Variações nas estratégias de defesa ao longo do desenvolvimento. ontogenético foliar de Copaifera langsdorffii Desf. e Hymenaea

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1 Jaqueline Pereira Guimarães Variações nas estratégias de defesa ao longo do desenvolvimento ontogenético foliar de Copaifera langsdorffii Desf. e Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne Montes Claros Minas Gerais- Brasil Abril

2 Jaqueline Pereira Guimarães Variações nas estratégias de defesa ao longo do desenvolvimento ontogenético foliar de Copaifera langsdorffii Desf. e Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Montes Claros, como requisito parcial necessário para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Marcílio Fagundes Montes Claros Minas Gerais- Brasil Abril i

3 G963v Guimarães, Jaqueline Pereira. Variações nas estratégias de defesa ao longo do desenvolvimento ontogenético foliar de Copaifera langsdorffii Desf. e Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne: [manuscrito] / Jaqueline Pereira Guimarães f. : il. Bibliografia: f Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Montes Claros - Unimontes, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - /PPGCB, Orientador: Prof. Dr. Marcílio Fagundes. 1. Biologia Árvores. 2. Ontogenia foliar Estratégias de defesa antiherbívoros. 2. Copaifera Langsdorffii Desf. Árvore Copaibeira. 3. Hymenaea stigonocarpa Mart. Jatobá do cerrado. 4. Taninos Concentração - Árvores. 5. Diversidade biótica. I. Fagundes, Marcílio. II. Universidade Estadual de Montes Claros. III. Título. Catalogação Biblioteca Central Professor Antônio Jorge 2 ii

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5 Concedei-me Senhor, Serenidade para aceitar as coisas que não posso mudar, Coragem para mudar aquilo de que sou capaz e Sabedoria para distinguir umas das outras. (Reinhold Niebuhr) Dedico à minha família 4 iv

6 Agradecimentos À Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força para superar as dificuldades e mostrar os caminho nas horas incertas. Ao meu orientador, Marcílio Fagundes, pela oportunidade e confiança. Sempre serei grata pelos ensinamentos durante esses dois anos. Aos amigos do laboratório de Biologia da Conservação que fizeram parte desse projeto, sempre me ajudando e incentivando nas incansáveis coletas e nas análises dos dados. Especialmente agradeço a Matheus (Serapas) por não ter poupado esforços para me ajudar, a conclusão desse trabalho não seria possível sem a sua dedicação. Muito obrigada, esse trabalho é seu também! Aos colegas do mestrado e dos demais laboratórios pelas ideias, parcerias e amizade. À minha família, a qual amo muito, pelo carinho, apoio e incentivo. Obrigada pela paciência e compreensão, principalmente nessa etapa final. À Thadeu pelo amor, paciência e por me proporcionar momentos de descontração. À Fátima por ter me acolhido como uma filha, sempre disposta a ajudar. Seria tudo mais difícil sem o apoio de vocês! À Kallen e Laura pela paciência em ouvir minhas lamentações nos momentos de angústia. Kallen, sua ajuda no campo provou que você é amiga pra todas as horas! Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (PPGCB) da Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTES) pelo apoio. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela concessão da bolsa de estudos durante o mestrado. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo financiamento do projeto de mestrado. 5 v

7 Resumo Durante o desenvolvimento ontogenético as folhas passam por mudanças que afetam as interações com os insetos herbívoros. As principais mudanças ontogenéticas foliares envolvem variações na qualidade nutricional dos tecidos, variações no tempo de expansão/maturação foliar e as defesas indiretas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da ontogenia foliar nas estratégias de defesa anti-herbívoros em Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa, testando duas hipóteses: (i) folhas que apresentam maior taxa de crescimento inicial acumulam maior quantidade de taninos e (ii) formigas que forrageiam nos NEFs de C. langsdorffii e H. stigonocarpa afetam negativamente a fauna de insetos herbívoros. Foram selecionados 29 indivíduos de C. langsdorffii e 29 indivíduos de H. stigonocarpa e observados durante sete semanas consecutivas nos meses de novembro e dezembro de Para mensurar o crescimento das folhas foi utilizada a taxa de expansão foliar e a concentração de taninos foi comparada entre as duas espécies para avaliar a defesa química. Foi realizado um experimento de exclusão de formigas em que dois ramos de cada planta foram marcados e monitorados ao longo da expansão foliar. Os resultados desse trabalho demonstram que as folhas de H. stigonocarpa apresentaram maior crescimento inicial e maior concentração de taninos que C. langsdorffii. As formigas exerceram uma defesa efetiva contra insetos herbívoros apenas em C. langsdorffii - os ramos em que as formigas foram excluídas apresentaram maior número de herbívoros. A redução da abundância de formigas ao longo do desenvolvimento foliar também foi observada. Esses resultados indicam que as defesas diretas (escape temporal e produção de taninos) prevaleceram em Hymenaea stigonocarpa enquanto que a defesa indireta foi mais efetiva em Copaifera langsdorffii. Palavras chave. Defesa anti- herbívoros, expansão foliar, escape temporal, taninos, defesa biótica. 6

