Biotecnologia Vegetal

Biotecnologia Vegetal BIOTECNOLOGIA VEGETAL I Universidade de Évora Prof. Amely Zavattieri 2002

Micropropagação!Introdução!Multiplicação conforme!etapas!automatização!dupla fase!robotização!bioreactores

A Micropropagation é a propagação fiel de um genótipo seleccionado por meio das técnicas da cultura in vitro. Geralmente a micropropagação é também associada com a produção em grande escala a preços competitivos. O Prof. Murashige (Univ. de California, Riverside) definiu 3 fases principais na multiplicação in vitro de plantas, tanto para os laboratórios comerciais como para os de investigação. Estas fases descrevem passos a seguir no processo, como assim também momentos na cultura nos quais as necessidades do ambiente da cultura devem ser modificados. A figura seguinte representa um esquema das diferentes fases do processo de micropropagação como proposto por Deberg e Maene (1981). in vivo Fase 0: preparação da planta mãe in vitro Fase 1: Iniciação asséptica Fase 2: multiplicação Fase 3a: Alongamento Fase 3b: Indução radicular e preaclimatação in vivo Fase 4: aclimatação

Teoricamente as plantas que não são quimereas podem ser propagadas usando diferentes técnicas: rebentos axilares; rebentos adventícios; embriogénese,... Para efeitos da micropropagação a técnica de multiplicação via rebentos axilares é a preferida para a maioria das plantas. Isto em princípio produz plantas conformes. É a única técnica que pode ser aplicada á propagação de quimeras. Com o aumento do número de subculturas o meio que originalmente tinha sido preparado para dar rebentos axilares pode ser mudado para a produção de rebentos adventícios. Como consequência o número de variação somaclonal se incrementa. Rebentos axilares obtidos de uma Dracaena (quimera). Desenvolvimento de gomos adventícios em Dracaena (quimera).

Fases da Micropropagação "Fase 0 "Fase 1 "Fase 2 "Fase 3 "Fase 4

Fase 0. Preparação das plantas mãe 1. Plantas saudáveis 2. Evitar rega excessiva das plantas mães 3. Induzir crescimento vigoroso nas plantas mães

Fase 0. Foi originalmente concebido para melhorar as condições higiénicas das plantas mãe.. Prévio ao inicio da cultura deverá prestar-se uma atenção especial da planta da qual serão retirado/s o/s explants. As plantas mães poderão ser previamente tratadas com hormonas, desinfectantes, fazer testes de viroses, etc. todo em vista ao êxito da cultura in vitro. A desinfecção do material vegetal é essencial nesta fase. O crescimento, a morfogénese e as taxas de crescimento e propagação da cultura dependerão do tratamento prévio da planta mãe.

Fase O Possíveis pre-tatamentos Poda; perda da dominância apical Rega gota -a gota das plantas mães. Soluções forçadas contendo GA3; citocininas; hidroxiquinoleina Etiolamento Injecção de citocininas Enxertia em cascada

Fase1: Estabelecimento da cultura 1. Selecção do explant 2. Desinfecção superficial 3. Meio de cultura 4. Acastanhamento do meio 5. Consistência do meio 6. Condições ambientais Condições ambientais a considerar Temperatura 1. Afecta o crescimento das culturas 2. Efeito sobre a morfogénese Humidade relativa Luz 1. Qualidade 2. Quantidade 3. Efeito sobre a morfogénese

Fase 1 Estabelecimento da cultura Objectivos #Dar início á cultura #Em princípio o método usado deve ser reproduzível Deve existir um compromisso entre uma adequada desinfecção do material vegetal e uma boa taxa de sobrevivência dos explants não contaminados. Procedimento Frequentemente para o início da cultura são usados gomos axilares ou meristemas. Em certos casos são usados outras partes da planta. Ex. Sendo difícil obter gomos axilares não contaminados em Ficus lyrata e Anthurium spp. Gomos adventícios são primeiramente obtidos sobre folhas, os rebentos assim obtidos são então seccionados para ser os explants iniciais da fase 2. É recomendável não iniciar a propagação durante a fase de iniciação. Exemplo: início da cultura em Roseira

Exemplo: Fase de iniciação em roseiras Plantas mãe com rega gota -a gota São retirados ramos jovens. Cortar os ápices e as bases dos ramos São retiradas as folhas ficando os pecíolos nas secções cortadas. Lavar com 80% etanol, desinfectar em lexivia comercial 10% (NaOCl) por 15 minutos Lavar 3x com água estéril Cortar os extremos o mais próximo possível do nó. Entre nós cortados. Cada nó contêm um meristema axilar. Colocação de um nó em um tubo de ensaio. Transladar os tubos para a sala de cultura

