para o manuseio de resistência antirretroviral

Apoio 10080268 out/11 Guia para o manuseio de resistência antirretroviral AUTOR: Ricardo Sobhie Diaz para o manuseio de resistência antirretroviral AUTOR: Ricardo Sobhie Diaz PERMANYER BRASIL PUBLICAÇÕES www.permanyer.com

para o manuseio de resistência antirretroviral AUTOR: Ricardo Sobhie Diaz Professor Associado e Livre Docente da Disciplina de Infectologia Chefe do Laboratório de Retrovirologia, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo Diretor Médico do Laboratório Centro de Genomas, São Paulo, SP COLABORADORAS: Graziela Tescarollo Siemens, São Paulo, SP Maria Cecilia de Araripe Sucupira Laboratório de Retrovirologia, Universidade Federal de São Paulo PERMANYER BRASIL PUBLICAÇÕES www.permanyer.com

2011 Permanyer Brasil Publicações, Ltda. Avenida Eng. Luiz Carlos Berrini, 1461, 4º Andar CEP 04571-011 São Paulo, Brasil. Celular: 55 11 6171-3597 - permanyer.brasil@permanyer.com www.permanyer.com ISBN: 978-84-9926-310-6 Ref.: 808AR111 Reservados todos os direitos. Sem prévio consentimento da editora, não se poderá reperoduzir nem armazenar num suporte recuperável ou transmissível nenhuma parte desta publicação, seja de forma eletrônica, mecânica, fotocopiada, gravada ou por qualquer outro método. Todos os comentários e opiniões publicados são da responsabilidade exclusiva dos seus autores.

Abreviaturas 3TC lamivudina ABC abacavir APV amprenavir ARV antirretroviral ATC apricitabina ATV atazanavir BCO cut off biológico CCO1 CCO inferior CCO2 CCO superior CCO cut off clínico CRF formas recombinantes circulantes CV carga viral d4t estavudina DRV darunavir DTG dolutegravir EFV efavirenz ES específico ETR etravirina EVT elvitegravir FAPV fosamprenavir FC fold-change HAART terapêutica antirretroviral altamente efetiva HIV vírus da imunodeficiência humana IC concentração inibitória utilizada em testes de fenotipagem IDV indinavir IP inibidor de protease IP/r inibidores de protease com incremento do ritonavir ITR inibidores da transcriptase reversa ITRN inibidor da transcriptase reversa análogo de nucleosídeos ITRNN inibidor da transcriptase reversa não análogo de nucleosídeos ITT análise por intenção de tratamento LC limite de confiança LIPA teste de hibridização usando sondas dispostas em linha LPV lopinavir MDR resistência a múltiplos fármacos Guía para o manuseio de resistência antirretroviral 3

ml mililitro MRG médico referência em genotipagem MVC maraviroc NAN mutações associadas aos nucleosídeos ND não disponível NFV nelfinavir NVP nevirapina PCR reação em cadeia pela polimerase PRAM mutações associadas aos IPs PR protease PS pirosequenciamento qpcr PCR em tempo real RAL raltegravir RENAGENO Rede Nacional de Genotipagem RNA ácido ribonucleico RTV ritonavir SD desvio padrão SPL sequenciamento por ligação SQV saquinavir T-20 enfuvirtida TAM mutações dos análogos a timidina (ZDV e d4t) TDF tenofovir TDR resistência transmitida TER códon de terminação TPV tipranavir TR transcriptase reversa URF formas recombinantes únicas VPN valor preditivo negativo VPP valor preditivo positivo ZAPS zona de alta pressão seletiva ZDV zidovudina 4

Prefácio da terceira edição Introdução Índice Capítulo 1 10 Conceitos e definições 7 8 Guía para o manuseio de resistência antirretroviral Capítulo 2 21 Aspectos teóricos Capítulo 3 101 Farmacocinética dos ARVs e resistência Capítulo 4 106 Vias mutacionais para seleção de resistência Capítulo 6 109 Potência dos ARVs Capítulo 7 113 Barreira genética para resistência aos ARVs Capítulo 8 123 Relação entre adesão e resistência Capítulo 9 125 Resistência cruzada, resistência a múltiplos fármacos e hipersuscetibilidade aos ARVs 5

Capítulo 10 131 Fitness viral Capítulo 11 137 Atividade residual dos ARVs Capítulo 12 142 Frequência de resistência genotípica na falha terapêutica Capítulo 13 146 Como funcionam os testes para resistência aos ARVs? Capítulo 14 173 Evidências dos benefícios clínicos do uso dos testes genotípicos Capítulo 15 181 Indicações para testes de resistência do HIV-1 aos ARVs Capítulo 16 183 Testes de resistência e subtipos genéticos do HIV-1 Capítulo 17 188 Manipulação do paciente com vírus multirresistente Capítulo 18 192 Genética do hospedeiro e infecção pelo HIV Capítulo 19 196 Considerações práticas e conclusões Tabelas de interesse 199 6

Prefácio da terceira edição Após 30 anos de descoberta da aids e após quinze anos da introdução da terapêutica antirretroviral altamente efetiva (HAART), a resistência aos antirretrovirais (ARVs) continua sendo um problema na prática clínica. Talvez um problema de menor impacto ao que enfrentávamos há alguns anos, mas ainda um problema. Os pacientes que iniciam tratamento ARV hoje tem uma possibilidade menor de desenvolverem falha virológica ao tratamento, e, graças aos IP/r, têm menor possibilidade de desenvolvimento de resistência extensa aos ARVs. Mesmo assim, vírus com elevado grau de resistência estão presentes em pacientes que iniciaram o tratamento há muitos anos, e a transmissão de vírus resistentes e seu impacto na resposta aos medicamentos é reconhecidamente uma realidade. Cabe a todos nós entender um pouco mais da resistência aos ARVs e da interpretação dos testes utilizados para sua detecção. Medicamentos novos têm sido desenvolvidos, bem como novas metodologias para detecção da resistência aos antigos e novos medicamentos. Espero que a versão deste manual ajude no entendimento dos mecanismos de resistência e na interpretação dos testes diagnósticos, bem como repercuta no motivo mais especial de todo o nosso trabalho profissional: o paciente. Guía para o manuseio de resistência antirretroviral The war against infectious diseases has been won* Dr. Willians Stuart, U.S. Surgeon General, 1969 *Frase proferida pelo equivalente ao ministro da saúde norte-americano em comemoração ao desenvolvimento de novos antibióticos. Essa frase provou-se errônea ao longo do tempo. Motivo: emergência de micro-organismos resistentes. 7

