JOSUÉ DO AMARAL RAMALHO

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1 2 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA - UFPB CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS LABORATÓRIO DE ENSAIOS TOXICOLOGICOS JOSUÉ DO AMARAL RAMALHO AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DA CASCA DA RAIZ DE DIOCLEA GRANDIFLORA MART. EX BENTH JOÃO PESSOA - PB 216

2 JOSUÉ DO AMARAL RAMALHO AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DA CASCA DA RAIZ DE DIOCLEA GRANDIFLORA MART. EX BENTH Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, para obtenção do título de Doutor Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos (Farmacologia-Toxicologia). Orientador: Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros Co-orientadora: Profª. Dra. Margareth de Fátima F. Melo Diniz JOÃO PESSOA - PB 216

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4 JOSUÉ DO AMARAL RAMALHO AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DA CASCA DA RAIZ DE DIOCLEA GRANDIFLORA MART. EX BENTH Tese aprovada em: de de 215. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros Orientador Profª. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz Co-orientadora Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida Examinador Interno Profª. Dra. Liana Clébia de Morais Pondeus Examinadora Interna Profa. Dra. Carolina Uchôa Guerra Barbosa de Lima Examinadora Externa Profa. Dra. Lindomar de Farias Belém Examinadora Externa

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6 3 A minha esposa Luciana, por todo amor, cumplicidade e dedicação e as minhas filhas Maria Eduarda, Letícia e Raquel. Dedico.

7 4 AGRADECIMENTOS À Deus pela força e amor demonstrado em minha vida. Aos meus pais, José Ramalho Sobrinho (in memorian) e Isa do Amaral Ramalho por terem acreditado em mim. Aos meus irmãos: Felipe Ramalho de Oliveira Neto (in memorian), pelas palavras: Estuda que o resto é consequência. Moises do Amaral Ramalho, por ser um homem trabalhador. As minhas cunhadas Sandra Ramalho Alves do Amaral e Silvia da Cruz Ramalho. Aos cunhados Rangel da Silva Nunes e Renato da Silva Nunes. As minhas sobrinhas Débora, Rebeca e Luana, ao meu único sobrinho Felipe Ramalho de Oliveira Bisneto (in memorian ). Aos meus sogros, Francisco da Silva Nunes e Terezinha da Silva Nunes, foram eles os principais incentivadores. Ao meu orientador Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros, pela confiança neste trabalho. À minha co-orientadora que é orientadora, Profª Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz, pela admiração e confiança. À querida e batalhadora, Profª Dra. Caliandra Maria Bezerra Luna Lima por sempre me apoiar e cobrar. À minha amiga e bioquímica Kardilândia Oliveira, pelo apoio na construção dos exames laboratoriais. À minha amiga Edla Julinda, pela companhia nas horas de angústia e alegria. À Alexandre Rolim Paz, pelo grande auxílio nos exames histopatológicos.

8 5 Aos funcionários do Biotério/UFPB, José Crispim Duarte e Raimundo Nonato da Silva Filho, pelo importante papel na execução deste trabalho. Aos amigos Liane, Guilherme, Mateus, George, Igor, Ivana, Andressa e Fernanda pelas demonstrações de amizade e importante colaboração durante todo o estudo. Aos meus queridos e amados professores da graduação e momentos de aprendizado. pós-graduação, pelos bons Aos companheiros de pós-graduação, pelos bons momentos compartilhados. A todos que contribuíram de alguma forma para a construção desta importante etapa da minha vida.

9 6 Mas se desejarmos fortemente o melhor e, principalmente, lutarmos pelo melhor... O melhor vai se instalar em nossa vida. Porque sou do tamanho daquilo que vejo, e não do tamanho da minha altura. Carlos Drummond de Andrade

10 7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Rato Wistar Figura 2 - Analisador bioquímico automático Cobas Mira Plus - Roche Figura 3 - Aparelho de Rota-rod Figura 4 - Aparelho de campo aberto... 39

11 8 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Quadro 2 - Quadro 3 - Lista oficial das espécies cujos efeitos terapêuticos foram comprovados cientificamente, conforme a RDC nº17, de 24 de fevereiro de Período de observação Duração mínima dos estudos de toxicidade de Doses Repetidas Sistema de organização, Sendo caixas impares as fêmeas e caixas pares os machos... 42

