PERFIL PLASMIDIAL DE COLIFORMES FECAIS EM BEBEDOUROS DE ESCOLAS PÚBLICAS.

PERFIL PLASMIDIAL DE COLIFORMES FECAIS EM BEBEDOUROS DE ESCOLAS PÚBLICAS. Denize Gomes de Freitas ² ( UEG UnU Morrinhos GO) Lilian Carla Carneiro lc-carneiro@hotmail.com Introdução A OMS (Organização Mundial da Saúde) dispõe que várias doenças que ocorrem em países podem ser vinculadas por microrganismos patogênicos encontrados na água contaminada (COELHO, D. A. et. al, 2007).A água como é uma fonte de vida pode colocar em risco a saúde pública, pela possibilidade de estar contaminada com coliformes (GELDREICH, 1974). A atividade humana faz gerar contaminações na água e esses coliformes que podem ser encontrados são de grandes discussões devido à possibilidade de serem indicadores de patógenos entéricos (OLIVEIRA e TERRA, 2004) As bactérias coliformes são de fácil cultivo e geralmente podem ser bons indicadores de poluição fecal, sendo este grupo de bactérias representando principalmente pela Escherichia coli, Salmonella sp e Klebsiella sp.. Porém, nem todos os coliformes são de origem fecal, pois contem no solo e também de vegetais (NASCIMENTO e FURLANETTO, 1981).A Escherichia coli é responsável por grandes surtos de toxinfecção alimentar devido a insatisfatória higiene-sanitária, como na falha de higienização das mãos, sendo assim um indicador de contaminação fecal, pois estará contaminando o alimento a ser ingerido (OLIVEIRA et al., 2003 ). A Salmonella ocorre normalmente em animais podendo estar presente nos seres humanos e ser patogênica para humanos (CORTEZ, L. A.L. et al, 2004). A salmonelose vem sendo uma das principais doenças causadas pelo gênero Salmonella sp. podendo ser transmitido por alimentos (CASTAGMA, S.M.F. et al., 2004).O gênero Klebsiella faz parte da família Enterobacteriaceae, são isoladas de materiais biológicos humanos e é uma bactéria com grande relevância pois apresenta infecção hospitalar na condição de oportunista e infecções em pacientes imunocomprometidos.(martinez, M. B. & TRABULSI, L. R., 2008)As bactérias que conferem algum tipo de resistência a antibióticos podem estar ligadas aos plasmídeos celulares. A presença de plasmídeo em apenas alguns tipos de Salmonella sp levanta uma questão sobre a função biológica dos mesmos (RYCHLIK, et al., 2005). Plasmídeo é um material genético extracromossomal com capacidade de replicar independentemente por ter origem de replicação (Oric) independente do DNA cromossomal. O Plasmideo é formado por uma molécula de DNA fita dupla circular podendo variar de 1 a 200 kb (ZAHA, 1996). Sabendo que as bactérias possuem mecanismos de defesa para resistir as pressões seletivas, este trabalho tem o objetivo de avaliar a presença de plasmídeo nas bactérias que foram isoladas das amostras de água e da superfície do bebedouro de escolas públicas, verificar resistência bacteriana aos antibióticos ampicilina, tetraciclina e ciprofloxacino, analisar a estabilidade plasmidial e observar a conjugação bacteriana. Materiais e Métodos Local de Coleta e cultivo dos microorganismos. As amostras de bactérias utilizadas nesse trabalho foram isoladas da água e da superfície de bebedouros de escolas públicas da cidade de Morrinhos - GO. Foram coletadas 1