Introdução Capítulo 1 O grande avanço no combate à infecção pelo HIV-1 tem sido resultado da inter-relação entre a aquisição de nossos conhecimentos na patogênese da doença, da disponibilização de fármacos ARV potentes e do desenvolvimento e aplicação de testes mais precisos para monitoramento do tratamento. Isso ficou bastante evidente em meados dos anos 90, quando o entendimento da dinâmica de replicação do HIV-1 ocorreu em paralelo e em decorrência da disponibilização dos IPs e de testes que pudessem quantificar de forma precisa o RNA do HIV-1 no plasma dos indivíduos infectados. De forma efetiva, a terapia ARV é capaz de proporcionar a redução da replicação viral a níveis inferiores aos dos limites de detecção dos testes mais sensíveis e, com isso, propiciar uma enorme redução na progressão da doença e na mortalidade. Entretanto, a falha na supressão efetiva da replicação viral pode proporcionar a seleção de variantes do HIV (cepas) mutantes e resistentes a um ou mais medicamentos em uso naquele momento. A resistência aos antimicrobianos é um fenômeno microbiológico já descrito com todos os tipos de tratamentos com antimicrobianos. Toda vez que se expõe algum micro-organismo à pressão seletiva de antimicrobianos, a chance é de que micro-organismos resistentes apareçam. Apesar de serem muitos os fatores que possam contribuir para a falha terapêutica no tratamento específico do HIV-1, a emergência de cepas resistentes aos medicamentos claramente tem papel fundamental em limitar o sucesso virológico em longo prazo desse tratamento. Em tal contexto, estratégias para diminuir a emergência de cepas resistentes aos ARVs e testes de monitoramento de resistência assumiram um papel relevante no manuseio dos pacientes em tratamento. Na verdade, vários estudos retrospectivos e prospectivos têm demonstrado uma enorme correlação entre o número de medicamentos ativos em um esquema terapêutico e a resposta virológica a esse esquema. Em tempo, medicamento ativo é aquele no qual o vírus do paciente seja inteiramente sensível de acordo com o resultado de testes de resistência. Também, alguns estudos prospectivos confirmam que o uso dos testes de resistência no auxílio a decisões terapêuticas auxilia na obtenção de um melhor desempenho na resposta virológica. Embora existam críticas com relação ao desenho de estudos avaliando o desempenho dos testes de resistência, apesar da ausência de seguimento de longo tempo desses estudos e da inexistência de estudos validando a eficácia dos testes de resistência antes do inicio de tratamento (resistência transmitida), o uso de testes de resistência faz sentido biológico, e seu valor é reconhecido pela maioria dos clínicos em todo o planeta. Além 8

disso, testes de resistência têm sido utilizados também em todos os estudos clínicos avaliando o desempenho de ARVs. Por essas razões, os testes de resistência se tornaram populares e são geralmente aceitos como um instrumento de utilidade pela maioria dos clínicos que tratam pacientes infectados pelo HIV. Assim sendo, o objetivo principal deste manual é fornecer aos clínicos e virologistas um guia prático, preciso e atualizado que sirva para o manuseio dos pacientes com resistência aos ARVs e auxilie na interpretação dos testes de resistência. Fundamentalmente poderia servir também para que se entendessem os conceitos e as estratégias relacionados à complexa interação entre os medicamentos, o HIV e o hospedeiro humano. Pelo aspecto dinâmico da aquisição de conhecimento nesta área e pela necessidade constante de atualização de conhecimento e revisão de conceitos, gostaria de manter-me acessível a críticas, correções e sugestões, podendo ser contatado via e-mail (rsdiaz@centrodegenomas.com.br) para discussão sobre o assunto. Alguns termos deste manual foram mantidos na língua inglesa, tendo seu significado explicado, no entendimento de que o sentido poderia ficar comprometido pela tradução, ou simplesmente pelo fato de que esses termos já estão consagrados pelo seu uso. Guía para o manuseio de resistência antirretroviral 9

Conceitos e definições Capítulo 2 Resistência aos medicamentos Diminuição da susceptibilidade do HIV aos medicamentos. Sequenciamento genômico Reação laboratorial que determina a composição genética (sequência de nucleotídeos) de determinado genoma. Nucleotídeo Base nitrogenada que forma o conteúdo genético de um ser vivo. São adenosina (a), citosina (c) timidina (t) e guanosina (g). Mutação Alteração na composição genética do vírus onde existe alteração de nucleotídeos em comparação ao que seria esperado em uma determinada posição do genoma. Mutação neutra Aquela que não causa impacto na capacidade replicativa de um organismo, no caso o HIV (fitness viral, veja definição abaixo). Mutação deletéria Mutações que fazem com que o vírus tenha uma pior capacidade replicativa (diminuição do fitness). Códon Grupos de 3 nucleotídeos que codificam um aminoácido. Mutação principal ou primária Aquela que produz significativa perda de suscetibilidade ao ARV que a selecionou. Normalmente é a primeira mutação que emerge decorrente do uso do ARV em questão. O termo principal é preferível ao primária neste contexto específico. Mutação acessória ou secundária Mutação que emerge normalmente para recuperar o fitness perdido pelo aparecimento da mutação principal. Propicia uma perda modesta de suscetibilidade ao ARV que a selecionou. O termo acessória é preferível ao secundária nesse contexto específico. Vírus do tipo selvagem Cepa viral com constituição genética considerada normal, não apresentando mutações de resistência aos ARVs. Vírus mutante Cepa viral com alterações genéticas distintas das encontradas no vírus do tipo selvagem. Virion Vírus cujo ácido nucleico é o RNA. Essa forma viral é liberada na corrente sanguínea, fruto da replicação viral, e encontra-se livre nos diversos fluidos corporais. É a forma viral quantificada pelos testes de CV e identificada nos testes de genotipagem convencionais. Provírus Vírus cujo ácido nucleico é o DNA. Encontra-se integrado no genoma do hospedeiro no núcleo celular. Quasispecie Variantes virais distintas, porém geneticamente relacionadas, dentro de uma população de vírus que infectam uma pessoa. Essas cepas evoluíram ao longo do tempo a partir de uma cepa viral homogênea que estava presente no inóculo que infectou o indivíduo. Uma pessoa infectada pelo HIV apresenta uma única quasispecie viral, a não ser que essa pessoa tenha se infectado pelo HIV proveniente de mais de 10

