Diagnóstico Molecular da Tuberculose Profa Dra. Cristiane Cunha Frota
Complexo M. tuberculosis (MTB) - evolução Brosch et al., PNAS, 2002
Complexo MTB (10 espécies) Patógenos associados ao Homem: M. tuberculosis e M. africanum (de Jong BC, et al, PLoS Negl Trop Dis. 2010); M. canettii e TB bacilo liso ( smooth TB bacilli - STB ) (Gutierrez MC, et al,plos Pathog. 2005). Com amplitude de hospedeiros: M. bovis, M. microti, M. caprae, M. orygis, e M. pinnipedii (Brosch R, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; Huard RC, et al., J Bacteriol. 2006; van Ingen J, et al., Emerg Infect Dis. 2012) e Chimpanzee Bacillus (Coscolla M, et al., Emerging Infectious Diseases. 2013).
Posição filogenética do complexo MTB Supply et al., Nat Genet. 2013
Cepa Padrão Mycobacterium tuberculosis H37Rv 1905-1o isolamento patogênica e usada como referência. 1998: genoma completa anotado e publicado.
O genoma do M. tuberculosis Banco de dados: TubercuList http://genolist.pasteur.fr/tuberculist/ 4,4 Mbp ~4 000 genes rico em sequencias de inserção (IS) 65,6% G+C Proteinas ricas em Prolina e àc. Glutâmico: PE e PEGRS
Classificação geral de Função Metabólica dos genes de M. tuberculosis Classe Função No genes % total 1 Metabolismo de lipidios 233 5,7 2 Síntese proteica 207 5,2 3 Processos celulares e parede celular 708 13 4 RNAs 50 1,3 5 Inserções Sequenciais e fagos 149 3,4 6 Proteinas PE e PPE 170 4,2 7 Metabolismo Intermediário e 894 22 respiração 8 Função desconhecida 272 15,3 9 Proteinas regulatórias 189 4,7 10 Conservação hipotética 1051 22,9 11 Virulência, detoxificação e adaptação 99 2,3
Diagnóstico inovador da tuberculose Objetivo: Identificar a presença de DNA ou RNA do gênero Mycobacterium em uma amostra biológica do paciente. Esta identificação deve ser: - Rápida - Sensível - Específica - Discriminatória da espécie - De fácil interpretação - Reprodutível 9
Diagnóstico Molecular da Tuberculose Sequências-alvo do genoma: 16S rrna IS6110 Mycobacterium sp. complexo M. tuberculosis 16S-23S rrna espécies de Mycobacterium rpob Análise de deleção genômica espécies do complexo M. tuberculosis 10
Sequencia genética de escolha Vantagens: - específica para o complexo MTB - 10 a 20 copias em M. tb e M. microti - 1 cópia em M. bovis
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA TUBERCULOSE In-house Comercializados 12
Baseados em PCR (reação em cadeia da polimerase) PCR convencional PCR nested PCR multiplex PCR em tempo Real PCR hibridização LAMP
PCR convencional
PCR convencional
PCR nested
PCR nested
PCR multiplex
PCR multiplex Primers: M. tuberculosis 65KDa, dnaj IS6110
Real Time PCR ou RT-PCR (PCR em Tempo Real)
Leitura do RT-PCR [DNA] [DNA]
PCR em Tempo Real
Kumar et al., Journal of Infection. 2014
PCR seguido de hibridização Vantagens: -especificidade e sensibilidade -Diferenciação de espécies Principio: -Usa uma sonda (probe) de nucleotídeos fixados a uma membrana - revelação por quimioluminescencia
PCR - hibridização
PCR - hibridização
Loop AMP- LAMP (Ensaio amplificado em alça por enzima isotérmica) Identifica 10 9 copias de DNA em < 1 hora Bst polimerase 60-65oC A estrutura é formada 3x em cada metade de ciclo
Iniciadores internos e externos (6 primers) Foward F Backward - B
World Health Organization. The use of a commercial loop mediated isothermal amplification assay (TB-LAMP) for the detection of tuberculosis. 2013. WHO/HTM/TB/2013.05. Geneva, Retrieved from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/83142/1/who_htm_tb_2013.05_eng.pdf.
LAMP (Loop ensaio amplificado por enzima isotérmica) Região primers esat6
LAMP- leitura visual adição de SyberGreen (100x)
Diagnóstico Molecular Comercializados Material com Baciloscopia positiva: Sensibilidade >95%, especificidade 100% Material com Baciloscopia negativa: Sensibilidade >83%, especificidade 99% 33
Testes Comerciais: Amplificação de Ácidos Nucleicos seguido de hibridização Roche s COBAS Amplicor (PCR hibridização) DNA GenProbe s Amplified M. tuberculosis Direct test (AMTD) - rrna BD s ProbeTec-ET Geno-type MTBDR plus assay(gtmd) Hain Lifescience) INNO-LiPA Rif. TB
Testes Comerciais: PCR em Tempo Real COBAS TaqMan MTB test Cepheid s Xpert MTB/RIF
Obrigada!!!