CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PROTOZOÁRIOS ENCONTRADOS EM FEZES E CÉREBRO DE CÃES E DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DE Neospora caninum NESTA ESPÉCIE ANIMAL

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PROTOZOÁRIOS ENCONTRADOS EM FEZES E CÉREBRO DE CÃES E DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DE Neospora caninum NESTA ESPÉCIE ANIMAL Doutorando (a): Vanessa Silvestre Ferreira de Oliveira Orientador (a): Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva GOIÂNIA 2011

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iii VANESSA SILVESTRE FERREIRA DE OLIVEIRA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PROTOZOÁRIOS ENCONTRADOS EM FEZES E CÉREBRO DE CÃES E DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DE Neospora caninum NESTA ESPÉCIE ANIMAL Tese apresentada para a obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás Área de Concentração: Sanidade Animal e Higiene e Tecnologia de alimentos Orientador (a): Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva - IPTSP/UFG Comitê de Orientação: Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares - EV/UFG Profa. Dra. Lígia Miranda Ferreira Borges - IPTSP/UFG GOIÂNIA 2011

iv Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) GPT/BC/UFG O482c Oliveira, Vanessa Silvestre Ferreira de. Caracterização molecular de protozoários encontrados em fezes e cérebros de cães e diagnóstico de Neospora caninum nesta espécie animal [manuscrito] / Vanessa Silvestre Ferreira de Oliveira. - 2011. 78 f. : il. Orientadora: Profª. Drª. Andréa Caetano da Silva. Tese (Doutorado) Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia, 2011. Bibliografia. 1. Protozoários Diagnóstico. 2. Neospora caninum. I. Título. CDU: 636.7:561.24

v AGRADECIMENTOS Nestes quatro anos que se passaram, muitas pessoas contribuíram de alguma maneira para a realização do meu doutorado, e espero conseguir transmitir o meu eterno agradecimento a cada um. Em primeiro lugar, agradeço a Deus por mais esse presente, pelas pessoas que conheci nesta caminhada e por tudo que pude aprender. À minha orientadora Andréa, por tudo que me ensinou na vida profissional e pessoal, por ser uma amiga e até mãe em muitos momentos em que me encontrei com dificuldades, sempre com disposição, bom humor e alegria. Também pela oportunidade de viver em Madrid, aprender tantas coisas novas, conhecer outra língua, outra cultura e pessoas que fizeram diferença na minha vida. A CAPES/MECD-Espanha, pela bolsa de doutorado-sanduíche que custeou todo o meu aprendizado. Aos meus queridos amigos Paula, Débora, Carla, Sabrina e Marcelo, por todo apoio profissional, moral e espiritual. Por estarem do meu lado mesmo distante, me dando força e me colocando para cima, sempre com palavras positivas e um bom humor que contagia e que fez a diferença, tornando mais leves os problemas do dia a dia. Aos meninos do laboratório, Lorena, Hélio, Carol, Kennedy, Sara e Loreninha, pelos bons e alegres momentos de tantas conversas, tantas risadas e tanto apoio. À Cybelly, Aline, Jaires e Marcelo, pela imensa ajuda na colheita de material no Centro de Zoonoses, sem vocês eu jamais teria conseguido. Ao Luis Ortega-Mora, por me receber tão bem no grupo SALUVET da Universidad Complutense de Madrid, foi uma honra conhecer e trabalhar com um profissional tão dedicado. Às queridas Gema e Susana, que me ensinaram tanto, com tanta paciência e tanta disposição. Agradeço de coração tudo o que fizeram por mim, não as esquecerei jamais. À Esther pela idéia do projeto, por me acompanhar e orientar mesmo distante. Aos meus amigos queridos Marta, Javi Moreno, Vanesa, Claudia e Carmen, pela companhia e amizade, por fazerem da minha estadia em Madrid e do trabalho no laboratório mais confortantes, como se eu realmente estivesse em casa.