uma fonte (indivíduo), o que ocorreria nos casos de infecção dupla (coinfecção ou superinfecção). Polimorfismos virais Mutações genéticas que podem estar presentes nos vírus na ausência de pressão seletiva dos ARVs e podem ser frutos da evolução natural do vírus. Muitas vezes são assinaturas de vírus que caracterizam subtipos diferentes do HIV-1. Genótipo Sequências específicas de nucleotídeos que determinam o perfil genético do HIV-1. Fenótipos Comportamento ou características do vírus. Podem estar relacionados com a capacidade replicativa ou a citopatogenicidade do vírus in vivo ou in vitro (cultura). Resistência cruzada Resistência selecionada por um medicamento que levará a resistência a outro medicamento que ainda não foi utilizado. Hipersuscetibilidade Aumento da sensibilidade de uma cepa viral a um determinado ARV, quando comparado ao vírus do tipo selvagem. Resistência genotípica Presença de mutações genéticas relacionadas à redução de suscetibilidade a um ou mais ARVs. Resistência fenotípica Redução da atividade antirretroviral in vitro, evidenciada pelo aumento da replicação viral na presença do medicamento. Correceptores do HIV São os receptores das quimiocinas utilizados pelo HIV para sua entrada na célula. Esses correceptores são o CCR5, o CXCR4 e o CCR2. O uso de correceptores específicos por uma determinada variante do HIV-1 define o que tem sido chamado de tropismo do HIV. Tropismo do HIV Afinidade específica do vírus pelo CCR5 e pelo CXCR4 no mecanismo de entrada do HIV na célula. CCR5 Receptor de quimiocina (MIP1-α, MIP1-β e RANTES) encontrado na superfície de algumas linhagens celulares. É utilizado como correceptor para a entrada do HIV nas células. CXCR4 Receptor de quimiocina (SDF-1, PBSF) encontrado na superfície de algumas linhagens celulares. É utilizado como correceptor para a entrada do HIV nas células. R5 Variante viral do HIV que utiliza o correceptor CCR5 para entrada na célula. X4 Variante viral do HIV que utiliza o correceptor CXCR4 para entrada na célula. Tropismo duplo Variante viral do HIV capaz de utilizar tanto o correceptor CCR5 quanto o CXCR4 para entrada na célula. DM Presença de variantes virais com tropismo duplo e/ou mistura de variantes virais R5 e X4 na quasispecie viral que infecta um determinado hospedeiro, identificada pelos testes fenotípicos para determinação de tropismo viral. Vírus indutor de sincício Terminologia antiga para definir o que chamamos hoje de variante viral X4. Esses vírus proporcionam o aparecimento de estruturas multinucleadas gigantes em cultura (sincícios), o que tem sido considerado como um sinal de citopatogenicidade viral. No passado, essa cepa viral também era denominada rapid/high pela replicação em grandes quantidades em culturas celulares. Guía para o manuseio de resistência antirretroviral 11

12 Vírus não indutor de sincício Equivale ao que atualmente chamamos de cepas R5. Equivale também às variantes virais denominadas como slow/low pela replicação mais lenta e em menor quantidade em culturas celulares quando comparadas aos vírus X4. Reação em cadeia pela polimerase (PCR) Reação química na qual uma sequência de DNA (genoma) é amplificada (multiplicada) para ser detectada com maior facilidade ou usada como produto para outras reações, como o sequenciamento genômico. Testes de resistência genotípica (genotipagem) Testes laboratoriais que determinam a presença de mutações genéticas no HIV-1 relacionadas à diminuição de suscetibilidade aos diversos medicamentos ARVs. Testes de Resistência fenotípica (fenotipagem) Testes usados para determinar em cultura a suscetibilidade do vírus aos ARVs. Fold change Valor numérico que reflete a perda de suscetibilidade do vírus de um paciente a um determinado ARV em um teste de fenotipagem. Esse valor é produzido em comparação à suscetibilidade do vírus do tipo selvagem, sendo que, quanto mais elevado o fold change, maior a perda de suscetibilidade do vírus do paciente. Cut-off A concentração de medicamento em um teste de fenotipagem abaixo da qual um vírus é considerado suscetível a um ARV e acima da qual o vírus é considerado resistente. Cut-off técnico Baseado na medida de suscetibilidade repetida de uma única cepa viral de referência. Esses cut-offs foram, historicamente, os primeiros a serem utilizados em testes de fenotipagem, sendo, subsequentemente, substituídos pelos cut-offs biológicos e cut-offs clínicos. Cut-off biológico Baseado na variação de susceptibilidade de uma grande quantidade de cepas provenientes de amostras clínicas de diferentes indivíduos virgens de tratamento. Classicamente feitos com vírus do subtipo B. Em um segundo momento, substituíram os cut-offs técnicos nos testes de fenotipagem. Cut-off clínico Baseado na resposta virológica a um ARV em estudos clínicos. Normalmente apresentam valores que refletem uma variação de resposta virológica, como resposta total, parcial ou sem resposta. Estão paulatinamente substituindo os cut-offs biológicos nos testes de fenotipagem. Fenotipagem virtual Teste de genotipagem cujo resultado é submetido a bancos de dados que contêm pares de amostras com testes de geno e fenotipagem. O sistema de informática procura no banco de dados a sequência mais semelhante à sequência genômica do paciente testado. Como cada sequência do banco de dados possui um resultado de fenotipagem equivalente, o resultado de resistência fenotípica do banco de dados é atribuído ao paciente testado. Obtém-se, portanto, o resultado de resistência do vírus do paciente testado no formato de um resultado de fenotipagem. Teste de tropismo Teste laboratorial que define o tropismo do HIV pelos receptores CCR5 ou CXCR4. Teste fundamental para determinar a suscetibilidade aos antagonistas de CCR5. Teste de fenotropismo Teste de fenotipagem que define o tropismo do HIV. Expressa seus resultados determinando a presença de variantes R5

