformacional e ambiental (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). Entre várias técnicas, ela pode fornecer a mais detalhada informação sobre a composição química de uma amostra tecidual sob estudo, pois suas informações são ao nível molecular (LORINCZ et al., 2004; HANLON et al., 2000). As aplicações diagnósticas da espectroscopia Raman têm sido amplamente pesquisadas. Ela pode ser usada de maneira minimamente invasiva,

31 em tempo real, em diagnósticos teciduais in vivo, em casos onde biópsias não podem ser prontamente realizadas, tais como na doença arterial coronariana e doença de Alzheimer, ou quando existe uma alta incidência de resultados de exames falso-positivos, que levam a realizações de biópsias desnecessárias, como no câncer de mama (HANLON et al., 2000). Partindo-se da informação de que a maioria das doenças é induzida por processos bioquímicos, é certo afirmar que elas são necessariamente acompanhadas por mudanças na composição molecular dos tecidos (MIN et al., 2005). Como a espectroscopia Raman é altamente sensível a estas mudanças, alguns autores têm se dedicado a pesquisar a sua utilização para o diagnóstico precoce do câncer, e talvez, até mesmo para a elucidação dos mecanismos do desenvolvimento das doenças cancerígenas (LORINCZ et al., 2004; MIN et al., 2005). A aplicação in vivo da Espectroscopia Raman na prática clínica, depende do desenvolvimento de um equipamento sensível e uma poderosa análise do espectro para capacitar a coleta de sinais em tempo real e a descoberta de relevantes parâmetros clínicos destes espectros (SCHUT et al., 2000). Min et al. (2005) coletaram amostras de tecidos de pulmão normais e cancerígenos de 35 pacientes com câncer de pulmão e, pela análise por espectroscopia Raman, foi possível fazer uma distinção clara entre amostras de tecido fresco com câncer e normal (Figuras 3 e 4). Observou-se que na intensidade de 1659 cm 1 na banda amida I a vibração aumenta notavelmente indo do estado normal para o cancerígeno.

32 Figura 3 Espectros Raman no infravermelho próximo de tecido cancerígeno de pulmão humano fresco. (a) Estimulado a 785nm [tempo exposto, 1 minuto; potência do laser, 46mW; largura da fenda, 50 µm (5 cm -1 )]; (b) Estimulado a 1064nm [tempo exposto, 5 minutos; potência do laser, 38mW; largura da fenda, 150 µm (9 cm -1 )]. Fonte: MIN, 2005. Figura 4 - Padrão dos espectros Raman no infravermelho próximo obtidos de tecidos de pulmões humanos cancerígenos e normais. Fonte: MIN, 2005. Hanlon et al. (2000) estudaram a aplicação da espectroscopia Raman na aterosclerose utilizando amostras de artérias coronárias obtidas de corações humanos. Os resultados indicaram que existem diferenças espectrais significativas entre a maioria dos aspectos morfológicos encontrados em artérias coronárias

33 normais e placas ateroscleróticas (Figura 5). Figura 5 - Exemplos de bandas Raman de tecidos de artérias coronárias, excitados a 830nm, em vários estágios de aterosclerose. Notar o proeminente estiramento fosfato de hidroxiapatita de cálcio a 960 cm -1, presente somente no espectro da placa calcificada. Fonte: BRENAN et al. apud HANLON, 2000. Frank et al. (1995) utilizaram um comprimento de onda 784 nm para obter espectros Raman de tecido mamário normal, benigno (fibrocístico) e maligno (carcinoma). A análise dos espectros indicou uma mudança na banda 1439 cm -1 no tecido normal para 1450 cm -1 no tecido maligno, mudança esta atribuída ao aumento da concentração de proteínas nas amostras malignas. Usando uma área proporcional de bandas de 1654 1439 cm -1, foi possível diferenciar facilmente

34 tecido maligno e tecido normal. Entretanto, não houveram diferenças estatisticamente significativas nas mudanças observadas entre tecidos maligno e benigno. Baseado no estudo de Frank, McCreery e Reed (1995), Manoharan et al. (1998) utilizaram um comprimento de onda de 830 nm para analisar amostras de tecido mamário normal, benigno e maligno, obtidas por biópsias e mastectomia. Os aspectos espectrais foram insuficientes para separar todas as três categorias. Foi possível diferenciar amostras de tecido normal e maligno com alta sensibilidade e especificidade (Figura 6), porém as amostras benignas não foram bem separadas das malignas. Figura 6 - Espectro Raman de tecido mamário (a) normal, (b) benigno e (c) maligno. Fonte: MANOHARAN, 1998. Pesquisado por vários autores (TASHIBU, 1990; MIZUNO et al., 1992; KITAJIMA et al., 1993 e ONG et al., 1997 apud WOLTHUIS et al., 2001), a análise espectroscópica de tecido cerebral tem avançado significativamente. Wolthuis et al. (2001) investigaram a possibilidade de se utilizar a

