ASPIRAÇÃO FOLICULAR TRANSVAGINAL SEM ESTÍMULO HORMONAL EM VACAS HOLANDESAS

ARS VETERINARIA, 17(1):11-16, 2001. 11 ASPIRAÇÃO FOLICULAR TRANSVAGINAL SEM ESTÍMULO HORMONAL EM VACAS HOLANDESAS (OVUM PICK-UP (OPU) IN HOLSTEIN COWS WITHOUT GONADOTROPHIC THERAPY) M. M. SENEDA 1, C. R. ESPER 2, J. M. GARCIA 2, R. VANTINI 2 RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade da produção in vitro de embriões a partir da aspiração folicular transvaginal guiada pela ultra-sonografia (AFTGUS), realizada independentemente da fase do ciclo estral e sem uso de terapia gonadotrófica. Foram utilizadas 24 fêmeas da raça Holandesa, variedade preta e branca. Semanalmente, três a quatro animais eram aleatoriamente designados para serem submetidos à AFTGUS. Os oócitos recuperados foram classificados, submetidos a maturação, fecundação e desenvolvimento in vitro até blastocisto. Em 14 semanas foram aspirados 335 folículos e recuperados 212 (63,28%) oócitos. Cada vaca apresentou em média 6,20 folículos, e 3,92 oócitos obtidos. Após o desenvolvimento in vitro conseguiu-se de cada animal 1,11 blastocisto por sessão de AFTGUS. Do total de oócitos recuperados, 155 (73,11%) foram classificados como bons; 30 (14,15%) regulares; 21 (9,90%) desnudos e seis (2,83%) atrésicos. Dos 212 oócitos recuperados, 147 (69,33%) atingiram a clivagem e 60 (40,81%) chegaram a blastocisto. A média semanal de folículos aspirados foi de 23,92, que resultaram em 4,28 blastocistos por semana. Após 54 sessões de aspiração folicular foram obtidos 60 embriões. Os resultados obtidos mostram a viabilidade da AFTGUS realizada aleatoriamente e sem uso de terapias gonadotróficas. PALAVRAS-CHAVE: Aspiração folicular, folículos, embriões, bovinos. SUMMARY The aim of the present work was to study the viability of in vitro embryo production, using OPU without gonadotrophic therapy and independently of estrus cycle phase. Twenty-four black and white Holstein cows were used. Weekly, 3-4 animals were randomly designated for OPU. Recovered oocytes were classified, submitted to maturation, fertilization and culture to the blastocyst stage. After 14 weeks, 335 follicles were aspirated and 212 (63.28%) oocytes were recovered. A mean of 6.20 follicles and 3.92 oocytes was obtained per cow. After in vitro development 1.11 blastocysts from each animal for OPU session was obtained. From total recovered oocytes, 155 (73.11%) were classified as good; 30 (14.15%) regular; 21 (9.90%) denuded; and 6 (2.83%) as atretic. From 212 recovered oocytes, 147 (69.33%) reached the cleavage, which resulted in 60 (40.81%) blastocysts. The weekly average of aspirated follicles was 23.92. This resulted a mean of 4.28 blastocysts per week. After 54 OPU sessions 60 embryos were obtained. These results showed the viability of OPU without gonadotrophic therapies and independently of estrus cycle phase. KEY-WORDS: Ovum pick-up, follicles, embryos, bovine. 1 Prof. Assistente, Departamento de Clínicas Veterinárias, UEL, Londrina-PR mseneda@uel.br 2 Prof. Adjunto, Depto. de Med. Vet. Prev. e Reprodução Animal, FCAV-Unesp, Jaboticabal-SP 3 Prof. Assitente Doutor, Depto. de Med. Vet. Prev. e Reprodução Animal, FCAV-Unesp, Jaboticabal-SP 4 Técnico de laboratório, Depto. de Med. Vet. Prev. e Reprodução Animal, FCAV-Unesp, Jaboticabal-SP Auxílio financeiro: CNPq/Fapesp

12 ARS VETERINARIA, 17(1):11-16, 2001. INTRODUÇÃO Desde sua descrição por PIETERSE & KAPPEN (1988), a aspiração folicular transvaginal guiada pela ultrasonografia (AFTGUS) destacou-se pela promissora perspectiva para produção in vitro de embriões. A técnica mostrou-se simples e sem riscos, viabilizando a recuperação, maturação e fecundação de oócitos imaturos sem qualquer dano ao ovário, podendo ser repetida várias vezes em um mesmo animal (KRUIP et al., 1991; PIETERSE et al., 1991; BOLS et al., 1995; MEINTJES et al., 1995; BOLS et al., 1996). A aplicabilidade da aspiração folicular transvaginal tem sido estudada em várias situações. LOONEY et al. (1994) relataram a possibilidade do uso da técnica para animais