PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA MANIPULAÇÃO DE PRODUTOS QUÍMICOS E AMOSTRAS BIOLÓGICAS LABORATÓRIO DE ENFERMIDADES INFECCIOSAS DOS ANIMAIS Docente responsável pelo laboratório: Prof º Dr. Iveraldo dos Santos Dutra Araçatuba, SP Março / 2017
1 Introdução No laboratório de Enfermidades Infecciosas dos Animais são manipulados microorganismos classificados na Classe de risco I (baixo risco individual e para a coletividade), ou seja, agentes biológicos conhecidos por não causarem doenças em pessoas ou animais adultos e sadios. Classe de risco II (risco individual moderado, risco comunitário limitado) incluindo agentes biológicos que provocam infecções no homem ou nos animais, cujo potencial de propagação na comunidade e de disseminação no meio ambiente é limitado, e para os quais existem medidas terapêuticas e profiláticas eficazes. De acordo com essa classificação são relacionados alguns dos principais agentes biológicos classe II que fazem parte da rotina do laboratório. Clostridium spp, Clostridium chauvoei, Clostridium haemolyticum, Clostridium histolyticum, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Clostridium tetani. Escherichia coli, todas as cepas enteropatogênicas, enterotoxigênicas, enteroinvasivas e detentoras do antígeno K1, Salmonella spp todos os sorotipos. Shiguella spp, Shiguella boydii, Shiguella dysenteriae, Shiguella fexneri, Shiguella sonnei. Staphylococcus spp., Streptococcus spp. Porphyromonas spp., Prevotella spp., Trueperella pyogenes. Classe de risco III (alto risco individual e moderado risco para a comunidade). Inclui agentes biológicos que possuem capacidade de transmissão por via respiratória e que causam patologias humanas ou animais, potencialmente letais, para os quais existem usualmente medidas de tratamento e/ou de prevenção. Representam risco se disseminados na comunidade e no meio ambiente, podendo se propagar de pessoa a pessoa. Ex: Clostridium botulinum dos tipos C e D. O cultivo desse agente é realizado pontualmente em material de diagnóstico e pesquisa em meio de cultivo e tratam-se de tipos considerados não causadores de doença ao homem. A detecção de toxinas em espécimes clínicos de animais refere-se à tentativa de evidenciação pelo bioensaio em camundongo e soroneutralização, sem riscos diretos às pessoas e possíveis de ser realizado em laboratório que atenda à Classe de risco II. Assim, como são atividades de diagnóstico e pesquisa eventuais, não constituem cultivo ou manipulação em larga escala.
Agentes Bacterianos, segundo o Manual de Classificação de Risco dos Agentes Biológicos do Ministério da Saúde 2006 pag. 25. 1.2 Características do Clostridium spp. e das clostridioses As espécies de Clostridium são bactérias anaeróbias Gram-positivas, fermentativas, catalase-negativas, oxidase-negativas e que requerem meios enriquecidos para crescer. São bacilos retos ou levemente curvos, e a maioria possui motilidade pela presença de flagelos. Micro-organismos desse gênero produzem endósporos e o tamanho, a forma e a localização destes podem ser usados para a diferenciação das espécies. Os clostrídios são saprófitos, encontrados no solo, na água fresca e constituem parte da microbiota intestinal normal, e alguns podem ser isolados como endósporos no músculo ou no fígado. Os esporos de Clostridium são resistentes a agentes químicos mas são destruídos por autoclave a 121ºC por 15 minutos. Já as neurotoxinas são inativas por fervura por até 20 minutos. Embora mais de 100 espécies de Clostridium sejam reconhecidas, menos de 20 são patogênicas, podendo ser agrupadas em três categorias baseadas na atividade tóxica. Os clostrídios neurotóxicos, Clostridium botulinum e C. tetani, produzem seus efeitos pela elaboração de neurotoxinas potentes que afetam a função neuromuscular sem indução observável de lesão tecidual. A neurotoxina de C. tetani é produzida por microorganismos que replicam localmente em tecidos lesados. A toxina absorvida exerce seu efeito nas junções sinápticas distantes de seu local de produção, causando paralisia espástica e ocasiona no quadro clínico do tétano. A neurotoxina de C. botulinum é geralmente produzida por micro-organismos que replicam em matéria orgânica em decomposição ou sob condições de anaerobiose em conservas contaminandas. Quando absorvida do trato gastro-intestinal para a corrente sanguínea, a toxina age nas junções neuromusculares dos nervos colinérgicos e causa interferência na liberação de aceticolina, resultando em paralisia flácida e ocasiona o quadro clínico do botulismo. Em contraste, os clostrídios histotóxicos, como C. chauvoei, C. septicum, C. novyi tipo A e B, produzem lesões relativamente localizadas em tecidos (como nos músculos e fígado) e podem subseqüentemente causar toxemia. As exotoxinas elaboradas por bactérias em replicação induzem necrose tecidual local e efeitos sistêmicos que podem ser letais. Alguns clostrídios histotóxicos estão presentes nos tecidos como esporos latentes que em condições favoráveis de anaerobiose podem germinar e produzir