ou X4 ou DM (veja definição acima). Com relação a essa última, o teste é incapaz de determinar se existem misturas de variantes R5 e X4 ou se existe a presença de vírus com tropismo duplo. Teste de genotropismo Teste de genotipagem que define o tropismo do HIV. Expressa seus resultados determinando a presença de variantes R5 ou variantes que utilizam o receptor CXCR4 (não é capaz de discriminar variantes X4 de variantes com tropismo duplo). Resistência primária Resistência aos ARVs, detectada em vírus de pacientes virgens de tratamento antirretroviral. Prefere-se atualmente a terminologia resistência transmitida. Resistência secundária Resistência aos ARVs decorrentes da emergência de vírus resistentes propiciados pela pressão seletiva exercida pelos ARVs. Resistência a múltiplos fármacos (MDR) Mutações que normalmente conferem resistência a todos os medicamentos de uma mesma classe de ARVs. Mutações pontuais Alterações genéticas resultantes de mutações em um único nucleotídeo. Mutações sinônimas ou silenciosas Mutações nucleotídeas que não levam à alteração do aminoácido em um determinado códon. Mutação não sinônima Mutações nucleotídeas que levam à alteração do aminoácido em determinado códon. Inserções Adição de nucleotídeos, geralmente múltiplos de 3, que levam ao acréscimo no número de aminoácidos na sequência viral. Ex.: cccagttagttg cccagttagtacttg (o triplete em destaque representa uma inserção na sequência de nucleotídeos, que não existia na sequência original). Deleções Perda de fragmento genético nucleotídico, geralmente múltiplo de 3, que leva a uma diminuição no número de aminoácidos da sequência. Recombinação Formação de um vírus geneticamente híbrido a partir de dois vírus distintos que infectaram a mesma célula. Vírus recombinantes Vírus híbridos frutos da recombinação que apresentam material genético de dois vírus parentais. Para que surjam vírus recombinantes entre diferentes subtipos, é necessária a infecção dupla (ou mais) por vírus diferentes, por vezes vírus de subtipos diferentes. Vias mutacionais para resistência aos ARVs Grupo de mutações específicas selecionadas por um mesmo medicamento. Um determinado ARV pode selecionar mutações por várias vias mutacionais distintas em pacientes diferentes, sendo que normalmente somente uma via ocorrerá em um mesmo paciente. Fitness Capacidade adaptativa de um vírus em determinado meio ambiente. Um dos aspectos do fitness é sua capacidade replicativa, que se correlaciona indiretamente com a CV. Quanto maior o fitness, maior a capacidade replicativa do vírus e, consequentemente, maior a CV no paciente. Mutações de resistência normalmente produzem uma diminuição da capacidade replicativa dos vírus, levando à perda do fitness e proporcionando o Guía para o manuseio de resistência antirretroviral 13

Tabela 1. Testes de fenotipagem comerciais (c) ou desenvolvidos em laboratórios de pesquisa (d) Antivirogram TM * Vírus recombinantes Virco (c) Phenosense TM Vírus recombinantes Monogram (c) PhenoScript TM Vírus recombinantes Viralliance (c) ESTA TM Vírus recombinantes Monogram (c) Phenosense Entry Assay TM Vírus recombinantes Monogram (c) Phenosense Integrase Assay TM Vírus recombinantes Monogram (c) Cultura vírus recombinantes Vírus recombinantes Desenvolvimento próprio (d) *Disponível atualmente somente para estudos clínicos da indústria farmacêutica. Enhanced Sensitivity Trofile Assay. Teste de fenotropismo de segunda geração que sucedeu o TROFILETM Teste de susceptibilidade fenotípica aos antagonistas de CCR5 e inibidores de fusão aparecimento de um vírus aleijado. As mutações adicionais de resistência podem recuperar o fitness perdido pelo vírus, especialmente se essas mutações ocorrerem na protease (PR) viral. Entretanto, o vírus com melhor fitness na presença de ARVs é o vírus resistente. Barreira genética para resistência aos ARVs Proximidade genética para aquisição de resistência completa aos antirretrovirais. Pode estar relacionada ao número de mutações necessárias para emergência de resistência ou à facilidade na seleção de determinada mutação de resistência. Um medicamento que necessita de várias mutações para resistência apresenta uma grande barreira genética. Se algumas mutações já existirem, haverá, no caso, uma diminuição da barreira genética para a resistência ao ARV em questão. A barreira genética pode também estar relacionada à facilidade com que uma mutação emerge frente a um determinado medicamento. Testes de Resistência Testes de fenotipagem comerciais (c) ou desenvolvidos em laboratórios de pesquisa (d) (Tabela 1). Testes de genotipagem comerciais (c) ou desenvolvidos em laboratórios de pesquisa (d) (Tabela 2). Especificações e detalhes dos testes de fenotipagem comerciais (Tabela 3). Passos laboratoriais do teste de genotipagem 1. Purificação do RNA ou DNA do HIV-1 presente na amostra de sangue do paciente. 2. Transcrição reversa (transformação de RNA viral em cdna; somente nos casos em que o RNA foi purificado). 3. Amplificação da região da transcriptase reversa (TR) e da PR pela metodologia da PCR. 14

Tabela 2. Testes de genotipagem comerciais (c) ou desenvolvidos em laboratórios de pesquisa (d) Nome do teste Metodologia Região amplificada CV mínima Empresa Versant TM HIV (LIPA) Hibridização por sondas PR (1-99) RT (1-335) Viro Seq Sequenciamento DNA PR (1-99) RT (1-325) True GeneHIV Genotyping kit Sequenciamento DNA PR ( 1 ou 10-99) RT (41-247) Virco Gen Sequenciamento DNA PR (1-99) RT (1-400) GeneSeq HIV Sequenciamento DNA PR (1-99) RT (1-305) GeneChip HIV PRT 440 Hibridização por sondas (silica chip-based resequencing method) PR (1-99) RT (1-242) 2.000 Bayer (c) 2.000 Applied Biosystems (c) 1.000 Siemens (c) 1.000 Virco-Tibotec (c) 500 Virologic Inc (c) Não descrito Affymetrix (c) Sequenciamento direto Sequenciamento DNA Variável Variável Desenvolvimento próprio (d) PCR seletivo Mutação pontual Variável Variável Desenvolvimento próprio (d) PCR com detecção por sondas Mutação pontual Variável Variável Desenvolvimento próprio (d) Genotropismo Sequenciamento DNA Variável Variável Desenvolvimento próprio (d) Guía para o manuseio de resistência antirretroviral 15