jovens, e BROGLIATTI & ADAMS (1996) obtiveram oócitos de bezerras com apenas seis semanas de idade. MEINTJES et al. (1995) constataram que vacas gestantes podiam ser submetidas à AFTGUS durante o primeiro trimestre de gestação, enquanto SAUVÉ (1998) a recomendou até o sexto mês, sem que fosse notado qualquer prejuízo à gestação ou às vacas. LOONEY et al. (1994) e HASLER et al. (1995) destacaram que a aspiração folicular transvaginal era de grande importância para obtenção de produtos de animais inférteis por razões extra-ovarianas. Pelo fato do ciclo estral do bovino apresentar normalmente duas a três ondas de crescimento folicular (BUNGARTZ & NIEMANN, 1994; GINTHER et al., 1996), a recuperação de oócitos via transvaginal revelouse aplicável por mais de uma vez em um mesmo ciclo estral (KRUIP et al., 1991). Mesmo sem tratamento hormonal, oócitos imaturos, colhidos via transvaginal, podem ser usados com sucesso para a produção de embriões in vitro (KRUIP et al., 1991). GIBBONS et al. (1994) demonstraram que a realização da AFTGUS duas vezes por semana, em vez de uma, era mais interessante, pelo maior número de folículos recrutados após cada aspiração. Outro aspecto de interesse foi observado por STUBBINGS & WALTON (1995), ao relatarem um aumento no número de folículos após várias semanas de repetidas aspirações foliculares. Para BUNGARTZ et al. (1995), o uso de gonadotrofinas era desnecessário, embora SAUVÉ (1998) tenha relatado um aumento expressivo no número de folículos disponíveis para a aspiração folicular quando esta era associada ao uso de terapias gonadotróficas. De qualquer forma, a aspiração folicular sem uso de estímulo hormonal pode ser interessante. Inicialmente, porque qualquer terapia gonadotrófica é potencialmente capaz de causar algum tipo de desequilíbrio endócrino (MEINTJES et al., 1995). Além disso, a estimulação hormonal para a aspiração folicular normalmente é associada com monitoração da onda folicular, para lise do folículo dominante (RODRIGUES & GARCIA, 1998). Desta forma, além de possível comprometimento da atividade ovariana, a terapia gonadotrófica exige outras intervenções, como aspiração em dias determinados, ou aspiração do folículo dominante. Essas intervenções, quando em centros de tecnologia de embriões, são facilmente realizáveis simultaneamente entretanto, o mesmo não ocorre em trabalhos de campo, principalmente quando várias propriedades fazem parte do programa. A proposta deste trabalho foi estudar a viabilidade de programas de AFTGUS realizados aleatoriamente, sem que os animais estivessem submetidos a controle do ciclo estral, acompanhamento de ondas foliculares, ou qualquer tipo de estimulação gonadotrófica, uma vez que essas condições nem sempre podem ser satisfatoriamente atendidas no campo. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas 24 fêmeas bovinas da raça Holandesa do rebanho leiteiro da FCAV/Unesp, Campus de Jaboticabal, São Paulo, em condições reprodutivas satisfatórias. Semanalmente, três a quatro animais não gestantes eram aleatoriamente designados para serem submetidos à AFTGUS. Cada animal foi submetido à técnica no mínimo duas e no máximo quatro, num total de 54 sessões de AFTGUS no período de 14 semanas. Foram utilizadas novilhas a partir de 20 meses e vacas até 60 meses de idade. Todos os animais ciclavam regularmente. Os procedimentos ultra-sonográficos foram realizados com um SCANNER 200 VET, (Pie Medical, Holanda) com transdutor de 7,5 MHz acoplado ao dispositivo para aspiração folicular transvaginal. As aspirações foliculares foram realizadas com agulhas hipodérmicas descartáveis 40x10 (19G x 1 ½,Becton Dickinson) e mangueira de silicone com 2 mm de diâmetro interno e 80 cm de comprimento. A pressão de vácuo foi de 65 a 70 mm de Hg, mantida por uma bomba de aspiração (Rocket Medical, Inglaterra). O material recolhido da aspiração era recuperado em tubos cônicos de 45 ml, contendo 30 ml de meio de aspiração, protegidos da luz e mantidos à temperatura média de 30 C. O meio de aspiração era constituído por TCM-199 com 25 mm de tampão HEPES, 5% de soro fetal bovino, 50μg/mL sulfato de gentamicina e 10.000 U.I./L de heparina sódica. Imediatamente após a aspiração, o material recuperado era lavado em filtros para colheita de embriões (Em Con) com solução salina em tampão fosfato (PBS), acrescido de 5% de SFB. Os oócitos recuperados eram classificados, considerando-se bons aqueles com mais de três camadas de células do cumulus oophorus;