vi Aos companheiros de laboratório, Vero, Adri, Virgínia, Silvia, Lobo, Fran, Javier, Alba e Elena, por tudo que me ensinaram e por me receberem tão bem, pela companhia agradável e bem humorada, tornando o trabalho mais prazeroso. Às minhas companheiras de apartamento, amigas eternas, Chris, Mari e Lorena. Vocês foram minha família, minhas amigas, meu apoio. Tudo ficou tão mais fácil perto de vocês, obrigada por tudo. À Itsaso e Ceci, pela amizade linda que me proporcionaram, por tudo que me ensinaram na língua espanhola e na vida. Vocês estão no meu coração para sempre. Aos meus pais, que me apoiaram tanto e me deram forças para agüentar a saudade de estar longe de casa, por todo o amor a mim dedicado. Vocês são muito importantes para mim. Ao Ricardo, por me incentivar sempre, por estar ao meu lado em todas as circunstâncias e por todo o amor que trouxe à minha vida. Obrigada por ser meu amigo, amor e companheiro. Às minhas amigas de sempre e para sempre Lili, Raquel, Clarissa, Flávia, Nicolle, Liliana, Marina e Úrsula, que fazem parte de cada passo que dou, que torcem por mim e que tornam minha vida mais leve e mais feliz. Aos meus novos amigos e companheiros de trabalho no Labvet: Gabi, Rafael, Marília e Tati, pelos bons e alegres momentos proporcionados no dia a dia. Às minhas cadelas Sofia e Cristal, alegria dos meus dias, e, como não, a todos os cães que participaram desse experimento, que suas vidas não tenham sido em vão.

vii Que en la senda del vivir no ir adelante, es ir atrás; y el que a arar empieza, no ha de volver la cabeza, sino arar y proseguir. (Lope de Vega)

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ix RESUMO GERAL Este trabalho teve como objetivos identificar os protozoários encontrados em fezes de cães, observar a ocorrência da infecção por Neospora caninum e Toxoplasma gondii em cães pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), desenvolver e validar técnicas de ELISA para o diagnóstico sorológico de N. caninum em cães, determinar a utilidade do Western Blot para esse diagnóstico e observar a ocorrência de DNA de N. caninum, T. gondii e Hammondia heydorni em tecido cerebral de cães. Para isso, foram colhidas amostras de cérebro e sangue de 251 cães, e fezes de 106 cães, provenientes do Centro de Zoonoses de Goiânia, Goiás. Foram utilizados oito soros de infecção experimental por N. caninum e quatro por T. gondii para comprovação dos resultados sorológicos. As amostras de fezes foram concentradas pelo método de Teleman seguido da flutuação com solução de Sheather, para visualização dos oocistos. Foi realizada a extração de DNA de todas as amostras, posteriormente analisadas por nested- PCR específicas para detecção de DNA de N. caninum, H. heydorni, T. gondii, Cryptosporidium spp. e Giardia spp. Uma nested-pcr foi ainda realizada nas amostras em que foram visualizados oocistos menores de 20 µm, para a detecção de DNA de coccídios e posterior seqüenciamento, para correta identificação dos mesmos. A técnica de RIFI foi realizada em todas as amostras de sangue, e técnicas de ELISA foram padronizadas, utilizando-se extrato solúvel de taquizoítos e as proteínas recombinantes rncgra7, rncsag4, rncbsr4 e rncsrs9 de N. caninum. Para a detecção de DNA dos parasitos nos cérebros, estes foram divididos em três partes, e de cada parte foi realizada a extração de DNA. Após a extração, foram realizadas nested-pcr específicas para cada parasito. Nas fezes dos cães, foram encontradas doze amostras contendo oocistos. Em seis, os oocistos eram maiores que 20 µm, e foram identificados como de Cystoisospora canis, e nas outras seis, oocistos menores que 20 µm foram visualizados e identificados como sendo quatro de H. heydorni, um de Cystoisospora spp. e uma amostra apresentava DNA tanto de H. heydorni quanto de Cystoisospora spp. DNA de C. canis foi identificado em quatro amostras, uma amostra foi identificada como G. duodenalis genótipo C e quatro como G. duodenalis genótipo D. Nenhuma amostra de fezes foi positiva para N. caninum e T. gondii, e quatro foram positivas para H. heydorni na PCR específica para este parasito. Nos cérebros analisados, foram encontradas seis amostras (2,4%) positivas a N. caninum e 23 amostras (9,1%) foram positivas a T. gondii. Nenhuma amostra foi positiva a H. heydorni. Anticorpos anti-n. caninum foram encontrados em 18,32% dos cães analisados, e 56,57% dos cães apresentaram sorologia positiva a T. gondii pela técnica de RIFI. Técnicas de ELISA foram padronizadas, utilizando-se extrato solúvel de taquizoítos e as proteínas recombinantes rncgra7, rncsag4, rncbsr4 e rncsrs9 de N. caninum. Foram encontrados valores de sensibilidade e especificidade menores que 84%, além do reconhecimento das proteínas recombinantes pelos dois parasitos, nos soros de infecções naturais e experimentais. Uma baixa concordância entre as técnicas foi observada, com valores de Kappa inferiores a 0,4. Os resultados encontrados indicam que N. caninum está menos presente em fezes de cães, enquanto H. heydorni é mais facilmente encontrada. As amostras que continham Cryptosporidium e Giardia foram identificadas como espécies-específicas. A