8 Abstract During ontogenetic development, plant leaves go through changes that affect the interactions with insect herbivores. The main leaf ontogenetic changes involve variations in tissue nutritional quality, variations in timing of leaf expanding/maturation, and indirect defenses. This study aimed to evaluate the effects of leaf ontogeny the antiherbivores defense strategy in Copaifera langsdorffii and Hymenaea stigonocarpa, testing two hypotheses: (i) leaves that present higher initial growth rates accumulate more tannins and (ii) ants that forage in NEFs of C. langsdorffii and H. stigonocarpa negatively affect the insect herbivores. Twenty-nine C. langsdorffii and Twenty-nine H. stigonocarpa individuals were selected and observed during seven consecutive weeks from November to December To measure leaf growth the leaf expanding rate was calculated and tannin concentration was compared between both species. An ant exclusion experiment was realized where two branches of each plant were marked and monitored during leaf expansion. The results of this work revealed that leaves of H. stigonocarpa exhibit higher initial growing and higher tannins concentration than leaves of C. langsdorffii. The ants exerted an effective defense against herbivores insects only in C. langsdorffii branches were ants were excluded exhibit more herbivores than branches where ants were allone. A reduction in ant abundance along the leaf development was observed as well. These results indicate that the direct defenses (temporal escape and tannin production) prevailed in Hymenaea stigonocarpa whereas the indirect defense was more effective in Copaifera langsdorffii. Key words. Anti-herbivores defense, leaf expansion, temporal escape, tannins, biotic defense. 7

9 Introdução Os órgãos das plantas passam por mudanças físicas e químicas durante seu desenvolvimento ontogenético que afetam a comunidade de herbívoros associada (Coley & Barone, 1996; Boege & Marquis, 2005). Estas variações afetam diretamente o ataque dos herbívoros, provocando mudanças na habilidade desses insetos encontrarem e consumirem o alimento (i.e. forças bottom-up) ou indiretamente, através da atração de parasitas e predadores dos herbívoros (i.e. forças top-down) (Fagundes et al., 2005). Contudo, dados que confirmam estas predições ainda são escassos e quando disponíveis referem-se a apenas um destes mecanismos (Boege & Marquis, 2006). As principais mudanças ontogenéticas foliares que afetam os herbívoros envolvem variações na qualidade nutricional dos tecidos (Traw & Feeny, 2008), variações no tempo de expansão/maturação foliar (Kursar & Coley, 1992a, b; Kursar & Coley, 2003) e as defesas indiretas (e.g. mirmecofilia, atração de parasitóides) (Fonseca, 1994; Rosumek et al., 2009). De fato, folhas jovens são mais macias (Loyola & Fernandes, 1993), nutritivas (Quintero & Bowers, 2012) e possuem menor concentração de compostos de defesa cumulativos que folhas maduras (Cornelissen & Fernandes, 2001; Brene-Arguedas et al., 2006). Durante o amadurecimento, as folhas acumulam lignina, fibras e compostos secundários que as tornam mais esclerófilas e menos palatáveis para os herbívoros (Coley, 1983). Portanto, folhas jovens geralmente são mais atacadas por herbívoros (Boege & Marquis, 2006). A estratégia de desenvolvimento foliar representa outro mecanismo que afeta diretamente os herbívoros (Coley, 2008). Por exemplo, folhas que apresentam taxas de crescimento inicial altas têm maior probabilidade de escapar temporalmente dos herbívoros (Kursar & Coley, 1992a, b). Além disso, estas folhas disponibilizam muito nitrogênio para o crescimento por unidade de tempo (Brene-Arguedas et al., 2006), 8

10 aumentando a relação carbono/nitrogênio nos tecidos foliares. A hipótese do balanço Carbono/Nitrogênio (Bryant et al., 1983) prediz que, altas taxas de crescimento no estágio inicial de desenvolvimento foliar levam a um excesso relativo de carbono que são estocados como compostos secundários, na forma de terpenos e compostos fenólicos, e desempenham importante papel na defesa contra herbívoros (Karban & Baldwin, 1997). Os taninos, por exemplo, são compostos fenólicos imóveis de grande peso molecular, formados à base de carbono que dificultam a digestão dos tecidos vegetais pelos insetos herbívoros (Monteiro et al., 2005). A atração de formigas por nectários extraflorais (NEFs) constitui outro importante mecanismo de defesa indireta em muitos sistemas tropicais e temperados (Davidson, 1997; Rosumek et al., 2009). Os NEFs são estruturas vegetais que secretam uma solução rica em açúcar e aminoácidos (Smith et al., 1990; Bluthgen & Fiedler, 2004). NEFs ocorrem com freqüência nas angiospermas das regiões tropicais e temperadas, embora sejam mais comuns nos trópicos (Oliveira & Pie, 1998). Cerca de 25% das espécies arbóreas do Cerrado possuem NEFs (Oliveira & Leitão-Filho, 1987; Oliveira & Oliveira-Filho, 1991), que normalmente são ativos apenas nas folhas jovens (Coley et al., 2005; Meng et al., 2011). Muitos gêneros de formiga (e.g. Camponotus, Cephalotes, Crematogaster) utilizam essa substância como fonte de alimento (Davidson, 1997; Oliveira, 1997; Bixenmann et al., 2011). Durante o forrageamento essas formigas atuam como defesas bióticas indiretas, protegendo as plantas contra o ataque dos herbívoros (Rudgers et al., 2003; Mody & Linsenmair, 2004; Neves et al., 2011). Diversos estudos sugerem que as formigas que forrageiam nos NEFs afetam negativamente a fauna de herbívoros em suas plantas hospedeiras (Fonseca, 1994, Fernandes et al., 1999, 2005; Rosumek et al., 2009). Contudo, o papel protetor depende da espécie de formiga e do grau de agressividade exibido, além da habilidade dos 9