35 espectroscopia Raman para mensurar a concentração de água no tecido cerebral, visando sua aplicação no controle de edema cerebral, um dos fatores mais comuns de morbidade em pacientes com doenças cerebrovasculres. Utilizando cérebros de porcos em seu estudo e um comprimento de onda de 720 nm, demonstraram que é possível determinar a fração de água no cérebro com uma acurácia melhor que 0,01, numa escala de 0,75-0,95, utilizando Espectroscopia Raman e modelamento com PLS (Partial Least Squares). As futuras aplicações diagnósticas da espectroscopia Raman dependem da habilidade dos pesquisadores em aprofundar e entender a origem dos aspectos espectrais. O modelamento, seja químico ou morfológico, é a chave para a descoberta das repostas (HANLON et al., 2000). Os métodos tradicionalmente empregados para a análise de processos inflamatórios teciduais (observação microscópica, p. ex.) fornecem somente uma visão qualitativa destes processos, não sendo possível quantificar as alterações ultra-estruturais e moleculares dos tecidos sob análise, dificultando o conhecimento detalhado destes processos. Assim sendo, o desenvolvimento de novos métodos de análise que permitam a identificação e a quantificação destas alterações, principalmente àquelas que se referem ao colágeno, é extremamente desejável e importante. Saindo-se da dimensão tecidual clássica (macro e microscopia) e direcionando para a dimensão molecular, a espectroscopia Raman possibilita quantificar a inflamação e a fibroplasia das lesões tendíneas, visto que os espectros Raman são fingerprints da estrutura das moléculas que compõem os tecidos avaliados. Este fato é de grande relevância, pois se abre a possibilidade de comparar a eficiência de diferentes métodos de análise de tecidos em diferentes escalas, partindo-se da microscopia óptica para o nível molecular. É possível assim

36 comparar as alterações químicas ocorridas, obviamente, no nível molecular, com as alterações morfológicas microscópicas observadas no desenvolvimento da tendinite, resultando no conhecimento mais detalhado deste processo.

37 OBJETIVO Comparar a espectroscopia Raman, como método de análise, com a histopatologia clássica do tecido tendíneo na tendinite experimentalmente induzida pela colagenase no tendão do músculo gastrocnêmio de Rattus norvegicus da variedade Wistar.

38 MATERIAL E MÉTODOS Todos os procedimentos experimentais foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Franca e aprovados, de acordo com o Protocolo n o 108/04 (Anexo A). 1 ANIMAIS Foram utilizados 48 ratos machos albinos (Rattus norvegicus) variedade Wistar, com peso aproximado de 180g (+ ou 40g), saudáveis, sem variação acentuada de idade, fornecidos pelo Biotério da Universidade de Franca. Durante todo o período de estudo os animais foram mantidos em caixas identificadas apropriadas de polietileno padrão no Biotério e alimentados com ração própria para roedores e água ad libitum. 2 TENDINITE EXPERIMENTAL Os animais foram pesados e divididos em seis grupos por aproximação

39 de peso, sendo o grupo I controle, e os grupos experimentais II, III, IV, V e VI, os quais eram constituídos de oito animais cada. Os animais dos grupos II, III, IV, V e VI receberam uma injeção intratendínea no tendão calcâneo direito, de 30 µl de colagenase (10 mg/ml; Sigma, C6885) usando-se uma agulha 30G (Figura 7). A colagenase foi dissolvida em solução salina tamponada estéril de fosfato, contendo 50 mm NaH 2 PO 4, 150 mm NaCl, com ph 7.4. O mesmo volume de solução salina tamponada estéril de fosfato foi injetado no tendão calcâneo esquerdo dos animais. Figura 7 Embalagem de Colagenase Sigma, C6885. Os animais do grupo I, controle, receberam injeção do mesmo volume de solução salina tamponada estéril de fosfato no tendão calcâneo esquerdo. O tendão calcâneo direito destes animais foi preservado. Os animais foram sacrificados 1 (grupo II), 3 (grupo III), 7 (grupo IV), 14 (grupo V) e 28 (grupo VI) dias após receberem as injeções. O grupo I foi sacrificado no nono dia, data esta escolhida aleatoriamente (adaptado de MARSOLAIS et al., 2001).