ARS VETERINARIA, 17(1):11-16, 2001. 13 regulares, aqueles com pelo menos uma camada de células; desnudos, aqueles oócitos recobertos parcialmente, ou não recobertos pelo cumulus oophorus; e atrésicos aqueles cujos cumulus oophorus apresentavam-se enegrecidos e com sinais de degeneração do citoplasma. Os oócitos passaram por três lavagens em TCM- 199 HEPES, suplementado com 10% de SFB e 50μg de gentamicina; por uma lavagem em TCM 199 com bicarbonato, suplementado com 10% de SFB, 5 μg de LH, 0,5 μg de FSH, 1μg de estradiol, 2.2 μg de piruvato e 50 μg de gentamicina por ml de meio. Os oócitos foram cultivados por 24 horas em microgotas distintas, com 100 μl de meio de maturação, recobertas com óleo mineral, à temperatura de 39ºC e atmosfera de 5% de CO 2 em ar. O sêmen utilizado era proveniente de um único touro da raça Holandesa, com fertilidade conhecida. Duas palhetas contendo sêmen eram descongeladas por 20 segundos em água aquecida a 35 C, depositadas em tubo cônico de 15 ml, contendo um gradiente descontínuo de Percoll de 90 e 45%, e centrifugado a 200g por 30 minutos. O sedimento recuperado era avaliado quanto a volume, concentração e motilidade espermática. A concentração era ajustada para 25x10 6 espermatozóides vivos por ml e cada microgota de fecundação recebia 4μL do sêmen (concentração final de 100x10 3 por microgota). Após maturação, os oócitos eram lavados três vezes em meio de lavagem pré-fecundação (TCM 199 suplementado com 25 mm de HEPES e 0,3% de BSA), e por uma vez no meio de fecundação (TALP-FIV, suplementado com 10 μg/ml de heparina e 160 μl da solução PHE) (BAVISTER, 1989). Imediatamente após esse procedimento os oócitos eram depositados nas microgotas de fecundação contendo os espermatozóides. Após 16-20 horas de cultivo visando a fecundação, os prováveis zigotos tinham as células do cumulus oophorus removidas por movimentos repetidos de pipeta e passavam por três lavagens em meio de préfecundação e uma em meio de desenvolvimento (Menezo B 2 suplementado com 10% de SFB). Após este procedimento, os zigotos foram cultivados em microgotas de 50 μl de meio de desenvolvimento em associação com células de oviduto, na temperatura de 38,5ºC e atmosfera de 5% de CO 2 em ar por 48 a 72 horas, quando se adicionavam 50 μl de meio de desenvolvimento fresco (GORDON, 1994). RESULTADOS Em 14 semanas foram aspirados 335 folículos e recuperados 212 (63,28%) oócitos. Cada vaca apresentava em média 6,20 folículos, sendo a média de oócitos obtidos por vaca igual a 3,92 que resultaram, após o desenvolvimento, em 1,11 blastocisto por animal por sessão de AFTGUS. Do total de oócitos recuperados, 155 (73,11%) foram classificados como bons, 30 (14,15%) regulares, 21 (9,90%) desnudos e seis (2,83%) como atrésicos. Dos 212 oócitos recuperados, 147 (69,33%) atingiram a clivagem. Destes, 60 (40,81%) chegaram ao estádio de blastocisto. A média semanal de folículos aspirados foi de 23,92, que resultaram em 4,28 blastocistos por semana. De um total de 54 sessões de aspiração folicular foram obtidos 60 embriões. Os resultados obtidos encontram-se apresentados na Figura 1 e na Tabela 1. DISCUSSÃO número de oócitos e blastocistos Figura 1 - Número de oócitos, oócitos clivados e blastocistos obtidos de vacas Holandesas submetidas à aspiração folicular transvaginal sem estímulo hormonal durante 14 semanas de experimentação. As vacas foram submetidas à aspiração folicular independentemente da fase de atividade ovariana, e o desenvolvimento in vitro até blastocisto foi verificado com oócitos obtidos durante a fase de emergência e de dominância folicular. Dados da literatura com métodos paralelos mostraram resultados semelhantes. SMITH et al. (1996) concluíram que oócitos obtidos de folículos subordinados não eram afetados pela presença ou ausência do folículo dominante para produção in vitro de embriões, enquanto RHODES et al. (1997) não constataram diferenças quanto à competência para o desenvolvimento entre oócitos obtidos de folículos dominantes ou folículos subordinados. A atresia dos folículos subordinados imposta pelo folículo dominante não foi considerada. Segundo BLONDIN & SIRARD (1995), o número de folículos atrésicos nos ovários era grande, mas os oócitos atrésicos