Tabela 3. Especificações e detalhes dos testes de fenotipagem comerciais Tecnologia Antivirogram PhenoSense PhenoScript Phenosense TM Entry-RUO Phenosense TM Amostra recomendada Plasma em tubo EDTA, sem heparina Mínimo de CV necessário (HIV-1 RNA cópias/ml) Recomendação transporte de amostra Plasma em tubo EDTA ou tubo ppt Plasma Plasma Plasma > 1.000 > 500 > 500 > 500 > 500 Estocar a 80 ºC e transportar em gelo seco Estocar abaixo de 20 ºC e transportar em gelo seco Região do genoma alvo PR/RT/+ fragmento do gag PR/RT/+ fragmento do gag/env Estocar abaixo de 20 ºC e transportar em gelo seco* Estocar abaixo de 20 ºC e transportar em gelo seco Integrase-RUO Estocar abaixo de 20 ºC e transportar em gelo seco gag/pr/rt/env gp160 TR e integrase Tempo para os resultados ~20-24 dias ~14 dias 7-14 dias ~20-24 dias ~20-24 dias Drogas avaliadas ITRNs /ITRNNs /IPs ITRNs /ITRNNs /IPs/ inibidores de fusão ITRNs /ITRNNs /IPs/ inibidores de fusão Inibidores de fusão e antagonistas de CCR5 Inibidores da integrase 16

4. Sequenciamento do genoma do HIV no fragmento amplificado pela PCR. 5. Produção de uma lista de mutações dos códons relacionados com resistência aos ARVs. 6. Interpretação, onde se correlaciona as mutações presentes com a possível diminuição de suscetibilidade de cada um dos medicamentos ou em alguns casos, com associações de medicamentos (ex.: ATV/r, TDF/3TC). Passos laboratoriais do teste de fenotipagem 1. Purificação do RNA HIV-1 presente na amostra de plasma sanguíneo do paciente. Note que amostras de DNA não são possíveis nesse caso. 2. Transcrição reversa (transformação de RNA viral em cdna). 3. Amplificação da região da TR e da PR pela metodologia da PCR. 4. Clonagem do produto de PCR dentro de um plasmídeo bacteriano (plasmídeo, em sua forma circular, carrega o conteúdo genético do HIV em seu interior). 5. Transfecção de células utilizadas para cultura com auxílio de clones infecciosos. Clone infeccioso consiste no fragmento de DNA do HIV-1 com exceção do fragmento da PR e da transcriptase dentro de um plasmídeo bacteriano. O clone infeccioso apresenta o DNA padrão de um HIV de laboratório. A PR e a TR do vírus do paciente virão a partir do plasmídeo bacteriano gerado na etapa (3) acima. Introduzse o clone infeccioso e o fragmento da TR e PR do paciente no interior da célula por metodologia conhecida como eletroporação. 6. Produção em cultura de um vírus recombinante que possui as regiões da PR e da TR do vírus do paciente e o restante do genoma de um vírus de laboratório (clone infeccioso). 7. Cultura do vírus recombinante na presença de cada um dos ARVs. 8. Quantificação da perda de suscetibilidade do vírus testado comparado ao vírus do tipo selvagem. Replicação do vírus na presença do medicamento significa perda de susceptibilidade a este. 9. Interpretação, onde se correlaciona a perda de susceptibilidade in vitro com limitações na atividade dos medicamentos, na dependência do corte (cut-off) definido para cada um dos medicamentos. Guía para o manuseio de resistência antirretroviral Passos laboratoriais do teste de fenotipagem virtual Para maiores detalhes veja Testes de resistência aos antirretrovirais no capítulo Aspectos teóricos. 1. Realização de um teste de genotipagem. 2. Comparação da sequência de nucleotídeos do paciente com sequências referência do tipo selvagem. 17

Tabela 4. Testes de genotipagem convencionais Vantagens Mais simples de serem realizados Mais rápidos (1 a 2 semanas) e baratos Amplamente disponíveis Mais sensíveis; podem detectar mutações emergentes (misturas) antes que elas tenham repercussão fenotípica, o que pode promover um sinal de alerta para o desenvolvimento da resistência Desvantagens Pouca sensibilidade a variantes minoritárias (sensibilidade superior a 25%) Determinação indireta da resistência cuja interpretação requer conhecimento prévio dos determinantes genéticos relacionados à resistência Interações entre diversas mutações ainda não são bem conhecidas Informações disponíveis são limitadas para (i) novos medicamentos, (ii) novas combinações de medicamentos e (iii) subtipos de vírus que não sejam B 3. Determinação do perfil de mutações da genotipagem do vírus do paciente. 4. Procura em banco de dados próprio, sequências com perfil semelhante de mutações às determinadas em (3). 5. Encontradas no banco de dados as genotipagens semelhantes a do paciente testado, o sistema identifica resultados de fenotipagem correlacionados as estas genotipagens (cada resultado de genotipagem do banco de dados tem um resultado de fenotipagem realizado na mesma amostra). 6. Produz laudo de fenotipagem virtual idêntico ao laudo de fenotipagem, apresentando valores de fold change e cut-offs clínicos). Comparação entre os diferentes testes de resistência (Tabelas 4-6) Testes de genotipagem convencionais Tabela 4). Testes de fenotipagem (Tabela 5). Testes de fenotipagem virtual (Tabela 6). Ajuda potencial dos testes de resistência na prática clínica (Tabela 7) 1. Evita trocas desnecessárias de ARVs. 2. Levanta suspeita com relação à falta de adesão (falha virológica com vírus sem mutações). 3. Propicia trocas direcionadas em vez de trocas empíricas de ARVs. 4. Propicia o uso de medicamentos ativos por períodos mais prolongados. 18

Tabela 5. Testes de fenotipagem Vantagens Medida direta da resistência, mensurando a replicação do vírus frente a concentrações diferentes de antirretrovirais Resultado quantitativo, dando um valor para a perda de suscetibilidade aos medicamentos testados (fold chage) Formato mais familiar ao clínico Menor dependência do acúmulo de conhecimento para interpretação, o que tem especial valor para medicamentos novos Praticamente não necessitando de interpretação externa Avalia melhor os efeitos da hipersusceptibilidade proporcionada pela complexa combinação de muitas mutações selecionadas pelos antirretrovirais Desvantagens Cut-offs ainda não estabelecidos para boa parte dos medicamentos, o que é importante para determinação da resistência, especialmente com relação aos cut-offs clínicos Tecnicamente mais complexos Mais caros e demorados (3 a 4 semanas) Necessita de laboratórios muito mais especializados e equipados Tende a subestimar a resistência na vigência de misturas entre vírus resistentes e sensíveis Guía para o manuseio de resistência antirretroviral Tabela 6. Testes de fenotipagem virtual Vantagens Mais simples de serem realizados, pois se trata de um teste de genotipagem Quantifica a perda de suscetibilidade aos fármacos testados Formato mais familiar ao clínico Mais rápidos (1 a 2 semanas) e mais baratos que uma fenotipagem Considera as misturas entre vírus selvagens e resistentes como vírus resistentes Avalia melhor os efeitos da hipersusceptibilidade proporcionada pela complexa combinação de muitas mutações selecionadas pelos antirretrovirais Desvantagens Quantidade limitada de informações a medicamentos novos e subtipos não B Mais caros que uma genotipagem habitual e um pouco mais demorados Também se trata de uma medida indireta da suscetibilidade fenotípica 5. Economiza custos relacionados a trocas de medicamentos. 6. Evita toxicidade desnecessária de medicamentos com pouca ou nenhuma atividade. 7. Fornece uma perspectiva mais realista do desempenho futuro do tratamento, especialmente nos casos de resistência muito extensa. 19