11 herbívoros em evitar a predação (Koptur, 1992). A proteção por formigas pode ainda variar entre as espécies de plantas hospedeiras (Coley et al., 2005). Além disso, alguns estudos têm mostrado que a qualidade dos exudados dos NEFs também afeta o resultado da interação planta-herbívoro-formiga (Boege & Marquis, 2006; Bixenman et al., 2011). Copaifera langsdorffii Desf. e Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne (Fabaceae) são espécies arbóreas comuns no cerrado brasileiro. Estas espécies possuem diferentes taxas de crescimento foliar e nectários extraflorais ativos apenas na fase jovem das folhas. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da ontogenia foliar nas estratégias de defesa anti-herbívoros em C. langsdorffii e H. stigonocarpa, testando duas hipóteses (i) folhas que apresentam maior taxa de crescimento inicial acumulam maior quantidade de taninos e (ii) formigas que forrageiam nos NEFs de C. langsdorffii e H. stigonocarpa afetam negativamente a fauna de insetos herbívoros, dessa forma espera-se que na ausência de formigas as plantas sejam mais atacadas. Metodologia Área de estudo O estudo foi desenvolvido em uma área de Cerrado stricto sensu localizado ao longo da Estrada da Produção, saída norte da cidade de Montes Claros ( S e W), norte de Minas Gerais (Fig.1). Essa região encontra-se entre os domínios do Cerrado e da Caatinga (Rizzini, 1997). A temperatura média anual é cerca de 23 C e a precipitação média é de aproximadamente mm/ ano, com verões quentes e úmidos e invernos secos e frios (Costa et al. 2011). A vegetação da área de 10

12 estudo é classificada como Cerrado stricto sensu, com árvores de tronco retorcido que variam de 3 a 13m e sub-bosque desenvolvido e solo argiloso distrófico ou oligotrófico (Costa et al., 2010, Fagundes et al., 2011). Figura 1: Área de estudo: Cerrado stricto sensu, Montes Claros, Minas Gerais ( S e W). Espécies estudadas Copaifera langsdorffii Copaifera langsdorffii Desf. (Fabaceae: Caesalpinioidea) é uma espécie arbórea tropical que pode atingir até 10 m de altura em áreas de Cerrado sentido restrito (Fig. 2) (Carvalho, 2003). Conhecida popularmente como copaíba ou pau d óleo é uma espécie 11

13 com uma rica variedade de galhas (Costa et al., 2010) e insetos herbívoros associados (Almeida et al., 2006). A planta apresenta deciduidade marcante na estação seca do ano (julho a setembro), e o brotamento ocorre imediatamente após a queda das folhas produzidas no ano anterior, sendo facilmente observado pelo aspecto avermelhado das copas (Pedroni et al., 2002; Carvalho, 2003). As folhas de C. langsdorffii apresentam crescimento lento, e na base dos folíolos possui um par de nectários extraflorais ativos apenas na fase jovem das folhas (Costa et al., 2011). Figura 2: Indivíduo adulto (A) e folíolos (B) de Copaifera langsdorffii Desf.(Fabaceae). Hymenaea stigonocarpa Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne (Fabaceae: Caesalpiniacaea) popularmente conhecido como jatobá do cerrado é uma árvore tropical, perene, com 8 a 15 m de altura (Fig. 3). Estudos fenológicos indicam que o brotamento foliar ocorre no final da estação seca, entre os meses de outubro e novembro (Bulhão & Figueiredo, 2002). Essa espécie possui ampla distribuição, sendo abundante no estado de Minas Gerais. As folhas de H. stigonocarpa apresentam nectários extraflorais (NEFs) distribuídos por todo o limbo dos folíolos. As folhas do jatobá não expandidas 12