x pesquisa de DNA de parasitos em órgãos de cães pode ser utilizada como uma ferramenta para o diagnóstico post-mortem de infecções por protozoários, porém as técnicas de PCR podem apresentar baixa sensibilidade devido à pequena quantidade de tecido utilizado. Os resultados encontrados no WB indicam não haver um padrão de reconhecimento das proteínas imunodominantes, e que as técnicas sorológicas na neosporose canina têm limitações, devido aos baixos títulos encontrados e à reação cruzada com T. gondii, além da alta prevalência da infecção por T. gondii em cães, e presença de infecções mistas. PALAVRAS-CHAVE: Cryptosporidium canis, ELISA, Giardia duodenalis, Hammondia heydorni, Neospora caninum, PCR, RIFI, Toxoplasma gondii.

xi SUMÁRIO CAPÍTULO 1: Considerações gerais... 01 1.1 Protozoários intestinais de cães... 01 1.2 Diagnóstico de N. caninum em cães... 08 1.3 Objetivos... 11 Referências... 11 CAPÍTULO 2: Identificação e caracterização molecular de protozoários intestinais em fezes de cães... 20 Resumo... 20 Abstract... 21 Introdução... 21 Material e métodos... 23 Resultados... 27 Discussão... 28 Conclusão... 31 Referências... 31 CAPÍTULO 3: Utilização de Imunofluorescência Indireta, Ensaios imunoenzimáticos recombinantes, Western Blott e nested PCR no diagnóstico de Neospora caninum em cães... 38 Resumo... 38 Abstract... 38 Introdução... 39 Material e métodos... 41 Resultados... 47 Discussão... 57 Conclusão... 61 Referências... 62 CAPÍTULO 4: Considerações finais... 67

1 CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS 1.1 Protozoários intestinais de cães Os cães podem hospedar diferentes espécies de protozoários, como Neospora caninum, Hammondia heydorni e Cystoisospora spp., capazes de causar infecção nos próprios cães e em outros animais, e outros com potencial zoonótico, como Cryptosporidium e Giardia. Tanto a estrutura como o ciclo de vida de N. caninum são muito similares aos do Toxoplasma gondii, com duas diferenças importantes: a neosporose é uma enfermidade que acomete principalmente bovinos, enquanto a toxoplasmose afeta principalmente humanos, ovinos e caprinos. Os cães e outros canídeos são os hospedeiros definitivos de N. caninum (MCALLISTER et al., 1998, GONDIM et al., 2004) e os felinos são os hospedeiros definitivos do T. gondii (DUBEY et al., 2007a). O ciclo biológico do N. caninum é caracterizado pela fase assexuada, que se desenvolve tanto no hospedeiro definitivo como no hospedeiro intermediário, e a fase sexuada, que ocorre nos hospedeiros definitivos. Na fase assexuada, os taquizoítos, bradizoítos e cistos são intracelulares e localizam-se em diferentes tecidos e órgãos, como cérebro, medula espinhal, nervos, músculos cardíacos, músculos esqueléticos, fígado e músculos oculares (BARR et al., 1990; DUBEY & LINDSAY, 1996, LINDSAY et al., 1996). O ciclo intestinal do parasito ainda não foi descrito (GONDIM et al., 2002), porém a fase sexuada provavelmente ocorre no intestino dos hospedeiros definitivos, que se infectam ao consumir taquizoítos ou tecidos infectados com cistos parasitários. Os cães, após ingerirem tecidos infectados, eliminam oocistos não esporulados nas fezes (MCALLISTER et al., 1998). A transmissão experimental em cães pode ocorrer após ingestão oral de tecidos contendo cistos e por administração parenteral de taquizoítos. Os resultados obtidos em cães são bastante diferentes dos obtidos em bovinos, nos quais são observadas altas taxas de transmissão vertical, geralmente com títulos