Tabela 7. Considerações importantes para interpretação dos testes Considerações Testes de resistência devem ser realizados com CV detectável Sangue deve ser coletado na vigência do uso da medicação Falha virológica deve ser confirmada por dois testes com intervalo superior a 3 semanas Falha virológica pode ser decorrente de fatores não relacionados à resistência viral A interpretação dos testes pode ser complexa e necessitar da interação entre os clínicos assistentes e os virologistas clínicos Os testes apresentam valor preditivo positivo alto Os testes apresentam valor preditivo negativo baixo Manipulação antirretroviral prévia e resultado de testes anteriores devem ser considerados na interpretação dos padrões de resistência apontados nos testes atuais Observações Alguns laboratórios podem acessar o DNA proviral ao invés de RNA plasmático, possibilitando o teste mesmo com CV indetectável (utilidade potencial na necessidade de troca de medicamentos por toxicidade, p. ex.) As mutações devem persistir até duas semanas após a interrupção, mas algumas mutações como a do códon 184 da TR podem desaparecer rapidamente na ausência de medicação A transativação heteróloga, secundária a infecções transitórias e vacinação, pode aumentar a CV por períodos curtos de tempo sem que haja repercussões relacionadas à falha virológica Outros fatores como adesão ou interações medicamentosas devem ser investigados antes da solicitação do teste. A resistência celular pode também ser a causa da falha Uma vez detectadas as mutações ou uma diminuição da susceptibilidade de um fármaco in vitro, é muito provável que esse não apresente ação desejada in vivo A ausência da detecção da resistência não significa necessariamente que esta não exista Mutações selecionadas no passado podem desaparecer na ausência do medicamento que a selecionou. Essas mutações reemergem rapidamente quando o medicamento é reintroduzido (falsa reversão de mutações na ausência dos fármacos) 20

Aspectos teóricos Capítulo 3 Causas e frequências de falha virológica Frequência da falha virológica A duração de um tratamento antirretroviral está diretamente relacionada a fatores que incluem (i) potência do esquema de tratamento antirretroviral, (ii) tolerabilidade ao mesmo, incluindo níveis de toxicidade e (iii) emergência de cepas virais resistentes do HIV-1. Aparentemente, todos esses fatores melhoraram em anos recentes. Consequentemente, a falha virológica tem sido de menor monta em anos recentes. É interessante observar o modelo brasileiro como visto na figura 1. Analisamos os resultados de 2.483.055 testes de CV, entre os anos de 2001 a 2009, somente de pacientes em tratamento antirretroviral seguidos no sistema público de saúde. A prevalência de CV indetectável na vigência de tratamento aumenta de forma linear de 32% em 2001 a 65% em 2009¹. É demonstrado, portanto, uma nítida diminuição das frequências de falha virológica ao longo do tempo; porém, com frequências ainda altas. Esses resultados também significam que, extrapolados para o dia de hoje e, portanto, considerando cerca de 200.000 pacientes em tratamento, 70.000 pessoas estariam experimentando falha virológica com a possibilidade de presença de vírus resistentes. De fato, quase a totalidade dos pacientes cujas amostras são submetidas à genotipagem pela RENAGENO apresentará algumas mutações principais de resistência aos ARVs². Quero crer, entretanto, que, para quem inicia o tratamento hoje, a resistência não deverá ser um problema sério. O que se espera, em termos virológicos do tratamento antirretroviral iniciado hoje, é que ele seja potencialmente eficaz para sempre. Normalmente a escolha recai na associação de dois ITRN e de um ITRNN. Eventualmente, e principalmente, pode ocorrer resistência relacionada à interrupção mais prolongada dos esquemas contendo dois ITRNs e um ITRNN. Nesses casos, ocorrerá a resistência ao ITRNN e, eventualmente (cerca de metade dos casos com resistência aos ITRNNs), resistência ao 3TC ou FTC pela emergência da mutação M184V 3,4. Nesse caso, o próximo passo será o resgate cujo esquema deve conter IP/r. Como explorado a seguir, espera-se que, nesse caso, mesmo na falha virológica, a classe dos IPs esteja preservada. Na América do Norte, esses benefícios levaram à diminuição dramática no número de pacientes que necessitam de um terceiro resgate ao longo do tempo, como visto na figura 2 5. Entretanto, não devemos negligenciar a existência de um grande número de pacientes que foram submetidos à terapia sequencial e desenvolveram resistência aos ARVs, por vezes resistência muito extensa. Guía para o manuseio de resistência antirretroviral 21

Porcentagem de pacientes com carga viral < 400 cópias/ml 70 60 50 40 30 20 10 0 1 32 2 37 3 42 47 4 5 6 Tempo em anos 113,19 124,76 139,86 156,66 164,54 174,27 180,64 191,24 1 2 7 9 6 0 0 4 52 56 7 58 8 61 9 65 186,20 6 Número de pacientes em tratamento Figura 1. Porcentagem de pacientes em tratamento antirretroviral com CV plasmática inferior a 400 cópias/ml ao longo do tempo de 2001 a 2009. Incidência por 100 pessoas/ano 120 90 60 30 arr = 1,46 113,6 REF 70,7 N ~30.000 arr = 0,82 41,5 arr = 0,51 17,9 arr = 0,54 15,1 0 1996-97 1998-99 2000-01 2002-03 2004-05 Figura 2. Proporção de pacientes com falhas virológicas a 2 esquemas antirretrovirais distintos ao longo do tempo 5. Determinantes da falha virológica Inúmeros fatores odem contribuir para falha terapêutica aos ARVs. Uma das causas mais frequentes é a baixa aderência ao tratamento, dada a complexidade da posologia e a gama de efeitos colaterais dos esquemas terapêuticos. É especialmente difícil convencer pacientes assintomáticos a utilizarem a medicação de modo ideal, em um tratamento que deveria ser para toda a vida do paciente e cuja interrupção não programada pode levar 22