14 ARS VETERINARIA, 17(1):11-16, 2001. Tabela 1 - Número de folículos aspirados, oócitos obtidos, qualidade dos oócitos, clivagem e blastocistos obtidos de vacas holandesas submetidas à aspiração folicular transvaginal sem estímulo hormonal Semanas Folículos Oócitos Qualidade dos oócitos C livagem blastocistos aspiração aspirados obtidos Bons Regulares Desnudos Atrésicos 1 23 9 6 2 0 1 4 3 2 37 9 6 2 0 1 6 3 3 37 9 6 2 0 1 6 2 4 29 19 13 0 6 0 13 4 5 18 11 3 8 0 0 9 2 6 15 8 4 4 0 0 6 2 7 25 16 10 0 5 1 9 2 8 18 15 9 2 3 1 11 2 9 17 13 9 4 0 0 9 2 10 23 21 19 0 2 0 15 10 11 18 13 10 0 3 0 10 7 12 39 37 34 1 1 1 30 11 13 13 11 11 0 0 0 9 3 14 23 21 15 5 1 0 10 7 Total 335 212 155 30 21 6 147 60 Percentual 63,28 73,11 14,15 9,9 2,83 69,33 40,81 representavam a menor porcentagem de oócitos desse trabalho. A aparente incoerência foi justificada por BLONDIN & SIRARD (1995) ao relatarem que a atresia do folículo não correspondia necessariamente à atresia do oócito. De acordo com esses autores, a competência do oócito era adquirida tardiamente quanto à fase de desenvolvimento folicular. Além disso, a fragilidade da parede dos folículos atrésicos reduzia a recuperação de seus oócitos pelas perdas verificadas durante a manipulação dos ovários. Talvez essas observações possam explicar a pequena recuperação de oócitos atrésicos aqui relatada. Mesmo que fosse admitida a influência negativa do folículo dominante sobre os oócitos dos folículos subordinados, possivelmente isso teria sido superado, uma vez que PAVLOK et al. (1992) consideraram até 24 horas de cultivo in vitro como suficientes para viabilizar o desenvolvimento de oócitos, independentemente da classificação dos folículos. O número de embriões obtidos por sessão de aspiração foi próximo do obtido na Holanda por BOLS et al. (1998), com procedimento semelhante. Verificaram-se variações individuais entre alguns animais, como ilustrado na Figura 1, especialmente na décima segunda semana, quando um animal apresentou um número expressivo de folículos. A variação entre animais também foi relatada por WATANABE et al. (1998), quando mencionaram que, além do fator genético, a fase de emergência de uma nova onda folicular poderia também estar relacionada com essas variações. O fato de não ter sido utilizado estímulo gonadotrófico compreende outras vantagens além da redução de custos. Presume-se que o equilíbrio endócrino das vacas tenha sido pouco afetado durante o experimento, e isso poderia aumentar o período de obtenção de embriões desses animais. Além de não ter sido utilizado estímulo gonadotrófico, a obtenção de embriões foi possível sem aplicação de drogas para sincronização do estro, ou aspiração do folículo dominante. O manejo dos animais restringiu-se à aspiração folicular, e a produção de embriões foi possível com menor dispêndio de tempo e redução de procedimentos. Concluindo, os resultados mostraram a viabilidade da AFTGUS realizada aleatoriamente, sem estímulo hormonal ou controle da fase reprodutiva. Para