14 apresentam coloração avermelhada e, nas folhas adultas, as regiões do mesofilo tornamse fotossintetizantes e os NEFs se encontram inativos (Paiva & Machado, 2006). Figura 3: Indivíduo adulto (A) e folíolos (B) de Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne (Fabaceae) Desenho experimental Na área de estudo, 29 indivíduos de Copaifera langsdorffii e 29 indivíduos de Hymenaea stigonocarpa com altura entre 1,5 a 2,5 metros foram selecionados. Em cada planta foram marcados dois ramos que apresentavam folhas na fase inicial de expansão, esses ramos foram divididos em dois tratamentos: ramo com exclusão de formigas e ramo com acesso livre a formigas. Essas plantas foram monitoradas por sete semanas consecutivas de novembro a dezembro de 2010, quando foram mensuradas a expansão foliar e herbivoria na presença e ausência de formigas. Para análise química foram coletadas três folhas para cada estágio de expansão foliar: jovem, intermediário e maduro, em dez plantas de C. langsdorffii e dez de H. stigonocarpa. 13

15 Determinação da taxa de expansão foliar Dois folíolos de cada ramo selecionado foram fotografados semanalmente em todas as plantas durante sete semanas consecutivas. A taxa de expansão foliar de cada semana foi estimada da seguinte forma: taxa de expansão da semana 1 = área total dos folíolos da semana 2 área total dos folíolos da semana 1 / área total dos folíolos da semana 2. A área total dos folíolos foi calculada com o auxílio do programa Image J. Os mesmos folíolos usados para estimar a taxa de expansão foliar foram utilizados para mensurar a concentração relativa de clorofila. Essa concentração foi obtida a partir do clorofilômetro manual SPAD-502 (Soil Plant Analysis Development, Minolta) e foi usada como um indicador de maturação foliar, uma vez que existe uma relação direta entre tempo de amostragem e concentração de clorofila. Quantificação de taninos Para análise da variação na concentração de taninos, foram selecionadas dez plantas de cada espécie e em cada planta foram coletadas três folhas de cada uma das fases de expansão foliar: jovem (duas semanas), intermediária (quatro semanas) e madura (oito semanas). As folhas foram colocadas para secar em estufa a 45 C por 96 horas sendo posteriormente moídas. A seguir, 50 mg de cada amostra foi diluída em 1,0 ml de metanol e deixada em descanso por 30 minutos para centrifugação ( RPM/15), após esta etapa a amostra foi deixada em repouso por 45 minutos para decantação. O sobrenadante foi aplicado diretamente para a difusão em gel (10µl do extrato foram adicionados à placa petri contendo uma mistura de ágar e proteína albumina bovina). O extrato foi colocado em círculos uniformes de 2,8 mm de diâmetro perfurados na agarose. As placas foram seladas com parafilme e incubadas a 30 C por 14

16 96 horas. O extrato de tanino reagiu com a albumina formando um precipitado opaco no qual o diâmetro quadrado é proporcional a concentração de tanino no extrato. Utilizouse ácido tânico nas concentrações de 0,01 a 0,1 para a construção da curva padrão (Hagerman, 1987). Experimento de exclusão de formigas Para verificar o efeito das formigas associadas às plantas sobre a comunidade de insetos herbívoros, cada planta selecionada foi submetida a um experimento com dois tratamentos: ramos com exclusão de formigas e ramos com acesso livre a formigas (Fig. 4). Para exclusão de formigas aplicou-se a resina pegajosa tanglefoot não tóxica na base dos ramos selecionados. Além disto, foram cortados todos os ramos vizinhos que possivelmente pudessem funcionar como ponte para o acesso de formigas. Os ramos selecionados foram monitorados semanalmente e as observações foram realizadas no período diurno, entre 8h e 12h. Este horário está de acordo com o período de forrageamento das formigas (Fagundes et al., 2005). Cada ramo foi observado por cinco minutos para a determinação da riqueza e abundância de formigas e insetos herbívoros de vida livre. Os insetos herbívoros e formigas encontrados forrageando nos ramos selecionados foram capturados e levados para o laboratório de Biologia da Conservação da UNIMONTES para identificação. Para comparar a riqueza e abundância de herbívoros de vida livre entre C. langsdorffii e H. stigonocarpa foram avaliados apenas os insetos dos ramos com exclusão de formigas. 15

17 Figura 4: Experimento de exclusão de formigas: na seta indicada aplicou- se a resina tanglefoot para evitar o acesso às formigas. Análise estatística Para testar a hipótese (i) comparou-se a velocidade de crescimento e a concentração de taninos entre C. langsdorffii e H. stigonocarpa. Para comparar a velocidade de crescimento entre as espécies foi utilizada ANOVA para medidas repetidas para eliminar os casos de pseudorepetição temporal e espacial, como variáveis explicativas utilizaram-se o tempo e as espécies e como variável resposta utilizou-se velocidade de crescimento. Para testar a concentração de taninos entre espécies foi utilizada ANOVA two-way, tendo como variável explicativa espécie e variável resposta concentração de taninos. Para avaliar a hipótese (ii) comparou- se a riqueza e abundância de insetos herbívoros nos tratamentos: ramos com exclusão de formigas e ramos com acesso livre a formigas. As variáveis explicativas utilizadas foram tratamentos e tempo e as variáveis respostas foram riqueza e abundância de insetos herbívoros. Neste caso também foi utilizada ANOVA para medidas repetidas. 16