a resistência a um ou mais medicamentos do esquema utilizado. As causas farmacológicas também têm papel na falha virológica. Dentre essas, poderíamos citar a absorção deficiente do fármaco, eliminação acelerada da medicação, penetração deficiente em alguns santuários e interações com outros medicamentos. Um estudo analisando 130 pacientes com CV indetectável (< 75 cópias/ml) por longos períodos de tempo demonstrou que 80% desses pacientes ainda apresentavam viremia residual quando testes mais sensíveis, que detectam até 1 cópia/ml, foram utilizados, sendo que a replicação viral residual média revelou CV de 3,1 cópias/ml 6. Outro estudo demonstrou que nos casos de supressão viral adequada em plasma sanguíneo, a produção de RNA viral pode estar presente em biópsia de tecido retal em 65% dos casos 7, sendo o trato gastrintestinal um santuário importante pela distribuição deficitária de medicamentos nesses tecidos e, eventualmente, contribuindo para a replicação viral residual. Com relação à interação negativa dos ARVs com outros medicamentos, nota-se que alguns pacientes usam uma quantidade grande de outros medicamentos, sendo que algumas das interações são conhecidas e outras ainda não. Algumas características relacionadas ao perfil farmacocinético dos medicamentos podem favorecer a seleção de mutações de resistência. Existe atualmente a discussão sobre a chamada área de alta pressão seletiva para resistência aos ARVs. Após o pico sérico de uma única dose de ARV, haverá a diminuição progressiva dos níveis séricos desse medicamento ao longo do tempo. A diminuição dos níveis séricos leva à concentração do medicamento por uma área conhecida como zona de alta pressão seletiva, sendo, hipoteticamente, esse o momento em que haveria maior chance de seleção de vírus resistentes. Dessa forma, quanto maior o tempo de permanência do medicamento na zona de alta pressão seletiva, maior a chance de emergência de vírus resistentes (Fig. 3). Sabe-se, por exemplo, que a duração do LPV/r nesta zona é de 3,8 h enquanto que a duração do NFV é de 7,5 h 8. É possível também que existam fatores virais ou relacionados ao sistema imune do hospedeiro que possam influenciar a resposta ao tratamento. Há evidências de que pacientes infectados com cepas virais do subtipo F do HIV-1 apresentem pior resposta virológica ao tratamento (Fig. 4) 9. Da mesma forma, indivíduos heterozigotos para o gene que codifica o correceptor CCR5 apresentam melhor resposta terapêutica imunológica, mensurada pelo incremento de células CD4 (Fig. 5) 9. Por fim, a resistência aos ARVs é de sobremaneira importante, como causa primária da falha terapêutica ou como consequência dela. A frequente associação entre presença de resistência e falha terapêutica será mais bem explorada a seguir. Guía para o manuseio de resistência antirretroviral Tipos de resistência aos ARVs A resistência aos ARVs pode ser viral ou celular. A resistência viral está subdividida em genotípica e fenotípica e será discutida adiante. A resistência celular pode interferir na penetração ou na ativação do fármaco 10-13. A partir de um mecanismo semelhante ao que proporciona a resistência das 23

Concentração do medicamento (µg/ml) APS mt IC 50 wt IC 50 0 12 Tempo (h) 24 Figura 3. Fatores afetando a incidência de cepas de HIV-1 resistentes in vivo. Após uma única dose de antirretrovirais, os níveis mínimos passam por uma zona de alta pressão seletiva (APS), e a duração do tempo em que os níveis séricos permanecem nessa zona está diretamente relacionada à incidência de mutações de resistência. mt IC 50 = concentração inibitória para inibição de cepas com mutações de resistência e wt IC 50 = concentração inibitória para inibição de cepas do tipo selvagem 8. Carga viral em log 10 6 5 4 3 2 1 0 Subtipo B Subtipo F Semana 0 p < 0,16 4 p < 0,12 24 p < 0,13 32 p < 0,06 48 p < 0,02 Figura 4. Comparação da resposta antirretroviral entre pacientes infectados por HIV-1 do subtipo B (diamantes) ou F (quadrados). O eixo Y apresenta a CV em log 10 após introdução de ZDV/3TC/IDV, e no eixo X a duração do tratamento em semanas. Observa-se que a queda da CV é mais pronunciada em pacientes infectados por HIV-1 do subtipo B 9. 24

160 140 120 100 80 60 40 20 0 20 40 Semana CD4 (céls/mm 3 ) 0 WT 4 p < 0,6 32 24 p < 0,3 32 p < 0,6 48 p < 0,03 Figura 5. Comparação da resposta imunológica (incremento de CD4, eixo Y) ao tratamento antirretroviral entre pacientes heterozigotos para a deleção de 32 nucleotídeos no gene que codifica o correceptor CCR5 (quadrados) e os pacientes homozigotos para o gene do tipo selvagem (WT, diamantes). Nota-se que a resposta ao tratamento é melhor nos pacientes portadores do 32 9. Guía para o manuseio de resistência antirretroviral células neoplásicas aos quimioterápicos, pode haver alteração na concentração intracelular dos IPs, por ação da glicoproteína p. A glicoproteína p se expressa na superfície celular e, em alguns casos, seria responsável pela extrusão dos IPs após sua absorção, tanto no trato gastrointestinal como nos linfócitos. Teoricamente, poderia haver um aumento na expressão da glicoproteína p na superfície celular proporcional à duração do uso do IP, levando a uma consequente queda na concentração intracelular do fármaco. Ainda em patamar teórico, as estratégias para inibir a expressão da glicoproteína p seriam: a) o uso concomitante ou alternado de outro IP, pela especificidade da glicoproteína p por um determinado medicamento, b) uso de ciclosporina A, c) verapamil ou d) PSC-833. Com relação aos ITRNs, a resistência celular estaria relacionada à ativação do medicamento, mais especificamente à fosforilação. Todos os ITRNs necessitam da ativação em sua forma trifosfato, que seria, na verdade, a forma que interrompe a transcrição reversa. Mecanismos enzimáticos celulares poderiam também ser modulados para progressivamente reduzir a fosforilação intracelular de nucleosídeos. Estratégias teóricas propostas para melhorar a fosforilação seriam: a) o uso concomitante de hidroxiureia, que, teoricamente, aumentaria a fosforilação do ddi, b) uso intermitente de diferentes ITRNs e c) substituição temporária dos ITRNs. Ao exemplo do que ocorre em relação à glicoproteína p e aos IPs, alguns receptores celulares também podem assumir o papel de extrusão celular dos ITRNs, como o BCRP/ABCG2, que é responsável também pela resistência aos quimioterápicos dirigidos ao câncer de mama 14. Deve se suspeitar de resistência celular sempre que há falha virológica sem a presença de resistência genotípica em paciente com boa adesão ao tratamento. 25