ARS VETERINARIA, 17(1):11-16, 2001. 15 situações em que não seja possível o controle rigoroso da fase do ciclo estral, ou em que não haja indicação para a terapia hormonal, a AFTGUS poderia ser recomendada com boas perspectivas para obtenção de embriões de animais geneticamente superiores. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAVISTER, B.D. A consistently successful procedure for in vitro fertilization of golden hamster eggs. Gamete Research, v. 23, p. 139-58, 1989. BLONDIN, P., SIRARD, M.A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development, v.41, p. 54-62, 1995. BOLS, P.E.J., VANDENHEEDE, J.M.M., VAN SOOM, de KRUIF, A. Transvaginal ovum pick-up (OPU) in the cow: new disposable needle guindance system. Theriogenology, v. 43, p. 677-87, 1995. BOLS, P.E.J., VAN SOOM, A., YSEBAERT, M.T., VANDENHEEDE, J.M.M., de KRUIF, A. Effects of aspiration vacuum and needle diameter on cumulus oocyte complex morphology and developmental capacity of bovine oocytes. Theriogenology, v. 45, p. 1.001-14, 1996. BOLS, P.E.J., YSEBAERT, M.T., LEIN, A., CORYN, M., VAN SOOM, A., de KRUIF, A. Effects of long term treatment with bovine somatotropin on follicular dynamics and subsequent oocyte and blastocyst yield in an OPU-IVF program. Theriogenology, v.49, p.983-95, 1998. BROGLIATTI, G. M., ADAMS, G. P. Ultrasound-guided transvaginal oocyte collection in prepurbetal calves. Theriogenology, v.45, p. 1.163-76, 1996. BUNGARTZ, L., NIEMANN, H. Assessment of the presence of a dominant follicle and selection of dairy cows suitable for superovulation by a single ultrasound examination. Journal of Reproduction and Fertility, v. 101, p. 583-91, 1994. BUNGARTZ, L., LUCAS-HAHN, A., RATH, D., NIEMANN, H. Collection of oocytes from cattle via follicular aspiration aided by ultrasound with or without gonadotropin pretreatment and in different reproductive stages. Theriogenology, v. 43, n. 667-75, 1995. GIBBONS, J.R., BEAL, W.E., KRISHER, R.L., FABER, E.G., PEARSON, R.E., GWAZDAUSKAS, F.C. Effects of once- versus twice-weekly transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery and embryo development. Theriogenology, v.42, p.405-19, 1994. GINTHER, O.J., WILTBANK, M.C., FRICKE, P.M., GIBBONS, J.R., KOT, T. Selection of the dominant follicle in cattle. Biology of Reproduction, v. 55, p. 1.187-94, 1996. GORDON, I. Laboratory production of cattle embryos. Cambridge: University, 1994. 639p. HASLER, J.F., HENDERSON, W.B., HURTGEN, P.J., JIN, Z.Q., McCAULEY, A.D., MOWER, S.A., NEELY, B., SHUEY, L.S., STOKES, J.E., TRIMMER, S.A. Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results. Theriogenology, v.43, p. 141-52, 1995. KRUIP, T.A., PIETERSE, M.C., VAN BENEDEN, T.H., VOS, P.L.A.M., YURTH, Y.A., TAVERNE, M.A.M. A new method for bovine embryo production: a potential alternative to superovulation. Veterinary Record, v. 128, p. 208-10, 1991. LOONEY, C.R., LINDSEY, B.R., GONSETH, C.L., JOHNSON, D.L. Commercial aspects of oocyte retrieval and in vitro fertilization (IVF) for embryo production in problem cows. Theriogenology, v. 41, p. 67-72, 1994. MEINTJES, M., BELLOW, M.S., BROUSSARD, J.R., PAUL, J.B., GODKE, R.A. Transvaginal aspiration of oocytes from hormone-treated pregnant beef cows for in vitro fertilization. Journal of Animal Science, v. 73, p. 967-74, 1995. PAVLOK, A., LUCAS-HAHN, A., NIEMANN, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development, v.31, p. 63-7, 1992. PIETERSE, M.C., KAPPEN, K.A. Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries. Theriogenology, v. 30, n. 04, p. 751-62, 1988. PIETERSE, M.C., VOS, P.L.A.M., KRUIP, T.A.M., WURTH, Y.A., VAN BENEDEN, T.H., WILLEMSE, A.H., TAVERNE, M.A.M. Transvaginal ultrasound guided follicular aspiration of bovine oocytes. Theriogenology, v. 35, n. 01, p. 19-24, 1991. RHODES, F.M., PETERSON, A.J., JOLLY, P.D., McMILLAN, W.H., DONNINSON, M., LEDGARD, A., PARTON, G., HALL, D.R. Bovine ovarian follicle and oocyte characteristics after emergence of the first follicular wave. Theriogenology, v. 47, n. 01, p. 149, 1997. (Abstract). RODRIGUES, C.F.M., GARCIA, J.M. The aplication of ultrasound guided follicular aspiration in cattle. Arquivos Faculdade Veterinária, UFRGS, v. 26, n. 1, p. 156-9, 1998 (Supl.). SAUVÉ, R. Ultrasound guided follicular aspiration and in vitro fertilization. Arquivos Faculdade Veterinária, UFRGS, v. 26, n. 1, p. 141-55, 1998 (Supl.). SMITH, L.C., OLIVEIRA-ANGEL, M., GROOME, N.P.,

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