12 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Consumo de água e ração de ratos, machos e fêmeas, tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda,via oral. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p, Tabela 2 - Parâmetros bioquímicos obtidos do soro de ratos tratados com a dose de 2mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p, Tabela 3 - Parâmetros hematológicos obtidos do soro de ratos tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p, Tabela 4 - Temperatura corporal (ºC) de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Tabela 5 - Efeito da administração crônica de diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) sobre a glicemia dos animais. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Tabela 6 - Consumo semanal de água por ratos Wistar durante os 9 dias de tratamento crônico com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Tabela 7 - Consumo semanal de ração durante os 9 dias do ensaio de toxicidade crônica com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,

13 1 Tabela 8 - Variação da evolução ponderal de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Tabela 9 - Número de Ambulações no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Tabela 1 - Número de execuções de comportamento Rearing (levantar) no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Tabela 11 - Número de execuções de comportamento Grooming (limpeza) no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Tabela 12 - Número de bolos fecais no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Tabela 13 - Tempo de permanência (em segundos) na barra giratória do aparelho Rota rod, de ratos durante o tratamento crônico com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Tabela 14 - Parâmetros bioquímicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Tabela 15 - Parâmetros hematológicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,

14 11 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 - Dosagem de Albumina no soro de ratos tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg), nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p, Gráfico 2 - Gráfico 3 - Gráfico 4 - Gráfico 5 - Gráfico 6 - Gráfico 7 - Dosagem de Fosfatase Alcalina no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg), nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p, Dosagem de Proteínas Totais no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p, Dosagem de Globulina no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Ex. Benth., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p, Dosagem de Hemácias obtida do soro de ratas tratadas com a dose de 2mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg )., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p, Temperatura de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) na segunda temperatura durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Temperatura de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) na segunda temperatura durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,

15 12 Gráfico 8 - Gráfico 9 - Gráfico 1 - Gráfico 11 - Gráfico 12 - Gráfico 13 - Gráfico 14 - Gráfico 15 - Segunda Glicemia de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Terceira Glicemia de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Terceira Glicemia de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Consumo de Água por ratos Wistar machos tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<, Segunda semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Terceira semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Quarta semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Quinta semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,

16 13 Gráfico 16 - Gráfico 17 - Gráfico 18 - Gráfico 19 - Gráfico 2 - Gráfico 21 - Gráfico 22 - Gráfico 23 - Sétima semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Oitava semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Décima primeira semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Consumo de Água por ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<, Segunda semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Sétima semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Oitava semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Nona semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,

17 14 Gráfico 24 - Gráfico 25 - Gráfico 26 - Gráfico 27 - Gráfico 28 - Gráfico 29 - Gráfico 3 - Gráfico 31 - Décima semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Décima primeira semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Décima segunda semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Consumo de Ração por ratos Wistar machos tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<, Terceira semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Quarta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Quinta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Sexta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,

18 15 Gráfico 32 - Gráfico 33 - Gráfico 34 - Gráfico 35 - Gráfico 36 - Gráfico 37 - Gráfico 38 - Gráfico 39 - Setíma semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Nona semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Décima semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Décima primeira semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Décima segunda semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Consumo de Ração de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<, Segunda semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Quinta semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 7

19 16 Gráfico 4 - Gráfico 41 - Gráfico 42 - Gráfico 43 - Gráfico 44 - Gráfico 45 - Gráfico 46 - Gráfico 47 - Sétima semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Oitava semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Nona semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Décima primeira semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Evolução ponderal de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Quinta semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Sexta semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Setíma semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,

20 17 Gráfico 48 - Gráfico 49 - Gráfico 5 - Gráfico 51 - Gráfico 52 - Gráfico 53 - Décima primeira semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Décima segunda semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Gráfico 54 - Número de execuções de comportamento Ambulação no experimento de campo aberto de ratos Wistar fêmeas tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Gráfico 55 - Número de execuções de comportamento Rearing (levantar) no experimento de campo aberto de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 8

21 18 Gráfico 56 - Gráfico 57 - Gráfico 58 - Gráfico 59 - Gráfico 6 - Gráfico 61 - Gráfico 62 - Número de execuções de comportamento Rearing (levantar) no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Número de execuções de comportamento Grooming (limpeza) no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Número de execuções de comportamento Defecação no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p, Tempo de Permanência (em segundos) na barra giratória do Rota Rod de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Tempo de Permanência (em segundos) na barra giratória do Rota Rod de ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<, Dosagem de glicose em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de creatinina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,

22 19 Gráfico 63 - Gráfico 64 - Gráfico 65 - Gráfico 66 - Gráfico 67 - Gráfico 68 - Gráfico 69 - Dosagem de Aspartato Transaminase (AST) em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de Alanina Aminotransferase (ALT) em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de LDH em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de proteínas totais em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de albumina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de globulina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de proteínas totais em ratas Wistar tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 9