doença clínica. As infecções clínicas produzidas por clostrídios histotóxicos incluem carbúnculo sintomático, edema maligno, gangrena gasosa, hepatite necrótica infecciosa, entre outras. Clostridium perfringens tipos A até E, importantes membros da terceira categoria, produzem lesões inflamatórias no trato gastro-intestinal juntamente com enterotoxemia. Esses micro-organismos proliferam-se no trato intestinal e elaboram toxinas que produzem tantos efeitos localizados como generalizados. Clostridium perfringens tipo B, C e D são particularmente significativos em animais domésticos. Métodos inapropriados de criação, mudanças repentinas da dieta e influências ambientais são fatores que predispõem a proliferação dos clostrídios no intestino. 3. Procedimentos operacionais padrão para manipulação de amostras biológicas ou reagentes químicos Todas as atividades no Laboratório de Enfermidades Infecciosas dos Animais devem ser realizadas de acordo com as condições previstas para o Nível de Biossegurança 2 (NB-2). Neste documento, estão relacionados os procedimentos padrão comuns a todas as técnicas relacionadas à manipulação de amostras biológicas ou de reagentes químicos, visando à segurança do pessoal do laboratório. Os protocolos detalhados de cada técnica utilizada estão disponíveis no laboratório. 3.1 Procedimentos antes do início dos trabalhos Somente pessoas autorizadas podem entrar no laboratório. Durante o trabalho, as portas devem ser mantidas fechadas. O uso de tamancos, sandálias e chinelos é proibido no ambiente do laboratório. Utilize calçados fechados. Objetos de uso pessoal devem ser guardados em local disponível para essa finalidade, incluindo mochilas, pastas, etc. É proibido utilizar relógios, anéis, brincos ou outros objetos que podem interferir na utilização de luvas ou ser contaminados durante a manipulação de amostras.
É proibida a utilização de aparelho celular durante a manipulação de amostras químicas ou biológicas. 3.1.2 Procedimentos durante a execução dos trabalhos Lave as mãos antes de iniciar o trabalho e após a manipulação de reagentes químicos ou de amostras biológicas, mesmo após o uso de luvas de proteção, bem como antes de deixar o laboratório. Adquira o hábito de conservar as mãos longe da boca, nariz, olhos e rosto. É obrigatória a utilização dos seguintes equipamentos de proteção individual (EPI): Protetores faciais e oculares: utilize máscara de proteção facial e óculos de proteção ao manipular qualquer reagente (líquido ou pó) que possa ser inalado/ingerido (ex: Meios de cultura, ácidos, bases, álcool, solventes entre outros. Vestimenta tipo jaleco: a utilização de jalecos é obrigatória no ambiente do laboratório. Luvas de procedimento descartáveis: Para manipulação de amostras biológicas, utilize luvas de procedimento descartáveis e óculos de proteção. Para manipulação de reagentes químicos, utilize luvas de acordo com sua resistência química (http://www.unesp.br/portal#!/costsa_ses/curso-de-gestao-de-epi/) É proibido utilizar qualquer EPI em ambientes fora do laboratório. Equipamentos de proteção coletiva (EPC), como cabines de biossegurança ou cabines de exaustão devem ser utilizadas obrigatoriamente durante a manipulação de amostras biológicas ou de reagentes químicos destinadas a esses fins: A manipulação de substâncias líquidas voláteis ou irritantes como éter, formol e ácido clorídrico entre outros deve ser realizada na cabine de exaustão. Durante a manipulação de amostras fecais contendo agentes infecciosos, incluindo Clostridium botulinum, E. Coli entre outros, todo o material reaproveitável (tubos, frascos, vidrarias, espátulas tesouras pinças, etc.) deve ser imerso em água quente (no mínimo 80º C por 15 minutos. 3.1.3 Procedimentos após o término dos trabalhos Qualquer material armazenado no laboratório deve estar organizado e claramente identificado. Não armazene amostras ou reagentes em sacos plásticos, frascos de margarina, papel alumínio, etc.. Utilize frascos e caixas adequadas para armazenamento.
