GaTE Lab Genomics and Transposable Elements Transformação genética e suas aplicações em pesquisa e biotecnologia Profa. Dra. Magdalena Rossi
Que é um organismo geneticamente modificado (OGM)? São aqueles que recebem um ou mais genes de outro organismo e passam assim a expressar uma nova característica de interesse. OGMs = melhoramento genético clássico. -cruzamentos naturais ou forçados com seleção humana (milho/teosinte?) -introgressão de genes de espécies selvagens em S. lycopersicum. OGMs= tão antigos quanto a agricultura (mas não são produzidos por transformação).
Que é um transgênico? DNA Genes de interesse: existem na natureza, não são inventados nem sintetizados. Célula: animal, vegetal, bactéria, etc
Melhoramento genético: CLÁSSICO TRANSFORMAÇÃO DIRETA Característica de interesse Planta de interesse Estabilidade da informação transferida Gene de interesse Planta de interesse Estabilidade da informação transferida Ambos dependem da seleção das cultivares para uso comercial em etapas subsequentes.
As transgênicas e o melhoramento genético
Técnicas de transformação genética de plantas: Aplicações na pesquisa básica e aplicada Aplicações Biotecnológicas (produtos transgênicos)
Técnicas de transformação genética de plantas: Agrobacterium (método biológico) Bombardeamento (método físico) Eletroporação )método físico) Aplicações na pesquisa básica e aplicada Aplicações Biotecnológicas (produtos transgênicos)
Agrobacterium: Angiospermas (eudicotiledôneas, mono) e Gimnospermas) Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium) A. tumefaciens A. tumefaciens (galha-da-coroa) A. rhizogenes
Histórico 1907; descreve-se a doença 1930; caracteriza-se o agente: Agrobacterium 1970; constata-se a correlação entre a doença e um plasmídeo 1979; transferência de um fragmento de DNA da bactéria para a célula vegetal
A. tumefaciens A. tumefaciens pti tumor: tecido mosaico! Porque forma o tumor?
A. rhizogenes pri raizes são clones celulares porque surgem raizes?
Uma interação peculiar...
Agrobacterium - Transfere um fragmento de DNA, o T-DNA, do plasmídio Ti no genoma vegetal. - Inserção em posição aleatória dentro do genoma. - Induz a proliferação celular originando tumores ou raízes a partir da célula transformada. - As células vegetais transformadas sintetizam substâncias chamadas opinas que são a fonte de C e N das bactérias.
Organização de pti ou pri síntese de opinas e oncogenes (síntese de citocininas, auxinas ou sensibilidade para auxinas) Região transferida Borda direita Borda esquerda (transferência do T-DNA: genes de virulência) 200Kb (catabolismo de opinas) (conjugação entre agrobactérias do solo) (origem de replicação e região de incompatibilidade)
Transferência do T-DNA Vir Gene expression Phenolics induced detected by the VirA/VirG two component sensor system. T-DNA Vir D1 & D2 cut T-DNA at right and left borders and starts T-DNA synthesis (VirC) VirE2 Formation of T-complex AGROBACTERIUM VirD2 attaches to exposed 5 I end VirA VirG Bacterial Plasmid Formation of T-Pilus (VirB and VirD4 PLANT CELL Phenolics Produced by Wounded Plant cell Gall Formation! T-DNA integrates into plant DNA and gall production is initiated. VIP1 associates with the complex to target it to the nucleus VIP2 associates the complex to transcriptionally active DNA
Transformação via Agrobacterium -Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção. -Introdução da construção na bactéria. -Introdução da construção na célula vegetal pela bactéria. -Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Organização de pti ou pri GENE DE INTERESSE + MARCADOR DE SELEÇÃO Região transferida Borda direita Borda esquerda (transferência do T-DNA: genes de virulência) 200Kb (catabolismo de opinas) (conjugação entre agrobactérias do solo) (origem de replicação e região de incompatibilidade)
Transformação de explantes T-DNA: Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantes SEM GENES DE OPINAS E SEM ONCOGENES
Transformação de células Células 3-4 dias em cultura liquido Meio + antibióticos para seleção 4 ml 3 dias de cocultivo Replaqueamento em meio seletivo Após 7 dias 50 100 ul 1 2 3 4 5 6 Bactérias de 1-2 dias em cultura 7 8 9 10 11 12
Transformação de células e seleção Replaqueamento em meio seletivo Células que não cresceram em meio seletivo Células crescendo em meio seletivo Meio MS30 sólido Carb + Vanc + Higro U3B::GUS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 U3A3MR::GUS U3A2MR::GUS Controle -
O processo de regeneração: Seleção de linhagens portadoras do gene de interesse.
Transformação via bombardeamento (canhão gênico) -Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção. -Introdução da construção de interesse por um mecanismo físico. -Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Transformação genética de plantas: bombardeamento Prom Gene de interesse VETOR Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantes Diferênça com vetor de Agro! Bombardeador Partículas de tungstênio carregando DNA Bombardment
Transformação via eletroporação -Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção. -Introdução da construção de interesse por um método físico. -Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Transformação genética de plantas: eletroporação Prom Gene de interesse VETOR Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantes D E F
Técnicas de transformação genética de plantas: Agrobacterium (método biológico) Bombardeamento (método físico) Eletroporação )método físico) Aplicações na pesquisa básica e aplicada Conhecer o padrão temporal de expressão de um gene (?) Conhecer o padrão espacial de expressão de um gene (?) Conhecer a resposta de um gene a diferentes estímulos Estudar os genes envolvidos nos diferentes processos fisiológicos (ex. resistência a patógenos, floração, etc) Aplicações Biotecnológicas (produtos transgênicos)