18 Resultados Desenvolvimento foliar de Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa A área total foliar variou em função da espécie, período de amostragem e da interação espécie x tempo (Tabela 1). O padrão de incremento da área foliar de Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa foi similar. Assim, observou-se variações significativas na área das folhas das duas espécies principalmente nas três primeiras semanas de desenvolvimento. Contudo, deve-se ressaltar que folhas de H. stigonocarpa apresentaram área total aproximadamente dez vezes maior do que as folhas de C. langsdorffii em todos os períodos de amostragem (Fig. 5a e b). Figura 5: Área total dos folíolos de Copaifera langsdorffii (a) e Hymenaea stigonocarpa (b) durante sete semanas consecutivas de novembro a dezembro de Similarmente, a taxa de expansão foliar variou entre as espécies, período de amostragem e interação espécie x tempo (Tabela 1). De modo geral, a expansão foliar concentrou-se nas três primeiras semanas do desenvolvimento foliar. Além disto, observou-se que H. stigonocarpa apresentou maior taxa de expansão foliar que C. langsdorffii especialmente nas duas primeiras semanas (Fig. 6). 17

19 Figura 6: Taxa de expansão foliar ao longo da ontogenia foliar de Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa. A concentração relativa de clorofila variou em função da espécie, período de amostragem e da interação espécie x tempo (Tabela 1). A concentração relativa de clorofila aumentou progressivamente com o desenvolvimento foliar, destacando uma tendência de estabilização a partir da quinta semana, especialmente em H. stigonocarpa. De modo geral, a concentração de clorofila foi maior em H. stigonocarpa em todos os períodos de amostragem (Fig. 7). 18

20 Figura 7: Concentração relativa de clorofila de Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa ao longo de sete semanas consecutivas de novembro a dezembro de

21 Tabela 1. ANOVA para medidas repetidas para avaliar o efeito dos tratamentos, tempo de amostragem e espécies nas variáveis respostas (área total foliar, taxa de expansão foliar, e riqueza e abundância de formigas e insetos herbívoros) em Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa. Variável resposta Variação d.f. SS MS F p Área total foliar espécie 1 194E3 194E tempo 6 388E espécie x tempo 6 246E Taxa de expansão foliar espécie tempo espécie x tempo Concentração relativa espécie de clorofila tempo 6 154E espécie x tempo Riqueza de espécie formigas tempo espécie x tempo Abundância de espécie formigas tempo espécie x tempo Riqueza de insetos espécie herbívoros tempo espécie x tempo Abundância de insetos espécie herbívoros tempo espécie x tempo Riqueza de insetos tratamentos herbívoros em C. tempo langsdorffii tempo x tratamentos Abundância de insetos tratamentos herbívoros em C. tempo langsdorffii tempo x tratamentos Riqueza de insetos tratamentos herbívoros em H. tempo stigonocarpa tempo x tratamentos Abundância de insetos tratamentos herbívoros em H. tempo stigonocarpa tempo x tratamentos

22 A concentração de taninos variou entre as espécies e entre as fases de maturação foliar (Tabela 2). H. stigonocarpa apresentou maior concentração de taninos que C. langsdorffii em todas as fases de maturação foliar. Além disso, observou-se que as folhas jovens apresentaram menor concentração de taninos do que folhas intermediárias e maduras nas duas espécies (Fig. 8). Tabela 2. ANOVA fatorial para avaliar o efeito dos estágios de expansão foliar e species na concentração de taninos em Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa. Variável resposta Variação d.f. SS MS F p Concentração de taninos espécies estágios espécies x estágios Figura 8: Concentração de taninos de Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa em três fases de expansão foliar: jovem (duas semanas), intermediária (quatro semanas) e madura (oito semanas). 21

23 Fauna de insetos associada a Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa Formicidae A assembléia de formigas associada a C. langsdorffii foi composta por quinze morfoespécies distribuídas em quatro subfamílias. As espécies mais comuns foram Camponotus myrmaphaenus (34.97%), Camponotus crassus (22.66%) e Camponotus sp. (16.75%). A fauna de formigas observadas em H. stigonocarpa foi composta por dez morfoespécies distribuídas em quatro subfamílias. As espécies mais comuns foram Camponotus myrmaphaenus (32.92%), Crematogaster sp. 1 (25.47%) e Camponotus crassus (20.5%) (Anexo 1). A interação espécie x tempo afetou a riqueza de formigas, indicando que o número de espécies de formigas que visitam os NEFs variou entre as espécies ao longo dos períodos de amostragem (Tabela 1). De fato, a riqueza de formigas foi maior em C. langsdorffii nas quatro primeiras semanas de coleta (Fig. 9a). Contudo, a abundância de formigas foi afetada apenas pelo tempo (Tabela 1), indicando que a abundância de formigas diminuiu com o amadurecimento das folhas (Fig. 9b). 22