2 altos de anticorpos (DUBEY et al., 2007a). Cada população de cães pode ser exposta a diferentes fatores de risco, tais como a ingestão de carne crua ou placenta infectada, e também a ingestão de água ou alimentos contaminados com oocistos esporulados (DIJKSTRA et al.,2002). Estudos a respeito da prevalência de anticorpos anti-n. caninum em cães foram realizados em mais de 30 países em todo o mundo (DUBBEY et al., 2007a), sendo que no Brasil, demonstraram que a enfermidade está presente, tanto em cães de área rural, com taxa de soropositividade variando entre 21,7% a 58,9% (ANDREOTTI et al., 2004, HASEGAWA et al., 2004, FERNANDES et al., 2004, ROMANELLI et al., 2007) quanto em cães de área urbana, com prevalência variando entre 8,3% a 45% (CAÑON-FRANCO et al., 2003, GENNARI et al., 2002,, FERNANDES et al., 2004, AZEVEDO et al., 2005, AGUIAR et al., 2006, ANDREOTTI et al., 2006, TEIXEIRA et al., 2006, BOAVENTURA et al., 2008). A prevalência em relação à idade sugere que a maioria dos cães é infectada após o nascimento, uma vez que a maior prevalência tem sido documentada em cães mais velhos quando comparado com cães jovens (WOUDA et al., 1999, CAPELLI et al., 2004; MALMASI et al., 2006, ANDREOTTI et al., 2006). Também se observa uma maior prevalência de cães soropositivos provenientes de zonas rurais, pois é mais fácil o acesso a bovinos que possam estar infectados (WOUDA et al., 1999). N. caninum pode ser encontrado em órgãos como o cérebro, medula espinhal, retina, músculos, timo, coração, fígado, rim, estômago, glândula adrenal e pele onde pode formar cistos e persistir por um longo tempo, levando à infecção crônica (PETERS et al., 2000). A maioria dos casos clínicos em cães ocorre em filhotes infectados congenitamente (DUBEY et al., 1990), caracterizando-se por uma paralisia ascendente, com os membros posteriores geralmente mais afetados, podendo ter hiperextensão rígida ou flácida, provavelmente decorrente da poliradiculoneurite e miosite causadas pela infecção (DUBEY et al., 1988a). Podem ainda apresentar dificuldade de deglutição, paralisia da mandíbula, cegueira, convulsões, incontinência urinária e fecal, flacidez e atrofia muscular e falha cardíaca (LINDSEY et al., 1999). Os cães geralmente nascem sem sintomas e começam a desenvolver sinais clínicos três semanas ou mais após o nascimento, e nem todos os filhotes

3 são afetados com o mesmo grau (DUBEY et al., 2007b). Em cães adultos a apresentação é mais variada, e além do quadro neuromuscular, podem ocorrer dermatite piogranulomatosa, miocardite fatal e pneumonia. Os cães podem sobreviver durante meses com paralisia progressiva, meningoencefalite, insuficiência cardíaca, complicações pulmonares e, muitas vezes, os animais precisam ser eutanasiados (BARBER & TREES, 1998). A toxoplasmose canina, por sua vez, é clinicamente similar à infecção por N. caninum, que anteriormente era confundida com toxoplasmose (DUBEY et al., 2009). Vários estudos demonstram que os cães apresentam uma alta soroprevalência de T. gondii, geralmente mais alta que de N. caninum (MINEO et al., 2001; CAÑON-FRANCO et al., 2004; ASLANTAS et al., 2005; AZEVEDO et al., 2005; DUBEY et al 2007c). Os sintomas clínicos, porém, são raros, podendo localizar-se nos sistemas respiratório, neuromuscular ou gastrintestinal, ou ainda, se apresentar como uma infecção generalizada (DUBEY et al., 2009). H. heydorni também é um coccídio morfológica e geneticamente relacionado ao N. caninum, e que apresenta o cão e outros canídeos como hospedeiros definitivos (REICHEL et al., 2007). Porém, pouco se sabe sobre este parasito, que no passado era frequentemente confundido com N. caninum, embora ambos hoje sejam reconhecidos como espécies independentes (DUBEY et al., 2002) e possam ser distinguidos por meio da aplicação de técnicas moleculares (SLAPETA et al., 2002). Similar a N. caninum, H. heydorni tem um ciclo de vida cão-bovino, embora outros animais, como cervos, possam atuar como hospedeiros intermediários (DUBEY et al., 2004). A transmissão transplacentária de N. caninum é muito eficiente no gado, enquanto que H. heydorni não teve demonstrada sua transmissibilidade pela placenta (DUBEY et al., 2002) nesta espécie animal. N. caninum e H. heydorni, possui oocistos pequenos (10-13 µm). Oocistos de N. caninum esporulados variam de esféricos a subesféricos, e medem 11.7 x 11.3 µm (DUBEY et al., 2002). Vários autores afirmam que os oocistos de N. caninum e H. heydorni são morfologicamente indistinguíveis, o que torna difícil o diagnóstico coprológico em hospedeiros definitivos (SLAPETA et al., 2002, REICHEL et al., 2007, DUBEY et al., 2009). Porém, SCHARES et al. (2005) demonstraram diferenças