Fase 2. Multiplicação O objectivo desta fase é a multiplicação propriamente dita dos órgãos e estruturas que são capazes de dar origem a plantas completas. De acordo com os métodos de propagação que sejam empregues estas estruturas poderão ser: rebentos axilares ou adventícios, embriões o órgãos em miniatura como microtubérculos, cormos, etc. Em alguns programas de micropropagação este estado inclui uma indução prévia de centros ou zonas meristemáticas a partir da qual se desenvolverão os órgãos adventícios. Os rebentos produzidos na fase 2 são considerados como propágulos pois podem ser propagados ou multiplicados para aumentar o seu número em sucessivas subculturas. 1. Produção de rebentos adventícios 2. Produção de rebentos axilares 3. Embriogénese somática

Multiplicação Vegetativa por Gomos (rebentos) Adventícios. E- O calo primário pode ser subcultivado em meio sólido para crescimento do calo A- O explant é constituído de um fragmento de órgão, de uma porção de tecido ou mesmo de células isoladas (grãos de pólen, protoplastos, etc. B- Os rebentos são neoformados (formados de novo) a partir de células do explant inicial. C- Estes rebentos desenvolvem-se em caules, geralmente sobre um meio de alongamento D- As células do explant inicial dividem-se rapidamente e formam, de maneira desorganizada, um calo primário ligado ao explant de partida F- O calo forma rebentos sob um meio de indução apropriado G- Todos os ramos obtidos são transferidos para um meio neutro ou enriquecido em auxinas que provocam o posterior enraizamento. A conformidade do material das plantas obtidas por este método, não pode ser garantida.

Multiplicação Vegetativa por gomos (rebentos) Axilares. A- O explant pode conter um meristema isolado, um gomo terminal ou axilar, uma extremidade de um ramo, um fragmento de ramo que possua pelo menos 1 gomo axilar B- Num meio com citocininas o meristema cresce, o gomo desenvolve-se em um ramo folhoso C- Este ramo pode ser cortado em fragmentos (nós que permanecem sobre o mesmo meio dando novos ramos folhosos D- Se o explant inicial é depositado num meio rico em citocininas, os gomos desenvolvem-se dando um ramo folhoso que se ramifica ele próprio dando ramos secundários e posteriormente terciários, e assim sucessivamente E- Os tufos de rebentos são fragmentados e a multiplicação realiza-se nesta fase F- Os rebentos são transferidos para meio de alongamento para preparar os mesmos para a fase de enraizamento G- Os ramos podem ser agora transferidos par um meio neutro (S/hormonas) ou com auxinas para enraizarem. A taxa de multiplicação pode variar entre 2 a mais de 20 por mês.

Fase 2 Multiplicação Taxa de Multiplicação A Fig. 1. Teoricamente o numero de plantas que podem ser produzidas em 1 ano quando a taxa de multiplicação é de 2 (A) ou 4 (B) por mes. B Para a maioria dos sistemas de micropropagação os sistemas de ramificação axilar são os mais favoráveis. Em outros sistemas mais avançados podem ser usados embriões, gomos adventícios, nós, conjuntos meristemáticos.

Multiplicação porembrigénese Somática. A embriogénese somática aparece a maior parte das vezes em suspensões celulares, ocasionalmente sobre calos, e mais raramente directamente sobre órgãos A- O explant de partida pode ser um fragmento de órgão, de tecido, ou células isoladas. B- Forma-se um calo primário (em órgãos) ou um micro calo (em células isoladas). C- Subcultura de calo primário ou de microcalos D- O calo pode dissociar-se e multiplicar-se sob a forma de suspensão celular E- Em certas condições, as culturas celulares em meio líquido ou sólido organizam-se em pequenos maciços de estruturas bipolares chamados embrióides, ou embriões somáticos F- Os embriões somáticos se desenvolvem directamente em plântulas com raiz como as derivadas de uma semente.

Exemplo: multiplicação de roseiras.

Fase 3 Enraizamento Fase 3: Enraizamento Os rebentos ou plântulas derivadas da fase 2, são muito pequenas e incompletas, não sendo possível a sua transferência directa para o solo ou outro substrato, pelo que nesta fase, são seguidos certos procedimentos para que estas pequenas plantas desenvolvam a sua capacidade fotossintética e sejam capazes de sobreviver em condições naturais sem a adição artificial de carbohidratos. B É recomendável dividir esta fase em fase de alongamento (3a) e fase de indução radicular e pre-aclimatação (3b).