Sempre proceda à limpeza total de qualquer superfície ou equipamento, imediatamente após o uso, como pias, bancadas, fluxo laminar, armários, gavetas, banho-maria, balanças e centrífugas, utilizando papel toalha descartável embebido em álcool 70%. Remova qualquer solução ou reagente presente em equipamentos como balança, centrífuga logo após o uso. Faça a limpeza com álcool 70% ou então, em caso de centrifugação de material infeccioso, coloque o rotor da centrífuga em água quente (no mínimo 70º C por 15 minutos). Nunca deixe a limpeza e a desinfecção para serem realizadas no outro dia. Micropipetas ou qualquer outro material utilizado para manipulação de material biológico devem ser limpos com papel toalha embebidas em álcool 70% e submetidas à luz UV por 30 minutos, no interior da cabine de biossegurança ou capela. Nunca deixe qualquer material sobre a bancada, como pedaços de papel alumínio, tubos, adesivos, fitas, grampos, etc. 3.1.4 Descarte de resíduos biológicos Os meios de cultura sólidos e/ou líquidos utilizados para crescimento de bactérias devem ser autoclavados por 20 minutos a 121º C antes de serem descartados em lixo destinado a material biológico. Resíduos de material biológico, incluindo amostras fecais e material de consumo contaminado com amostras biológicas, devem ser descartados em recipiente adequado para lixo biológico, disponível no laboratório. 3.1.5 Descarte de resíduos químicos Várias substâncias químicas são manipuladas no laboratório. Os resíduos químicos devem ser devem ser embalados, rotulados e armazenados para posterior envio para o descarte final, conforme preconizado pelo manual de descarte de resíduos químicos da unidade. 3.1.6 Procedimentos em caso de acidentes Acidente com substâncias químicas A FISPQ (Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos) dos produtos químicos utilizados no laboratório deve estar acessível a todas as pessoas que manipulam
agentes químicos no laboratório. As informações dessa ficha, referentes à identificação dos perigos e medidas de primeiros-socorros, devem ser utilizadas para elaboração dos procedimentos necessários em caso de acidentes com agentes químicos. Como procedimento emergencial, em caso de: Contato com a pele: lavar abundantemente com água corrente e remover imediatamente as roupas contaminadas. Se necessário, utilizar o chuveiro de emergência. Contato com os olhos: lavar com o chuveiro lava-olhos por 15 minutos. Acidente com material biológico: Comunicar imediatamente o responsável imediato pelo laboratório. Qualquer acidentado com material biológico deve ser encaminhado ao pronto-socorro mais próximo da Unidade ou a um infectologista. Todos os acidentes devem ser comunicados ao Chefe do Departamento e à Diretoria da Faculdade. Material biológico com status de contaminação desconhecido: Em caso de contato com a mucosa ocular, proceder à lavagem em chuveiro lava-olhos, com água corrente. Após contato com a pele, lavar com água e sabão, enxaguar e realizar antissepsia com álcool 70%. Local de atendimento médico e contatos de plantões de informações Quando necessário, a pessoa exposta a substâncias químicas ou agentes biológicos deverá ser encaminhada ao Pronto Socorro Municipal de Araçatuba no endereço: rua Dona Ida, 1350, Bairro Aviação (Telefone: 3636-1160). Em caso de impossibilidade de encaminhamento, solicitar atendimento ao Serviço de Atendimento Municipal de Urgência SAMU (Telefone: 192). Para sanar dúvidas sobre qualquer tipo de intoxicação, utilize o Disque-Intoxicação, da ANVISA, pelo número 0800-722-6001. A ligação é gratuita e o usuário é atendido por uma das 36 unidades da Rede Nacional de Centros de Informação e Assistência Toxicológica (Renaciat). Outras alternativas para assistência em casos de intoxicação com produtos químicos: 1) Centro de Assistência Toxicológica de São José do Rio Preto/SP, Hospital de Base - Fundação Faculdade Regional de Medicina (FUNFARME). Av. Brigadeiro Faria Lima,
5416, Bairro São Pedro. Telefone (17) 3201-51000, ramais 1380 ou 1560. Atendimento 24 h pelo telefone (17) 3201-5175. e-mail: ceatox.hbase@famerp.br. 2) Centro de Assistência Toxicológica (CEATOX) do Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu. O CEATOX oferece atendimento telefônico na prevenção, orientação e informações tóxico-farmacológicas a profissionais de saúde, hospitais, prontos-socorros, postos de saúde e à comunidade em geral por meio dos contatos: telefone (14) 3815-3048 e plantão telefônico 24 horas pelo número 0800-722-6001. E- mail: ceatox@ibb.unesp.br. Os contatos de outros centros de assistência toxicológica estão relacionados no endereço http://www.cvs.saude.sp.gov.br/procura_det.asp?procura_id=6 CIENTE E DE ACORDO: Todos que realizam atividades no laboratório.