4 morfológicas entre oocistos de N. caninum e outras espécies, em que os oocistos de N. caninum se apresentaram menores, e com uma relação comprimentolargura menor que os oocistos de H. heydorni, T. gondii ou Hammondia hammondi. Também, cães eliminando H. heydorni apresentaram mais oocistos por grama de fezes em comparação a cães eliminando N. caninum, mas as diferenças não foram estatisticamente importantes. Cães são frequentemente infectados por coccídios do gênero Cystoisospora spp., com pelo menos quatro espécies reconhecidas: C. canis, C. ohioensis, C. burrowsi e C. neorivolta. O ciclo de vida de Cystoisospora ssp é similar ao ciclo de vida básico do coccídio intestinal. Mediante ingestão pelos hospedeiros definitivos, os oocistos se rompem na presença de bile e esporozoítos livres invadem o intestino. Alguns esporozoítos penetram na parede intestinal e entram nos nódulos linfáticos mesentéricos ou outros tecidos extraintestinas, onde formam cistos monozóicos que aumentam de tamanho. Os cistos podem permanecer em tecidos extra-intestinas de hospedeiros intermediários durante toda a vida do hospedeiro. A ingestão destes cistos pelo hospedeiro definitivo leva a infecções intestinais no mesmo (DUBEY et al., 2009). Os oocistos de Cystoisospora spp formam dois grupos: oocistos grandes (25-35µm) pertencentes a C. canis, e oocistos intermediários (17-23 µm), que pertencem ao grupo C. ohioensis. Os membros deste grupo são clinicamente importantes por causarem diarréia em filhotes de cão (LINDSAY et al., 1997). Os sinais clínicos são mais evidentes em cães recém-nascidos. Diarréia com perda de peso e desidratação e, raramente, hemorragia, são os principais sinais observados em cães. Anorexia, vômitos, depressão mental, e finalmente a morte pode ser visto em animais severamente afetados. A patogênese da coccidiose intestinal em cães não é bem compreendida, pois a doença clínica não foi produzida em animais experimentalmente infectados, e os sinais clínicos não estão correlacionados com o número de oocistos encontrados nas fezes. Além disso, pouco se sabe sobre a virulência das diferentes cepas destes parasitos (MITCHELL et al., 2007). Outros protozoários, além dos descritos anteriormente, podem ser encontrados nas fezes de cães, como Cryptosporidium e Giardia, parasitos capazes de infectar uma grande variedade de vertebrados (CACCIÒ et al., 2005).

5 O ciclo de vida do Cryptosporidium se completa em um único hospedeiro, com estágios similares aos coccídios dos gêneros Eimeria e Cystoisospora. Os oocistos contêm quatro esporozoítos infectantes e são excretados nas fezes (XIAO & FAYER, 2008). A transmissão se dá pela ingestão dos oocistos infectantes pelos hospedeiros em água ou alimentos contaminados, e a infecção pode ocorrer mesmo sem a apresentação de sinais clínicos que, quando ocorrem, cursam com diarréia líquida, e a cura na maioria das vezes é espontânea. Infecções por Cryptosporidium não são muito comuns em cães, e quando diagnosticadas, geralmente estão associadas com fezes normais que contêm relativamente poucos oocistos por grama (ABE et al., 2002). Os dados de prevalência de Cryptosporidium no Brasil, em humanos, variam de 1,1% a 17,4% (CARNEIRO et al., 1995; GENNARI et al., 1996, NEWMAN et al., 1999, OSHIRO et al., 2000), e um estudo realizado em pacientes HIV positivos na região do triângulo mineiro detectou a presença do parasito nas fezes de 9,4% (34/359) dos pacientes (OLIVEIRA-SILVA, et al., 2007). Em cães, observa-se uma prevalência mais baixa, de 1,85% a 2, 41% (FIGUEIREDO et al., 2004, HUBER et al., 2005, MUNDIM et al., 2007). Oocistos de Cryptosporidum podem ser detectados por uma variedade de testes diagnósticos, como a utilização de métodos de concentração (flutuação centrífuga em solução saturada de sacarose ou solução de Sheather) ou emprego de métodos especiais de coloração, como por exemplo, Ziehl-Neelsen modificado, além de técnicas como Imunofluorescência Direta ou ELISA (Ensaio Imunoenzimático) (SCORZA & TANGTRONGSUP, 2010). Porém, nenhuma destas técnicas é capaz de identificar qual a espécie de Cryptosporidium envolvida na infecção. Técnicas moleculares, como a PCR e o seqüenciamento de DNA, apresentam-se como alternativas ao diagnóstico convencional do Cryptosporidium, e são capazes de identificar as espécies (XIAO & FAYER, 2008). Em estudos de caracterização genética dos oocistos de Cryptosporidium recuperados de amostras fecais de cães, gatos e humanos, normalmente é observada uma infecção espécie-específica, ou seja, com genótipos associados aos hospedeiros, por exemplo, cães são geralmente