23 2 Gráfico 7 - Gráfico 71 - Gráfico 72 - Gráfico 73 - Dosagem de globulinas em ratas Wistar tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de hemácias obtidas do sangue de ratos tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=2). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de hematócritos obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de Volume Corpuscular Médio (VCM ) obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Gráfico 74 - Dosagem de CHCM obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Gráfico 75 - Gráfico 76 - Dosagem de Leucócitos obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de hemácias obtidas do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=2). One-way ANOVA/ Turkey, p<,

24 21 Gráfico 77 - Gráfico 78 - Dosagem de Volume Corpuscular Médio (VCM) obtidos do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<, Dosagem de HCM obtidos do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,

25 22 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária AST - Aspartato Amino Transferase ALT - Alanina Amino Transferase CEME - Central de Medicamentos CK - Creatina Quinase CNS - Conselho Nacional de Saúde CPK - Creatina Fosfoquinase CHCM - Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média EEBCRDg - Extrato Etanólico Bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético FAL - Fosfatase Alcalina HULW - Hospital Universitário Lauro Wanderley HCM - Hemoglobina Corpuscular Média IPeFarM - Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos LDH - Lactato Desidrogenase LABETOX - Laboratório de Ensaios Toxicológicos MS - Ministério de Saúde NOEL - Dose sem observação de efeitos tóxicos NOAEL - Maior dose administrada num estudo de toxicidade na qual não se observa nenhum efeito adverso OMS - Organização Mundial de Saúde RDC - Resolução da Diretoria Colegiada SUS - Sistema Único de Saúde VCM - Volume Corpuscular Médio HCM - Hemoglobina corpuscular média CHCM - Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média

26 23 RESUMO RAMALHO, Josué do Amaral. Avaliação da toxicidade aguda e crônica do extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora Mart. ex Benth f. (Tese). Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos -PPgDITM. Introdução: A Dioclea grandiflora, conhecida como Mucunã de caroço, atua sobre o Sistema Nervoso Central, doenças da próstata e pedras nos rins. Objetivo: Avaliação toxicológica não clínica aguda e crônica do extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora, com base na Instrução Normativa nº4, de 18 de junho de 214 da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Metodologia: Para ambas as metodologias foram utilizados ratos Wistar, ambos os sexos, com a administração do extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora (EEBCRDg), via oral. Na toxicidade aguda, utilizou-se um grupo tratado com a dose 2 mg/kg e um grupo controle (veiculo). Após a administração, observou-se os parâmetros de comportamento por 3, 6, 9, 12, 18 e 24 minutos, consumo de ração e água diariamente, evolução ponderal semanal e parâmetros hematológicos e bioquímicos, após os 14 dias da administração da dose única. O número de sobreviventes contabilizados para determinar a DL5. Para a toxicidade crônica os animais foram tratados por via oral (v.o) com as doses de 1, 5 e 25 mg/kg do EEBCRDg e um grupo controle, durante 9 dias. Foram analisados o consumo de água e ração, temperatura, glicemia, evolução ponderal, testes comportamentais tais como, rota rod e campo aberto, parâmetros bioquímicos e hematológicos e anatomopatológicos. Resultados: Na toxicidade aguda houve aumento estatisticamente significativo no consumo de água e ração para ambos os sexos. Aumento da albumina dos machos, nas fêmeas reduziu a fosfatase alcalina, proteína total e globulinas. Diminuiu o número de hemácias nas fêmeas. Na toxicidade crônica houve aumento na temperatura dos machos e diminuição das fêmeas, diminuição da glicemia em ambos os sexos, diminuiu o consumo de água e ração nos machos, aumento e diminuição da água e ração nas fêmeas, aumento e diminuição da evolução ponderal para ambos os sexos, para o teste corportamental campo aberto, aumentou a ambulação nas fêmeas, aumentou o levantar em ambos os sexos, aumento da limpeza nas fêmeas, diminuiu a quantidade de bolos fecais nas fêmeas. Para os parâmetros bioquímicos houve diminuição da glicose e albumina, aumento da creatinina, AST, ALT, LDH, Proteínas totais, albumina e globulina para os machos, aumento nas proteínas totais e globulina nas fêmeas. Para os parâmetros hematológicos houve aumento das hemácias, hematócrito, leucócitos e diminuiu o VCM e CHCM nos machos, nas fêmeas aumentou hemácias, diminuiu VCM e HCM. Apresentando infiltrado inflamatório nos pulmões dos machos. Conclusão: De acordo com os resultados obtidos o EEBCRDg apresentou uma toxicidade considerável, sendo necessárias maiores investigações para atestar a segurança de seu uso. Palavras-chave: Dioclea grandiflora. Toxicidade. Anatomopatológico.