24 Figura 9: Riqueza (a) e abundância (b) de formigas de Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa ao longo de sete semanas consecutivas de novembro a dezembro de Insetos herbívoros Um total de 279 insetos herbívoros distribuídos em 26 morfoespécies e doze famílias foram observados em C. langsdorffii. As famílias Psyllidae (88.45%), Pentantomidae (2.53%) e Cicadelidae (2.17%) foram as mais abundantes. As famílias Psyllidae (cinco morfoespécies) e Membracidae (quatro morfoespécies) apresentaram maior riqueza de espécies (Anexo 2). A assembléia de insetos herbívoros associada a H. stigonocarpa foi composta por 92 indivíduos distribuídos em 31 morfoespécies e 15 famílias. Psyllidae (49.47%), Pentatomidae (17.97%) e Chrysomellidae (9.47%) foram as famílias mais representativas em número de indivíduos. Chrysomellidae (oito morfoespécies) e Psyllidae (quatro morfoespécies) apresentaram maior riqueza de espécies (Anexo 2). 23

25 A riqueza e abundância de herbívoros variaram em função da espécie, tempo e da interação espécie x tempo (Tabela 1). Excetuando-se as semanas 1 e 5, a riqueza de insetos herbívoros foi maior em C. langsdorffii (Fig. 10a). A abundância de insetos herbívoros também foi maior em C. langsdorffii, mas esta diferença foi mais acentuada nas quatro primeiras semanas de amostragem (Fig. 10b). 24

26 Figura 10: Riqueza (a) e abundância (b) de insetos herbívoros de Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa ao longo de sete semanas consecutivas de novembro a dezembro de Experimento de exclusão de formigas Copaifera langsdorffii A riqueza e abundância de herbívoros variaram em função dos tratamentos (com formiga - sem formiga) e do tempo de amostragem, porém a interação tratamento x tempo não foi significativa para riqueza (Tabela 1). De fato, os ramos com acesso a formigas apresentaram menor riqueza de insetos herbívoros (Fig. 11a). A abundância de insetos herbívoros também foi menor nos ramos que as formigas tinham acesso, além disso, observou-se que a abundância desses insetos reduziu a partir da quarta semana (Fig. 11b). Hymenaea stigonocarpa 25

27 A riqueza de insetos herbívoros variou em função dos tratamentos e do tempo de amostragem, porém a interação tratamento x tempo não foi significativa (Tabela 1, Fig. 11c). A abundância de herbívoros não variou em função dos tratamentos (com formiga - sem formiga), do tempo de amostragem e da interação tratamento x tempo (Tabela 1, Fig. 11d). Figura 11: Efeito do experimento de exclusão de formigas na riqueza e abundância de insetos herbívoros em Copaifera langsdorffii (a,b) e Hymenaea stigonocarpa (c,d), durante sete semanas consecutivas de novembro a dezembro de Discussão Este estudo relata as variações da efetividade de defesas diretas (escape temporal e produção de taninos) e indiretas (NEFs) contra insetos herbívoros ao longo do 26

28 desenvolvimento ontogenético foliar de duas espécies arbóreas tropicais. As defesas diretas prevaleceram em Hymenaea stigonocarpa enquanto que a defesa indireta foi mais efetiva em Copaifera langsdorffii. Esta conclusão foi suportada pelos resultados: (1) as folhas de H stigonocarpa desenvolvem mais rapidamente e acumularam maior quantidade de taninos que as folhas de C. langsdorffii, (2) a riqueza e a abundância de insetos herbívoros foram maiores em C. langsdorffii e (3) a exclusão de formigas afetou positivamente a abundância dos insetos herbívoros apenas em C. langsdorffii. A expansão foliar rápida representa um importante mecanismo de escape de herbívoros em muitas espécies vegetais, pois esta estratégia possibilita menor tempo de exposição das folhas jovens aos herbívoros (Brene-Arguedas et al. 2006). A rápida expansão foliar demanda grandes quantidades de nitrogênio, resultando no aumento da relação carbono/nitrogênio nestas folhas (Coley e Kursar, 1996). Assim, segundo a hipótese do balanço carbono/nitrogênio (Bryant et al., 1983), o excesso de carbono poderia ser usado na síntese de compostos de defesa baseados no carbono (e.g. taninos). Portanto, folhas com taxa de crescimento alta devem acumular maior quantidade de taninos durante seu desenvolvimento inicial, comparativamente à folhas com menor taxa de expansão foliar. Esta predição foi suportada pelos nossos resultados, pois as folhas de H. stigonocarpa apresentaram maior taxa de expansão foliar e acumularam maior quantidade de taninos, especialmente na fase inicial de desenvolvimento. A fenologia foliar das espécies também poderia ser usada para explicar a maior concentração de taninos observada nas folhas de H. stigonocarpa. Enquanto H. stigonocarpa apresentam folhas perenes (Bulhão & Figueiredo, 2002), C. langsdorffii renova sua folhagem anualmente (Pedroni et al., 2002). De acordo com Coley et al. (1985) defesas químicas quantitativas como os taninos possuem alto custo inicial de produção, mas são cumulativas, diminuindo a relação custo/benefício com a idade do órgão. Assim, os taninos aumentam com a idade do órgão e devem representar uma 27