6 infectados com C. canis, gatos com C. felis, humanos com C. hominis e C. parvum (ABE et al., 2002; HUBER et al., 2007; XIAO & FAYER, 2008). Porém, espécies como o C. canis, C. felis e C. muris já foram identificados em humanos, tanto em indivíduos imunocomprometidos quanto em imunocompetentes (PEDRAZA-DIAZ et al., 2001; XIAO et al., 2001), sendo inclusive isolados de pacientes HIV positivos, e associados a sintomas significativos (XIAO & FAYER, 2008). A freqüência dessas espécies em humanos, entretanto, é baixa, e comumente ocorre em concomitância com outra doença, ou em condições que aumentem a susceptibilidade à infecção por Cryptosporidium. CAMA et al. (2008) demonstraram C. canis infectando crianças aparentemente normais em algumas comunidades de baixa classe econômica, demonstrando o potencial zoonótico desta espécie. Giardia spp., outro protozoário que infecta cães, tem um ciclo de vida simples e direto. Cistos excretados nas fezes podem permanecer infectantes por meses em um ambiente úmido e fresco. Depois da ingestão dos cistos, os trofozoítos surgem no duodeno e completam a divisão mitótica. A infecção em novos hospedeiros se dá pela ingestão de cistos e repetidas divisões dos trofozoítos, que se fixam à superfície das microvilosidades intestinais, abaixo da camada de muco, por meio de um disco adesivo ventral. Os cistos se formam em resposta às condições intestinais, passam pelo intestino e são disseminados pelas fezes, contaminando água e alimentos (XIAO & FAYER, 2008). Infecções por Giardia spp. são comuns em cães e gatos, geralmente com prevalências altas (BOWMAN & LUCIO-FORSTER, 2009). No Brasil, a prevalência de giardíase em humanos varia de 4 a 30% (CARDOSO et al., 1995; GUIMARÃES & SOGAYAR, 1995), e geralmente apresenta-se com freqüência acima de 30% em cães (HUBER et al., 2005, MUNDIM et al., 2007). A nomenclatura para Giardia ainda é confusa. Com base na morfologia dos trofozoítos existem seis espécies de Giardia: G. muris que infecta roedores, G. agilis (anfíbios), G. psittaci e G. ardeae (pássaros), G. microti (ratos de pradaria) e G. duodenalis que infecta mamíferos (SMITH et al., 2007). Atualmente, existem sete genótipos bem definidos para G. duodenalis, que são designados de A a G. Os genótipos A e B têm especificidade mais ampla, sendo encontrados infectando humanos e vários outros mamíferos, como cães,

7 gatos, bovinos e animais selvagens (CACCIÒ et al., 2005). Os genótipos C e D podem ser encontrados infectando cães e coiotes, o genótipo E infecta alpacas, bovinos, caprinos, suínos e ovinos, e os genótipos F e G infectam gatos e ratos, respectivamente (SMITH et al., 2007). A detecção de Giardia nas fezes é geralmente realizada por métodos simples de flutuação em solução de sulfato de zinco, nos quais podem ser visualizados cistos e trofozoítos, porém o diagnóstico é apenas morfológico, não identificando que genótipo está presente (MUNDIM et al., 2007). Em estudos de caracterização genética, apenas os genótipos A e B de G. duodenalis foram associados a infecções humanas, e alguns estudos demonstraram a presença destes genótipos também parasitando cães. Contudo, em uma tentativa para maximizar a detecção de ocorrência de transmissão cruzada e sua detecção, estes estudos foram realizados em comunidades onde havia aglomeração de pessoas e cães domesticados ou de rua, baixas condições socioeconômicas, baixos níveis de saneamento e de más práticas de higiene (O HANDLEY et al., 2000; APPELBEE et al., 2003; THOMPSON & MONIS, 2004, XIAO & FAYER, 2008). Não há dúvida de que existe um potencial de transmissão zoonótica, mas a sua prevalência não é conhecida e há uma urgente necessidade de estudos epidemiológicos moleculares em focos endêmicos, onde a freqüência de transmissão zoonótica de Giardia possa ser determinada. Para isso, dados de prevalência e de transmissão cruzada são necessários para cada genótipo (MONIS et al., 2003). Assim sendo, o risco de infecção zoonótica por Cryptosporidium e Giardia somente pode ser determinado com melhores informações a respeito da prevalência da espécie envolvida em cada caso estudado. A correta identificação dos oocistos presentes nas fezes de cães é importante para determinar qual parasito está presente, uma vez que são morfologicamente semelhantes. No entanto, são poucos os estudos que relatam a excreção de oocistos (SLAPETA et al., 2002, SREEKUMAR et al., 2004, SCHARES et al, 2005), não só de N. caninum, mas também de outros coccídios, como H. heydorni, T. gondii e H. hammondi estes dois últimos podendo ser mecanicamente transmitidos por cães (SCHARES et al., 2005). Dessa maneira,