amostra de água com alíquota de 10 ml em cada escola visitada. As amostras foram cultivadas em ágar nutriente, e para as superfícies dos bebedouros foram coletadas amostras através de swabs que posteriormente foram imersos em ágar nutriente. As amostras coletadas foram deixadas na estufa de cultura por 24 horas para o crescimento bacteriano, após este período foram mantidas á temperatura de 4ºC, sendo repicados mensalmente. Identificação bacteriana Foram isoladas amostras bacterianas de 51 bebedouros. As bactérias foram identificadas através de testes bioquímicos: glicose, lactose e citrato de simons, como também os meios EC (Escherichia Coli) e ágar SS (Salmonella sp. e Shigella sp.) para a identificação das bactérias E. Coli, Salmonella sp. e Klebsiella sp. definidas como coliformes fecais, tais amostras foram conduzidas para a análise da presença de plasmídeos. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos O antibiograma foi realizado através da metodologia por disco de difusão de Bauer & Kirby, segundo os critérios estabelecidos pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003). A inoculação foi distribuída através de varredura utilizando swab na superfície do ágar Müeller-Hinton, em seguida foram colocados os discos de antibióticos (ampicilina 10µg, tetraciclina 30µg e ciprofloxacina 5µg) no ágar, com o auxílio de uma pinça estéril. Após a aposição dos discos, as placas foram invertidas e incubadas a 36ºC por 18 a 24 horas, posteriormente as placas foram analisadas através dos halos de inibição. Extração de DNA plasmidial Baseado no manual do kit de extração FLEXIPREP da Pharmacia, as amostras bacterianas foram inoculadas em 5mL de meio L (meio Luria) e incubadas à 37ºC overnight sob agitação de 150 rpm. Uma alíquota de 1,5mL foi centrifugada a 5.000xg em tubos tipo Eppendorf por 30 segundos, o processo foi repetido três vezes.os sedimentos foram ressuspensos em 200 µl de solução I, homogenizado e adicionados 200 µl de solução II. O material foi misturado por inversão do tubo durante 5 minutos e adicionados 200 µl de solução III, homogenizando suavemente por inversão durante 5 minutos e centrifugado a 5.000 xg por 5 minutos (segundo instruções do fabricante). O sedimento, correspondente ao DNA cromossomal foi descartado e o sobrenadante, contendo o DNA plasmidial foi transferido para outro tubo. O DNA foi precipitado pela adição de 420 µl de isopropanol e após homogenizado no vortex e colocado em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida foi centrifugado por 10 minutos a 5.000 xg, sendo o sobrenadante desprezado e o precipitado deixado secar à temperatura ambiente. O precipitado foi ressuspenso em 50 µl de água destilada estéril, visualizado em gel de agarose 1% (p/v) corado com brometo de etídio e analisado por eletroforese. Eletroforese em gel de agarose De acordo com Sambrook et al., (1989) as amostras de DNA plasmidial foram analisadas em gel de agarose. O DNA plasmidial foi avaliado em gel de agarose 1% (p/v) corado com brometo de etídeo, dissolvida em TEB 0,5X e brometo de etídio (0,2 µg/ml). Foi submetido o gel a uma amperagem de 30 ma até que a amostra entrasse no poço, sendo posteriormente ajustada para 60 ma. Visualizou-se as bandas de DNA plasmidial por irradiação ultravioleta de baixa intensidade. Foi utilizado um marcador de peso molecular de 1 kb DNA ladder da promega. Estabilidade Plasmidial Baseado no método de Summers & Sherratt (1984), foram inoculadas células isoladas contendo os plasmídeos crípticos obtidos das bactérias isoladas de bebedouro em meio nutriente, suplementado com antibiótico ampicilina onde as bactérias foram testadas e incubadas à 37ºC overnight; 5 µl dessa cultura foram transferidas para 5 ml de meio nutriente sem antibiótico e alíquotas foram plaqueadas em meio nutriente 1,0% (p/v), suplementado 2

com antibiótico ampicilina e plaqueadas sem o antibiótico. O restante da cultura foi mantida a 37ºC por 24 horas, sob agitação de 150 rpm. Esse procedimento foi repetido durante quatro dias, com inoculações e plaqueamentos realizados a cada 24 horas. Conjugação A conjugação da amostra doadora com a receptora seguiu a metodologia descrita por Mitsuhashi et al., (1960), com modificações. A amostra doadora (Coliformes contendo os plasmídeos crípticos) e as receptoras com características lac Z negativas (DH5α), foram cultivadas separadamente em meio L. Após 18 horas, foram misturados os dois caldos de cultura, reincubados os cultivos bacterianos por 24 horas e selecionados os transconjugantes plaqueando em meio LA contendo ampicilina o cromógeno X-Gal. Após crescimento, observamos o aparecimento das colônias azuis e brancas. Resultado e discussão As amostras coletadas totalizaram 110, sendo 102 das superfícies dos bebedouros das escolas e oito amostras de água, sendo que 21 dessas (três da água, oito do botão que ao pressionar controla a saída de água, e 10 do cano maior do bebedouro) não apresentaram nenhum tipo de contaminação. Dentre as 89 amostras positivas, 49,44% apresentaram contaminações por coliformes e as outras 50,56% das amostras apresentaram positividade para outros tipos de microrganismos. Das oito amostras de água, três delas não foi constatado contaminação, porém, das que apresentaram contaminação, nenhuma deram positiva para os coliformes fecais, diferindo do trabalho de Dantas et al. (2010) que apresentaram todas as amostras contaminadas por bactérias aeróbicas totais e nenhuma contaminação por coliformes totais, obtendo resultado positivo dentre as normas da legislação brasileira. Dados semelhantes para análise da água foram encontrados também por Silva & Pires (2009), que não obtiveram contaminação por Escherichia coli em nenhuma amostra. Em conclusão ao trabalho de Silva et al. (2010) sobre a avaliação da condição sanitária da água de bebedouros públicos, percebeu que a contaminação nem sempre está relacionada com a superfície do bebedouro contaminado, concordando com este trabalho que nem todos os bebedouros que apresentaram contaminação de bactéria na superfície, tiveram suas amostras de água contaminadas. A avaliação de susceptibilidade foi realizada em todas amostras sendo que 85% delas foram sensíveis aos antibióticos (Ampicilina, tetraciclina e Ciprofloxacina), 6,4% estavam classificados em intermediário e 8,6% foram resistentes. Através do isolamento das cepas de Salmonella spp. da água coletada dos Rios Acaraú e Jaguaribe, verificou que o antibiótico tetraciclina apresentou maior número de resistência e mostrou sensibilidade ao antibiótico ciprofloxacino (FIGUEREDO et al., 2008). Nos estudos de Depizzol et. al (2006) no qual isolou E. coli do esgoto sanitário, encontraram altos índices de resistências aos antibióticos tetraciclina, amoxilina, eritromicina e penicilina, mas não houve resistência à neomicina, gentamicina, ciprofloxacino e ceftriaxone. Algumas amostras apresentaram plasmídeo com tamanho molecular entre 8 a 10 kb. As demais amostras que apresentaram plasmídeos não conferiram resistência à antibióticos; as amostras que apresentaram resistência a antibiótico e não foi observado plasmídeo, pode-se sugerir que estão correlacionadas a genes cromossomais. Conforme os estudo de Araújo et. al (2009) que analisaram o perfil plasmidial em bactérias presentes no ribeirão paciência - MG, todas as bactérias que tiveram resistência ao antibiótico ampicilina apresentaram plasmídeo e as bactérias resistentes a tetraciclina e eritromicina não foi observado DNA plasmidial, sugerindo também, como o presente estudo, uma relação de resistência com genes cromossomais. Segundo trabalho de Gonçalves et. al (2004) obtiveram 10 amostras de Vibrio sp. que exibiram de dois a três plasmídeos com pesos moleculares 3