40 3 ESPECTROSCOPIA RAMAN No dia determinado para o sacrifício, os animais eram transferidos do Biotério para o Laboratório de Dissecação de Peças, onde eram sacrificados individualmente por superdosagem de Halotano em uma cabine plástica (Figuras 8 e 9) (adaptado de DAHLGREN et al., 2002). Em seguida, eram dissecados os tendões calcâneo direito e esquerdo (Figura 10), os quais eram imediatamente imersos em um recipiente com solução fisiológica e mantidos em caixa de isopor com gelo, em temperatura próxima a 18ºC, e transportados para o Laboratório de Espectroscopia Vibracional e Quimiometria da Universidade de Franca. Figuras 8 e 9 Cabine Plástica com algodão embebido em Halothano (8); Halothano (9).

41 Figura 10 Dissecação do tendão calcâneo comum esquerdo, Grupo II. O Laboratório de Espectroscopia foi mantido com temperatura próxima a 18ºC, cortinas fechadas, luzes apagadas, e não houve interferências externas que pudessem prejudicar a coleta dos Espectros Raman. Os espectros Raman foram obtidos usando a espectrômetro Raman de baixa resolução, da Raman Systems, Inc (Watertown, MA, USA), modelo R-2001, o qual utiliza um Laser multimodo de estado sólido, operando a 785 nm, fornecido por Power Technologies (Little Rock, AK, USA), ajustado para liberar na amostra 250 mw, e um espectrômetro OceanOptics S-200 (Dunnedin, FL, USA) como monocromador com um detector CCD com 2048 elementos termoeletricamente refrigerado fornecido pela Hamamatsu (Hamamatsu, Sunayama-cho, Japan) para mensurar espectros de 200 a 2800 cm -1, com uma resolução espectral da ordem de 15 cm -1 (Figura 11).

42 Figura 11 Espectrômetro Raman A fibra óptica contém dois tipos de filtro na sua ponta. A fibra que leva o feixe contém o filtro passa-banda para remover a fluorescência da fibra proveniente da excitação do feixe e a fibra de aquisição contém um filtro passalongo para remover o espalhamento Rayleigh. O ruído inerente no sistema originado dos elementos ópticos no caminho da luz foi subtraído de todos os espectros. Para cada amostra de tecido tendíneo foram adquiridos três espectros e o espectro final foi a média dos três espectros. A calibração do espectrômetro Raman foi feita usando isopropanol de grau espectroscópico Carlo-Erba. Estas amostras de isopropanol foram colocadas em cubetas de quartzo e seus espectros obtidos no espectrômetro Raman. A aquisição do sinal foi feita através de uma interface RS-232, controlada pelo software RBase 2001, versão 1, em um Pentium III operando a 750 Mhz. Esta calibração é necessária para que se possa fazer a correlação entre pixel e comprimento ou número de onda. Tal calibração deve ser feita diariamente ou quando se ajusta o Laser para operar em um comprimento de onda diferente. Escolhe-se o isopropanol por suas bandas características de fácil atribuição [Manual de Operação do Aparelho - Raman Systems, Inc (Watertown, MA, USA), modelo R-

43 2001]. O espectro foi processado usando filtros wavelets, com função de base Dubauchie (db4) para a minimização de ruído, subtração do espectro do meio isotônico, correção de espalhamento multiplicativo (MSC Multiplicative Scattering Correction) para minimizar o espalhamento Rayleigh devido a variação do índice de refração para cada uma das amostras de tecido tendíneo, e um polinômio de segundo grau para minimizar a fluorescência da matriz. Os cálculos da Análise Hierárquica de Agrupamentos (HCA Hierarchical Cluster Analysis) foram feitos utilizando-se o PLS (Partial Least Squares) Toolbox, para uso com Matlab 4.2. Os programas para minimização de ruído, MSC e minimização da fluorescência da matriz foram implementados pela utilização de sub rotinas do Matlab 4.2. Cada amostra de tendão era colocada em papel absorvente comum, e o Laser era posicionado bem próximo à amostra e fixado por uma garra. O tempo de aquisição de cada espectro foi de 20 segundos. A cada três amostras era realizada uma corrente escura. 4 HISTOPATOLOGIA Após a obtenção dos espectros Raman, os tendões eram individualmente colocados em recipientes com solução de Formol tamponado a 10%. O tempo decorrido entre a dissecação dos tendões e sua imersão em Formol foi de aproximadamente três horas, em todos os grupos, inclusive o grupo controle. Durante este período, as amostras foram mantidas a uma temperatura próxima de