8 técnicas moleculares com base na reação de PCR e no seqüenciamento de DNA, podem ajudar a identificar as espécies presentes (SLAPETA et al., 2002). 1.2 Diagnóstico de N. caninum em cães O diagnóstico da infecção por N. caninum em cães se baseia principalmente em ensaios sorológicos e é utilizado como um instrumento importante para a investigação clínica e soroepidemiológica. No entanto, o critério utilizado nas amostras de soros para que sejam considerados positivos é variável, dependendo tanto do investigador quanto das técnicas empregadas (LASRI et al., 2004). Para a detecção de anticorpos específicos para N. caninum, várias técnicas foram realizadas, sendo as mais freqüentes a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o ELISA. Esses testes mostram alto grau de sensibilidade e especificidade em infecções naturais e experimentais, porém, vários fatores, como a qualidade do antígeno ou conjugado utilizado nos diferentes testes, podem resultar em uma pobre concordância ou em discrepâncias, quando é realizada a comparação entre as técnicas (ROMAND et al., 1998). O ponto de corte de 1:50 na RIFI foi recomendado para o diagnóstico sorológico em cães (BJORKMAN E UGGLA, 1999, AZEVEDO et al., 2005; ANDREOTTI et al., 2006), porém distintos pontos de corte são considerados positivos em diferentes provas, com títulos de RIFI variando de 1:16 a 1:100 (LASRI et al., 2004, PINHEIRO et al., 2005, CAPELLI et al., 2006, SILVA et al., 2007) e os títulos de ELISA variando desde 1:50 a 1:100 (LASRI et al., 2004, PINHEIRO et al., 2005, SILVA et al., 2007). A RIFI tem sido considerada a prova mais específica, apesar de sua sensibilidade e especificidade mudarem de acordo com os pontos de corte determinados, sendo bastante complicado fazer comparações apropriadas de prevalência de anticorpos anti-n. caninum em cães entre os diferentes estudos (BJORKMAN & UGGLA, 1999). SILVA et al. (2007) também indicaram que o ponto de corte de 1:50 na RIFI é o mais apropriado para a sorologia de N. caninum em cães. Entretanto, sugerem que os antígenos de N. caninum imunodominantes, especialmente os de

9 17 e 29-32 kda devem ser utilizados como marcadores selecionados com o fim de desenvolver sistemas de diagnóstico sorológico da infecção por N. caninum em cães. Além disso, a ampla variação nos pontos de cortes utilizados para a RIFI nos diferentes estudos poderia influenciar o desempenho do ELISA, quando comparadas as duas técnicas. Por isso, os resultados de ELISA devem ser interpretados com cuidado, utilizando-se provas adicionais ou complementares, como o Western Blot, a fim de esclarecer a discordância encontrada entre os resultados de RIFI e ELISA. DUBEY & LINDSAY, (1996) ainda sugeriram a utilização de proteínas específicas purificadas como antígeno para melhorar a especificidade do ELISA. Na neosporose canina, o primeiro ELISA desenvolvido foi um iscom ELISA (BJORKMAN et al., 1994), com uma alta concordância com a RIFI como prova de referência, apresentando 98% de sensibilidade e 96% de especificidade. Desde então, vários ELISA utilizando antígenos solúveis de taquizoítos foram desenvolvidos e provados para a sorologia de N. caninum em cães (LASRI et al., 2004, PINHEIRO et al., 2005, CAPELLI et al., 2006; SILVA et al., 2007), porém, nenhum desses protocolos apresentou boa sensibilidade e especificidade, tampouco apresentaram boa concordância com a RIFI, e em alguns casos, não foram indicados para estudos soroepidemiológicos (CAPELLI et al., 2006). Até o momento, não há dados conclusivos que possam demonstrar que títulos realmente deveriam ser considerados positivos para N. caninum entre as diversas técnicas, principalmente porque os títulos encontrados em praticamente todos os estudos de prevalência são geralmente baixos em cães, diferente dos encontrados em bovinos. Além disso, títulos baixos de anticorpos anti-n. caninum podem ser interpretados como uma reação cruzada entre parasitos relacionados, particularmente T. gondii, que compartilham antígenos comuns de taquizoítos e bradizoítos (BJERKAS et al., 1994, McALLISTER et al.,1996). Semelhanças antigênicas entre N. caninum e T. gondii foram demonstradas por DUBEY & LINDSAY (1996), e este risco de reação cruzada pode complicar a interpretação das provas sorológicas de diagnóstico, principalmente porque os cães apresentam alta soroprevalência de T. gondii, geralmente mais elevada que de N. caninum (MINEO et al., 2001; CAÑON- FRANCO et al., 2004; ASLANTAS et al., 2005; AZEVEDO et al., 2005; DUBEY et