variando entre 5,5 a 40 kilobases. Testes identificaram que todos os plasmídeos foram estáveis e apresentaram conjugação bacteriana eficiente. Hofer et. al (1999) selecionaram 7058 cepas de Vibrio cholerae e encontraram plasmídeos estáveis. A estabilidade foi comprovada durante cinco anos de manuseio das amostras, sem que elas perdessem o fator de resistência. Conforme os estudos de Paula et. al (2003) que analisaram o perfil plasmidial de Fusobacterium nuclatum isolados da mucosa oral de humanos e Cebus apella isolada em primatas, encontraram um perfil plasmidial similar e estável entre as cepas bacterianas. Conforme Vicente et al. (1988) ao avaliarem a presença e a transferência de plasmídeo em coliformes fecais em água de esgoto, obtiveram resultados positivos de conjugação. Conclusão Com todas as informações analisadas podemos concluir que onze amostras foram positivas para E. coli, 28 para Salmonella sp, seis para Klebsiella sp e 44 foram positivas para outros coliformes não identificados. As bactérias identificadas como E. coli, Salmonella sp e Klebsiella sp. apresentaram plasmídeos, contabilizando três amostras de E. coli; sete de Salmonella sp e uma amostra de Klebsiella sp. Das 44 amostras classificadas como alguns tipos de coliformes, 16 apresentaram plasmídeo. Os plasmídeos presentes tiveram um perfil plasmidial semelhantes com peso molecular entre 8 e 10 Kb, podendo ou não conferir resistência à antibiótico. As amostras com resistência à antibiótico e não possuem plasmídeo, sugere que estas relações podem estar ligadas a gene a níveis cromossomais. Contudo, teste de estabilidade plasmidial mostra que todas as amostras são estáveis e puderam se transconjugarem para outra célula bacteriana E. coli da linhagem DH5α. Referência Bibliográfica VICENTE, A.C.P.; DIAS, J.C.A.R.;HOFER,E. Coliformes fecais em água de esgoto.ii.tranferência de marcadores e presença de plasmídeo. Instituto Oswaldo Cruz,Departamento de Bacteriologia. v. 83: 29-35p., 1988. HOFER, E. et. al Emergência da múltipla resistência a antimicrobianos em Vibrio cholerae isolados de pacientes com gastroenterite no Ceará, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 32(2):151-156, 1999. PAULA, M. O. et al. Plasmid profile in oral Fusobacterium nucleatum from humans and Cebus apella monkeys. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 45(1):5-9, 2003. GONÇALVEZ, E. G. R.;HOFER,E ; LEAL, N. C. Estudo Molecular de Vibrio cholerae não- O1 isolado de zooplâncton da Baía de São Marcos/São Luis MA, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 37(4):324-328, 2004. ARAUJO, J. G. et. al. Perfil de Dna plasmidial em bactérias resistentes a antibióticos isoladas do ribeirão paciência- Pará de Minas- MG. SynThesis Revista Digital FAPAM, Pará de Minas, n.1, 2009. DEPIZZOL, F & CASSINI, S. T. A. Avaliação da resistência a antibiótico em isolados de Escherichia coli provenientes de esgoto hospitalas e sanitário. Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil. 2006. 4

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