44 18ºC em solução fisiológica em caixa de isopor com gelo, conforme descrito no item 3 Espectroscopia Raman. As amostras eram levadas ao Laboratório de Patologia da Universidade de Franca, onde foram preparadas para a realização da Análise Histopatológica. Após permanecerem por 24 horas na solução de Formol, os tendões foram desidratados por uma série crescente de álcool (soluções a 70%, 80%, 95%, 100%), diafanizados com xilol e embebidos em parafina. Posteriormente foram seccionados em micrótomo (marca Leica, modelo RM2125RT) numa espessura de três micrometros, colocados em lâminas para microscópio, corados com hematoxilina-eosina (H&E) e montados com lamínulas. Para a análise histopatológica das lâminas foi utilizado um microscópio (marca Leica, modelo DMBL) acoplado a uma câmera fotográfica (marca Leica, modelo MPS60). Um score de zero a três, sendo 0 = ausente, 1 = leve, 2 = médio e 3 = intenso, foi apontado para cada uma das seguintes categorias: necrose celular, infiltrado intratendíneo de polimorfonucleares, infiltrado intratendíneo de células mononucleares, infiltrado peritendíneo de polimorfonucleares, infiltrado peritendíneo de células mononucleares, atividade fibroblástica, neovascularização e produção e reorganização de fibras colágenas (adaptado de DAHLGREN et al., 2002).

45 RESULTADOS 1 RESULTADOS DA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA Os resultados agrupados da análise histopatológica estão demonstrados na Tabela 1. A Tabela 2 (Anexo B) apresenta os dados individuais por amostra.

46 Tabela 1 Scores da Análise Histopatológica (dados agrupados) GRUPO S NECROSE INF TENDÃO INF PERITENDÃO PMN MON PMN MON AF NV FC G I E - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 + n = 4 - n = 8 - n = 8 - n = 8 G I D - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 G II E + n = 2 + n = 3 + n = 2 + n = 4 G II D + n = 3 ++ n = 1 +++ n = 2 + n = 3 ++ n = 3 +++ n = 1 - n = 8 ++ = 4 +++ = 4 + n = 4 ++ n = 1 - n = 8 - n = 8 - n = 8 + n = 1 - n = 8 - n = 8 - n = 8 G III E - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 + n = 4 - n = 8 - n = 8 - n = 8 G III D ++ n = 3 + n = 2 + n = 1 ++ n = 2 +++ n = 1 + n = 5 ++ n = 1 + n = 3 ++ n = 3 +++ n = 2 - n = 8 - n = 8 - n = 8 G IV E - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 + n = 2 - n = 8 - n = 8 - n = 8 G IV D - n = 8 - n = 8 + n = 5 - n = 8 + n = 7 + n = 1 ++ n = 3 +++ n = 4 + n = 6 ++ n = 2 - n = 8 G V E - n = 8 - n = 8 + n = 1 - n = 8 - n = 8 + n = 1 + n = 1 - n = 8 G V D - n = 8 - n = 8 + n = 5 - n = 8 + n = 5 + n = 5 ++ n = 1 + n = 1 + n = 2 ++ n = 1 G VI E - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 G VI D - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 ++ n = 2 + n = 1 + n = 4 ++ n = 1 +++n = 1 LEGENDA: G: Grupo; E: Esquerdo; D: Direito; INF Tendão: Infiltrado de Células Inflamatórias Intratendíneas; INF Peritendão: Infiltrado de Células Inflamatórias Peritendíneas; PMN: Células Inflamatórias Polimorfonucleares; MON: Células Inflamatórias Mononucleares; AF: Atividade Fibroblástica; NV: Neovascularização; FC: Produção e Reorganização de Fibras Colágenas; n: Número de Amostras; - : Ausente; + : Leve; ++ : Moderado; +++ : Intenso Histologicamente, os tendões do Grupo Controle (I), lado direito, apresentaram fibras colágenas onduladas, com fileiras dispersas de fibrócitos com núcleo alongado, substância básica esparsa com fibras longitudinais frouxamente arranjadas e escassos vasos sanguíneos (Figura 12).