10 al., 2007c). Já a presença de H. heydorni é difícil de ser verificada, devido à falta de uma adequada técnica sorológica (REICHEL et al., 2007). Na prova de RIFI, onde se detectam anticorpos contra antígenos de superfície de taquizoítos, reações cruzadas entre N. caninum e T. gondii não foram observadas (TREES et al, 1994; BUXTON et al., 1997). A reação cruzada entre estes parasitos é mais evidente quando se usa extrato solúvel de taquizoítos como antígeno, tal como o preparado para a técnica de ELISA (DUBEY & LINDSAY, 1996), pois pode incluir antígenos somáticos liberados na destruição do taquizoíto (PARÉ et al., 1995; DUBEY et al., 1996), os quais parecem mais propensos a ocasionar uma reação cruzada. LIAO et al. (2005) identificaram e caracterizaram anticorpos monoclonais anti-n. caninum considerados também responsáveis por reação cruzada entre os dois parasitos, que consistiam em proteínas situadas na sua superficie (de massas moleculares de 28 a 76 kda), nas organelas interiores (massas moleculares de 35, 50 e 64 kda) e apicais (massa molecular desconhecida). Análises proteômicas na imunotransferência da eletroforese bidimensional (2-DE), utilizando anti-soro de coelho contra N. caninum, identificaram uma série de proteínas homólogas entre taquizoítos de N. caninum e T.gondii, que vão de 41 a 76 kda (LEE et al., 2005). McALLISTER et al. (1996) demonstraram que um antígeno recombinante específico de bradizoíto (BAG5) de T. gondii também apresentou semelhanças antigênicas com bradizoítos de N. caninum. Entretanto, segundo DUBEY & LINDSAY (1996), ainda que N. caninum e T. gondii possuam vários antígenos em comum, eles não compartilham seus antígenos imunodominantes. Em casos de infecções recentes ou crônicas com formação de cistos, a sorologia pode ser negativa, mesmo quando o parasito está presente no hospedeiro. Portanto, métodos de diagnóstico diretos podem ser utilizados, como a imunoistoquímica ou a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (DUBEY & SCHARES, 2006), sendo esta última mais sensível que a primeira. Porém, alguns estudos de imunoistoquímica também demonstraram existir certo grau de reação cruzada entre cistos de T. gondii e N. caninum (DUBEY et al., 1990; RUEHLMANN et al., 1995).

11 Cultivos celulares e inoculação em animais de laboratório também podem ser usados para recuperar N. caninum de tecidos de animais (DUBEY et al., 1988b). O sucesso do isolamento depende do número de organismos presentes e o estágio de autólise do tecido. 1.3 Objetivos Com base nas informações expostas, este trabalho teve como objetivos principais: realizar a identificação dos protozoários encontrados em fezes de cães, por técnicas morfológicas, de PCR e seqüenciamento, observar a ocorrência de DNA de N. caninum, T. gondii e H. heydorni em cérebros de cães, padronizar técnicas sorológicas de rotina para pesquisa de anticorpos de N. caninum, avaliando a reação cruzada com T. gondii, e desenvolver novas técnicas com a utilização de proteínas recombinantes para o diagnóstico sorológico de N. caninum em cães. Referências 1. ABE, N., SAWANO, Y., YAMADA, K., KIMATA, I., ISEKI, M. Cryptosporidium infection in dogs in Osaka, Japan. Veterinary Parasitology. v. 108, p. 185 193, 2002. 2. AGUIAR, D.M.; CAVALCANTE, G.T.; RODRIGUES, A.A.R.; LABRUNA, M.B.; CAMARGO, L.M.A.; CAMARGO, E.P.; GENNARI, S.M. Prevalence of anti- Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon, Brazil, in association with some possible risk factors. Veterinary Parasitology. v.142, p. 71-77, 2006. 3. APPELBEE, A. J., FREDERICK, L. M., HEITMAN, T. L., OLSON, M. E. Prevalence and genotyping of Giardia duodenalis from beef calves in Alberta, Canada. Veterinary Parasitology. v. 112, p. 289 294, 2003. 4. ANDREOTTI, R.; PINCKNEY, R.D.; PIRES, P.P.; SILVA, E.A. E. Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the state of Mato Grosso do Sul, center-western region, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. v.13, p.129-131, 2004. 5. ANDREOTTI, R., OLIVEIRA, J.M.; ARAUJO E SILVA,E.; OSHIRO, L.M.; MATOS, M.F.C. Occurrence of Neospora caninum in dogs and its correlation with

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