Enraizamento (cont( cont.) Fase 3a: alongamento Em certos casos o alongamento dos caules é um pre-requisimo para a fase de enraizamento $Os meios de cultura desta fase geralmente não contêm citicininas como as usadas na fase 2 $Nesta fase pode ser necessário adicionar carvão activado para neutralizar os efeitos das citicininas da fase 2 $Dependendo do tipo de planta, o alongamento pode pode ser feito em caules singulares ou em caules agrupados (roseta). Fase 3b: indução radicular e pre-aclimatação Frequentemente são as auxinas os reguladores de crescimentos usados para induzir enraizamento. No entanto, há que ter em conta que as auxinas inibem o posterior crescimento das raízes. Melhor enraizamento é geralmente obtido em meios com baixa concentração de sais (ex. Knop 1/2). $As raízes que se desenvolvem em condições in vitro, não são frequentemente aptas para as condições de estufa e podem ocasionar problemas no momento do transplante (stress hídrico). $A indução pode ser feita em caules simples ou em caules em rosetas $Para além do enraizamento esta fase deve favorecer a aclimatação posterior das plantas. Para isto pode-se: favorecer as condições autotróficas; suplementar as plantas com carbohidratos, diminuir a humidade relativa dos recipientes da cultura, micorrização, utilização de substratos inertes (e.g. rockwool, tacos de celulose, espuma de poliuretano.

Fase 4 Aclimatação Fase 4: Aclimatação Factores ambientais Humidade relativa Luz Enfermidades patogénicas Factores da Planta Morfologia estomática Funcionamento estomático Dormência Formação da cera epi-cuticular Capacidade fotossintética

Fase 4: aclimatação (cont.) O objectivo desta fase é a de optimizar a transferência das plantas da condição in vitro as condições de campo ou de estufa. A maior preocupação deverá ser a de minimizar as perdas e acelerar os procedimentos. Exemplo: aclimatação em roseiras Ver também: aclimatação

Fases da micropropagação (esquema geral)

Desenvolviment o posterior Rosas em contendor de plástico Enchimento com meio para dupla-fase Técnica da dupla-fase Sistema de dupla fase aplicado á multiplicação in vitro de Cordyline terminalis. Adicionar 20 ml de meio líquido sobre o meio da fase final (sólido) (inicialmente 100 ml), de maneira a evitar as subculturas. Isto reduz os custos do processo. O sistema é usado : Durante a fase 2 para plantas que requerem um longo período de subculturas (e.g. orquídeas, uma subcultura leva aproximadamente 6 meses, meio fresco é adicionado aos 3 meses em cultura); Na fase final para induzir alongamento e/ou enraizamento. Os ingredientes clássicos usados na técnica de dupla fase são: macro nutrientes de Knop ½ concentração; "carvão activado; "açúcares; "auxinas

Efeito do sistema de dupla fase no crescimento in vitro de Cordyline terminalis. Tratamento Peso meio por contenedo r (g) Nº médio de rebentos com > 2.5 cm Peso médio dos rebentos no transplant e (g) Peso médio dos rebentos (g) 4 semanas depois do transplante (g) Fase 2 cultura transferidas para meio fresco no início da Fase 3 23.3 ± 5.5 22.4 ± 5.5 0.139 ± 0.013 0.174 Fase 2 cultura na qual foi adicionado meio fresco na Fase 3 28.0 ± 1.6 51.4 ± 6.9 0.191 ± 0.022 0.269

Vantagens da Micropropagação! As plantas são frequentemente mais uniformes! Pode ser a única forma de as propagar vegetativamente! As plantas tem geralmente um crescimento mas rápido! Maduram mais rápido que as propagadas por sementes! Pode ser usada para produzir linhas parentais para produzir sementes. Para manter as linhas parentais. Para prevenir depressão por consanguinidade

Desvantagens da Micropropagação! A propagação massiva não pode ser aplicada actualmente em todas as espécies vegetais! A regeneração pode não ser possível. Especialmente para árvores lenhosos adultos. Existem mais problemas para obter raízes que rebentos! Podem não ter um crescimento uniforme e em lugar disso ter diferentes taxas de crescimento e maduração in vitro

Aplicações da Micropropagação %1. Propagação clonal %2. Propagação de plantas difíceis de propagar por outra via ou plantas muito valiosas %3. Introdução de novos cultivares %4. Propagação vegetativa de plantas mães ou parentais %5. Eliminação de patogenias %6. Armazenamento de germoplasmas

Alguns exemplos

Robotização A mão de obra representa aproximadamente 70% do custo de uma planta micropropagada. Por este motivo muitos laboratórios de micropropagação estão instalando-se em países onde a mão de obra é mais barata. Uma alternativa é a utilização de robots. Existem no entanto, alguns problemas específicos com a robotização da cultura de tecidos, alguns destes são:!os tecidos vegetais são frágeis!não estão presentes tecidos vegetais idênticos!è necessária uma manipulação asséptica A figura seguinte representa a configuração de um sistema robótico totalmente automatizado para a multiplicação de Chrysanthemum. Neste sistema o braço do robot efectua as operações de corte e transplante.

Bio reactores a pequena escala Bio reactores em grande escala não são favoráveis á micropropagação pois são demasiado caros e representam um sistema com alto risco em perdas de grande número de plantas simultaneamente. Pequenos bio reactores dão maior flexibilidade e permitem um controlo individual dos componentes. São exemplos: Nalgene TM unidades de filtração, o RITA TM (Cirad, Montpellier) e LifeReactor TM da Osmotek. Nalgene TM filter units Lifereactor TM RITA TM