47 A B C D E F Figura 12 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo I (Controle). Notar aparência normal da fibras colágenas, fibroblastos e substância básica. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x). O Grupo II (um dia), lado direito, apresentou, macroscopicamente, grande extravasamento de sangue e edema. Microscopicamente, observou-se necrose, infiltrado intenso de células polimorfonucleares, principalmente neutrófilos, tanto intra quanto peritendíneo (Figura 13). As amostras do lado esquerdo, utilizadas como controle, apresentaram sinais moderados de inflamação, com infiltrado celular

48 principalmente peritendíneo (Figura 14). A B C D E Figura 13 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo II, lado D (1 dia após a injeção de colagenase). Notar presença de infiltrado inflamatório intenso. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x). F

49 A B C D E F Figura 14 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo II, lado E (1 dia após a injeção de solução fosfato). Notar presença de infiltrado inflamatório peritendíneo moderado. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x). O Grupo III (três dias), lado direito, não apresentou sinais macroscópicos tão exuberantes quanto o grupo II. Microscopicamente, ocorreu uma diminuição do extravasamento sanguíneo, sinais moderados de necrose e

50 predominância de células inflamatórias mononucleares, especialmente macrófagos (Figura 15). As amostras contralaterais apresentaram sinais discretos de inflamação mononuclear peritendínea (Figura 16). A B C D E F Figura 15 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo III, lado D (3 dias após a injeção de colagenase). Notar presença de células inflamatórias mononucleares. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).

51 A B FIGURA 16 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo III, lado E (3 dias após a injeção de solução fosfato). Notar presença de infiltrado inflamatório peritendíneo discreto. HE (A e B 100x). A análise do Grupo IV (sete dias), lado direito, revelou uma mudança acentuada das alterações microscópicas, com discretos focos de inflamação mononuclear, intra e peritendíneos, intensa atividade fibroblástica e sinais moderados de neovascularização (Figura 17). Seis amostras do lado esquerdo apresentaram aspecto normal (Figura 18) e duas amostras demonstraram a presença de neutrófilos peritendíneos.

52 A B C D E F Figura 17 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo IV, lado D (7 dias após a injeção de colagenase). Notar atividade fibroblástica e neovascularização. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).

53 A B Figura 18 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo IV, lado E (sete dias após a injeção de solução fosfato). Notar aspecto normal do tecido. HE (A 100x e B 400x). O Grupo V (14 dias), lado direito, apresentou uma diminuição da atividade fibroblástica, raros neutrófilos e o início da produção e reorganização de fibras colágenas (Figura 19). No lado esquerdo não havia mais sinal algum de lesão, com exceção de uma única amostra, que apresentou um foco degenerativo discreto (Figura 20).

54 A B C D E F Figura 19 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo V, lado D (14 dias após a injeção de colagenase). Notar produção de fibras colágenas. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).

55 A B C D E F Figura 20 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo V, lado E (14 dias após a injeção de solução fosfato). Notar ausência de indícios de lesão (A e B) e foco degenerativo discreto (C, D, E e F). HE (A 100x; B 400x; C 40x; D 100x; E e F 400x). No Grupo VI, lado direito, 28 dias após a injeção de colagenase, a microscopia revelou uma produção de fibras colágenas mais intensa, com sinais moderados de atividade fibroblástica em duas amostras, porém o tecido tinha uma aparência desorganizada (Figura 21). As amostras contralaterais apresentaram-se normais, sem qualquer sinal indicativo de lesão (Figura 22).

56 A B C D E F Figura 21 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo VI, lado D (28 dias após a injeção de colagenase). Notar tentativa de reorganização tecidual. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).

57 A B C D Figura 22 Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo VI, lado E (28 dias após a injeção de solução fosfato). Notar ausência de indícios de lesão. HE (A 40x; B e C 100x; D 400x). A Figura 23 apresenta um esquema de fotos das lâminas histológicas dos grupos I (controle), II, III, IV, V e VI (grupos de estudo), perna D, visando melhor ilustrar as alterações ocorridas durante a evolução do processo de tendinite.

58 A B C D E F Figura 23 Esquema de fotos das lâminas histológicas dos grupos I [(controle) A], II [B], III [C], IV [D], V [E] e VI [F], perna D. HE (100x).