29 estratégia de defesa mais efetiva em plantas com folhas perenes como é o caso de H. stigonocarpa. Ao observar o desenvolvimento ontogenético foliar de C. langsdorffii e H. stigonocarpa deve-se ressaltar também a grande variação inicial no tamanho das folhas. De fato, o tamanho inicial das folhas de H. stigonocarpa é aproximadamente uma ordem de grandeza maior que as folhas de C. langsdorffii. Além disto, a taxa de expansão foliar de H. stigonocarpa durante a primeira semana de desenvolvimento foi aproximadamente 60% maior que C. langsdorffii. Muitos trabalhos indicam que o amadurecimento rápido representa um mecanismo de escape de herbívoros (Kursar & Coley, 1991; Coley e Kursar, 1996; Brene-Arguedas et al., 2006). Assim, folhas com altas taxas de expansão devem ser menos atacadas por insetos herbívoros (Aide & Londoño, 1989). De fato, na ausência de formigas, as folhas de C. langsdorffii foram mais atacadas por insetos herbívoros do que as folhas de H. stigonocarpa (Fig. 10b). Novamente, estes resultados sugerem que as defesas diretas (produção de taninos e o escape temporal) sejam mecanismos de defesa anti- herbívoros mais efetivos em H. stigonocarpa do que em C. langsdorffii. A abundância de insetos herbívoros em C. langsdorffii diminuiu a partir da quarta semana, coincidindo com o período de aumento das concentrações de tanino. De fato, estudos mostram que uma das funções dos taninos pode ser inibir o ataque de insetos devido a redução do valor nutritivo das folhas, além de influenciar a palatabilidade (Fenny, 1970; Coley et al., 1986). A preferência dos herbívoros pelos estágios iniciais de desenvolvimento foliar também já foi evidenciada por outros autores (e.g. Coley e Aide, 1991; Cornelissen & Fernandes, 2001; Kursar & Coley, 2003). Como as folhas jovens apresentam maior qualidade nutricional (Boege & Marquis, 2006) e menor concentração de taninos elas se tornam alvos preferenciais dos herbívoros. 28

30 Os resultados do experimento de exclusão de formigas mostraram que as defesas indiretas foram mais efetivas em C. langsdorffii do que em H. stigonocarpa (Fig. 11a a 11d). A estratégia de desenvolvimento foliar também poderia ser usada para explicar estes resultados. Folhas que apresentam baixa taxa de expansão demandam menores quantidades de nitrogênio para crescimento foliar (Coley et al. 1985), assim, este nutriente poderia ser alocado em maior quantidade nos exudados dos nectários das folhas que apresentam crescimento lento. O nitrogênio é um recurso escasso e limitante para os animais especialmente no Cerrado (Neves et al. 2010). Muitas espécies de formigas utilizam os exudados do NEFs para suprir a deficiência de nitrogênio (Davidson, 1997; Bluthgen & Fiedler, 2004). Além disto, estudos recentes têm demonstrado que disponibilidade de nitrogênio afeta os resultados da interação plantaherbívoro-formiga (Bixenman et al., 2011, Jones & Paine 2012). Neste contexto, é possível que os nectários das folhas de C. langsdorffii secretem néctar mais rico em nitrogênio (provavelmente devido à baixa taxa de crescimento foliar), desencadeando um comportamento mais agressivo das formigas para proteger uma fonte de recurso mais valiosa. Os resultados do experimento de exclusão de formigas também mostraram que a efetividade da defesa biótica tende a diminuir com o amadurecimento foliar. Além disto, observou-se que a riqueza e a abundancia de formigas diminuíram ao longo do tempo. Provavelmente estes resultados estão associados à inativação dos NEFs decorrente do amadurecimento foliar (veja também Bixenman et al., 2011). A atração de formigas por folhas jovens com NEFs ativos é considerada uma importante estratégia de defesa indireta contra a ação de insetos herbívoros em habitats pobres em nutrientes como o Cerrado (Madureira & Sobrinho, 2002; Fernandes et al., 2005). Contudo, este estudo mostra que o resultado da interação planta-herbívoro-formiga pode ser afetada pela estratégia de desenvolvimento ontegenético das folhas. Apesar de não ter sido feito 29

31 testes qualitativos e quantitativos do néctar excretado pelos nectários extraflorais de C. langsdorffii e H. stigonocarpa, existe a possibilidade que variações na taxa de expansão foliar entre espécies afete o comportamento das formigas via qualidade do néctar e o resultado da interação planta-herbívoro-formiga. 30