Normalmente, a ativação dos mecanismos de extrusão, principalmente os relacionados à glicoproteína p, começam a ter ação logo que a pessoa começa a ingerir a medicação e, depois, essa ativação se estabiliza em um nível baixo, que não comprometerá a atividade antirretroviral. Essa estabilização ocorre cerca de 2 a 3 semanas após o início de tratamento, e é plausível que, durante as primeiras semanas de tratamento, o indivíduo sinta mais os efeitos colaterais da medicação porque os níveis séricos dos fármacos estarão mais elevados. Portanto, após esse período inicial de duas a três semanas, os efeitos adversos são mais bem tolerados. Algumas proteínas relacionadas à extrusão de medicamentos, como a conhecida como ABCG2, podem ajustar e diminuir os níveis de EFV, sendo menos conhecido o papel dessa proteína na resistência celular do EFV 15. Entretanto, é importante notar que o ajuste dos níveis séricos do EFV a níveis estáveis ocorre paulatinamente até a terceira semana de tratamento. Desse modo, é também esperado que a neurotoxicidade proporcionada por esse medicamento seja mais intensa nos períodos iniciais, sendo importante o entendimento do paciente de que, passado esse período, a tolerabilidade ao EFV deverá ser melhor. Resistência primária (transmitida) e secundária aos ARVs A resistência viral aos ARVs pode ser primária ou secundária, sendo que o termo resistência transmitida tem sido utilizado com maior propriedade atualmente. Resistência secundária é aquela que emerge em decorrência da pressão de seleção exercida pela medicação antirretroviral. A resistência transmitida é aquela já presente mesmo antes do uso da medicação pelo indivíduo infectado. Atualmente, é claro que a presença de HIV com mutações de resistência em pessoas virgens de tratamento antirretroviral é exclusivamente relacionada à transmissão de cepas resistentes e não da emergência natural desses vírus, como foi especulado há algum tempo. A transmissão de HIV resistente significa que, em algum momento da cadeia de transmissão do vírus, algum paciente sabidamente infectado e portador de vírus resistentes aos ARVs não adotou as medidas preconizadas para impedir a transmissão do HIV. De fato, um estudo realizado entre 2000 e 2002, que analisou 395 pacientes com vírus resistentes, identificou que 23% dos pacientes tiveram sexo desprotegido nos últimos 3 meses, resultando em 1.126 eventos de sexo desprotegido com 191 parceiros 16. Parece bem claro, portanto, que pacientes portadores de HIV resistentes seriam os que mais colocariam em risco os parceiros sexuais através do sexo desprotegido. Em outras palavras, o mesmo grupo de pessoas que possivelmente não aderiu ao tratamento antirretroviral, tendo como consequência o desenvolvimento de HIV resistente, é o grupo de pessoas que também apresenta dificuldades em aderir às recomendações de uso de preservativo e prevenção da transmissão. Dessa forma, atenção especial com relação a medidas de contenção da transmissão do HIV deve ser dada a esse grupo específico de pessoas. 26

Transmissão de vírus resistentes Casos de transmissão de vírus resistentes têm sido relatados desde o início da década de 90 17 24. Como o primeiro ARV a ser utilizado foi a ZDV, os primeiros relatos de transmissão de vírus com mutação de resistência relacionavam se a mutações a esse fármaco 25. Com a disponibilização de outros ARVs, iniciaram se, também, os relatos de transmissão de vírus com mutações relacionados aos outros ARVs 18,26,27. A OMS define como baixa a prevalência de resistência transmitida quando essa é inferior a 5%; intermediária quando está entre 5 e 15% e elevada quando é superior a 15%. A determinação da prevalência de resistência primária em diferentes localidades do mundo (Tabela 8) é de extrema importância para o monitoramento da epidemiologia molecular do HIV 1, podendo, teoricamente, orientar terapêutica empírica inicial dos pacientes de determinada área geográfica. Há que se ressaltar, por exemplo, a alta prevalência de resistência primária aos ITRNNs em indivíduos com infecção recente no sul da Califórnia EUA, que é de 16% 28. A partir dos anos 90, ficou evidente que a tendência mundial é de aumento específico da resistência aos ITRNNs ao longo do tempo. Outro dado intuitivo, porém alarmante, relaciona se ao aumento ao longo do tempo da prevalência de resistência primária nos EUA entre indivíduos com infecção primária/recente, de 3,5% entre 1995 8 a 14% nos anos de 1999 2000 29 31. Em um estudo brasileiro, foram realizadas análises genotípicas de todas as amostras obtidas em 2001, originadas de indivíduos com teste positivo para o HIV em 13 Centros de Testagem e Aconselhamento distribuídos no Brasil. Foi detectada, inicialmente, em casuística de 535 amostras de plasma, a prevalência global no Brasil de 6,5% de resistência transmitida, curiosamente com o predomínio de resistência aos análogos aos nucleosídeos e sem prevalência de resistência a múltiplas classes de ARVs 32. Uma análise subsequente, utilizando a mesma estratégia em amostras coletadas em 2007 2008, mostrou que a incidência global de resistência transmitida no Brasil aumentou para 8,1%, sendo que, dessa vez, ao modelo que se observa entre países desenvolvidos, a prevalência de resistência foi superior aos ITRNNs 33. De fato, a prevalência de resistência transmitida tem sido considerada como intermediária no Brasil, mas com variações regionalizadas. Prevalência muito elevada de resistência transmitida entre as pessoas com infecção recente foi detectada na cidade de Santos, São Paulo (36%) 34, sendo também considerada alta na cidade de Salvador, Bahia (18,9%) 35. Dessa forma, é importante salientar que a resistência primária está intimamente relacionada à localidade pesquisada e às peculiaridades dessa localidade quanto à manipulação antirretroviral, sendo difícil fazer generalizações muito amplas. Guía para o manuseio de resistência antirretroviral Entendendo a tendência da resistência primária A análise mais intuitiva da tendência da resistência primária seria a de se esperar que essa aumentasse ao longo do tempo, de acordo com o tempo 27