32 Referências Aide, T.M. & Londoño, E.C. (1989) The Effects of Rapid Leaf Expansion on the Growth and Suvivorship of a LepidopteranHerbivore. Oikos, 55, Almeida, C.I.D, Leite, G.L.D., Rocha, S.L., Machado, M.M.L. & Maldonado, W.C.H. (2006) Fenologia e artrópodes de Copaifera langsdorffii Desf. no Cerrado. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, 8, Bixenmann, R.J., Coley, P.D. & Kursar, T.A. (2011) Is extrafloral nectar production induced by herbivores or ants in a tropical facultative ant plant mutualism? Oecologia, 165, Bluthgen, N & Fiedler, K (2004) Preferences for sugars and amino acids and their conditionality in a diverse nectar-feeding ant community. Journal of Animal Ecology, 73, Boege, K., & Marquis, R. (2005) Facing herbivory as you grow up: the ontogeny of resistance in plants. Trends in Ecology and Evolution, 20, Boege, K., & Marquis, R. (2006) Plant quality and predation risk mediated by plant ontogeny: consequences for herbivores and plants. Oikos, 115, Brene- Arquedas, T., Horton, M.W., Coley, P.D., Lokvan J., Waddell, R.A., Melzoso- O Meara, B.E. & Kursar, T.A. (2006) Contrasting mechanisms of secondary metabolite accumulation during leaf development in two tropical tree species with different leaf expansion strategies. Oecologia, 149, Bryant, J. P., Chapin, F. S. III & Klein, D. R. (1983) Carbon/nutrient balance of boreal plants in relation to vertebrate herbivory. Oikos, 40, Bulhão, C.F., & Figueiredo, P.S. (2002) Fenologia de leguminosas arbóreas em uma área de cerrado marginal no nordeste do Maranhão. Revista Brasileira de Botânica, 25, Carvalho, P.E.R. (2003) Espécies Arbóreas brasileiras / Por Paulo Ernani Ramalho Carvalho. Brasília: Embrapa informação tecnológica; Colombo, PR: Embrapa Florestal, 1, Coley, P.D. & Barone, J.A. (1996) Herbivory and plant defenses in tropical forest. Annual Rewiew of Ecology and Systematics, 27, Coley, P. D., Bryant, J. P. & Chapin, F. S. (1985) Resource availability and plant anti herbivore defense. Science, 230, Coley, P. D., Lokvam, J., Rudolph, K., Bromberg, K., Sackett, T.E., Wright, L., Brenes- Arguedas, T., Dvorett, D., Ring, S., Clark, A., Baptiste, C., Pennington, R.T. & Kursar, T.A. (2005) Divergent defensive strategies of young leaves in two species of Inga. Ecology, 86,

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36 Anexo 1. Abundância de formigas observada em Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa ao longo de sete semanas de amostragem, Minas Gerais, Brasil. Formigas C. langsdorffii H. stigonocarpa Ectatominae Ectatoma turbeculatum 3 1 Formicinae Camponotus crassus Camponotus myrmaphaenus Camponotus rufipes 8 11 Camponotus sp Brachymyrmex sp Myrmicinae Cephalotes pavonni 3 0 Cephalotes pusillus 6 0 Cephalotes sp. 1 0 Crematogaster sp Crematogaster sp Crematogaster sp Nesomyrmex sp Pheidole sp Pseudomyrmecinae Pseudomyrmex palidus 2 0 Pseudomyrmex sp. 0 2 Pseudomyrmex sp Pseudomyrmex sp Total riqueza Total abundância

37 Anexo 2. Abundância de insetos herbívoros observada em Copaifera langsdorffii e Hymenaea stigonocarpa ao longo de sete semanas de amostragem, Minas Gerais, Brasil. Herbívoros C. langsdorffii H. stigonocarpa Coleoptera Aderidae sp Bruchidae sp Bruchidae sp Cerambicidae sp Chrysomellidae sp Chrysomellidae sp Chrysomellidae sp Chrysomellidae sp Chrysomellidae sp Chrysomellidae sp Chrysomellidae sp Chrysomellidae sp Chrysomellidae sp Curculionidae sp Curculionidae sp Curculionidae sp Lagriidae sp Scarabaeidae sp Hemiptera Heteroptera Coreidae sp Coreidae sp Coreidae sp Lygaeidae sp Pentatomidae sp Pyrrhocoridae sp Rhopalidae sp Rhopalidae sp Rhopalidae sp Tingidae sp Homoptera Auchenorrhyncha Aetalionidae sp Cercopidae sp Cicadellidae sp Cicadellidae sp Cicadellidae sp Cicadellidae sp Cicadellidae sp Fulgoridae sp Fulgoridae sp Membracidae sp Membracidae sp Membracidae sp Membracidae sp Sternorrhyncha Psyllidae sp Psyllidae sp Psyllidae sp

38 Psyllidae sp Psyllidae sp Psyllidae sp Ortoptera Acrididae sp Total riqueza Total abundância

39 38