27 24 ABSTRACT RAMALHO, Josué do Amaral. Evaluation of acute and chronic toxicity of crude hydroalcoholic extract from the bark of Dioclea grandiflora mart root. ex benth f. (Tese). Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos -PPgDITM. Introduction: Dioclea grandiflora, known as stone Mucunã, acts on the Central Nervous System, diseases of the prostate and kidney stones. Objective: Toxicology Assessment Acute and chronic nonclinical crude hydroalcoholic extract from the bark of Dioclea grandiflora, based on normative Statement 4, 18 June 214 national health surveillance agency (ANVISA). Methodology: For both methodologies were used Wistar rats, both sexes, with the administration of ethanolic extract of the root bark of Dioclea grandiflora (EEBCRDg), orally. On acute toxicity, a group treated with 2 mg/kg dose and a control group (forward). After administration, the parameters of behaviour for 3, 6, 9, 12, 18 and 24 minutes feed intake and water daily, weekly and haematological parameters by evolution and biochemists, after 14 days of administration of a single dose. The number of survivors recorded to determine the LD5. For chronic toxicity the animals were treated orally (v) with the doses of 1, 5 and 25 mg/kg of EEBCRDg and a control group, during 9 days. We analyzed the water and feed consumption, temperature, blood glucose, weight evolution, behavioural tests such as, rod and the open route, biochemical and Hematological and pathological. Results: In acute toxicity there was statistically significant increase in the consumption of water and feed for both sexes. Increased albumin of males, females reduced alkaline phosphatase, total protein and globulins. Decreased the number of red blood cells in females. In chronic toxicity an increase in temperature of males and females decreased, decreased blood glucose levels in both sexes, decreased water consumption and feed in males, increase and decrease of water and rations in females, increased and decreased by evolution for both sexes, for the corportamental open field test, increased the body postures when walking in females, increased the lift in both sexes, increased cleaning in females, decreased the amount of faecal cakes in females. For the biochemical parameters there was decrease of glucose and albumin, increased creatinine, AST, ALT, LDH, total protein, albumin and globulin for males, an increase in total protein and immunoglobulin in females. Haematological parameters increased red blood cells, hematocrit, leukocytes and decreased the VCM and MCHC in males, females increased, decreased red blood cells MCV and MCH. Showing inflammatory infiltrate in the lungs of males. Conclusion: According to the results of the EEBCRDg presented a considerable toxicity, and required further investigation to attest to the safety of its use. Keywords: Dioclea grandiflora. Toxicity. Pathology.

28 25 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Considerações Gerais Resoluções Toxicidade OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAIS E MÉTODOS Local da Pesquisa Materiais Material botânico Animais Ratos Wistar Aparelhagem Metodologia Ensaio toxicológico não clínico agudo Análise laboratorial do sangue Parâmetros hematológicos Parâmetros bioquímicos Ensaio toxicológico não clínico crônico Temperatura Glicemia Consumo de água e alimento e avaliação ponderal Avaliação comportamental (Teste do Campo Aberto) e Motora (Teste no Rota-rod) Avaliação laboratorial do sangue Exame anatomopatológico RESULTADOS Ensaio Toxicológico Não-Clínico Agudo... 45

29 Avaliação comportamental Evolução ponderal Consumo de água e alimentos Análise laboratorial do sangue Análise bioquímica Análise hematológica Ensaio Toxicológico Não-Clínico Crônico Temperatura Glicemia Consumo de água e ração Variação da evolução ponderal Avaliação comportamental Teste no campo aberto Teste no Rota Rod Análise laboratorial do sangue Parâmetros bioquímicos Parâmetros hematológicos Estudo anatomopatológico DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 17

30 27 1 INTRODUÇÃO No Brasil, a mata atlântica é o terceiro maior bioma, depois da Amazônia e do Cerrado. Cobria originalmente uma área de km2, correspondendo a cerca de 16% do território brasileiro, distribuída por 17 estados: Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Goiás, Mato Grosso do Sul, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Espírito Santo, Bahia, Alagoas, Sergipe, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Ceará e Piauí (Conservation International do Brasil 2) (FERREIRA, 214). Cerca de 82% da população brasileira utiliza produtos à base de plantas medicinais nos seus cuidados com a saúde, seja pelo conhecimento da medicina tradicional indígena, quilombola, entre outros povos e comunidades tradicionais, seja pelo uso popular, de indicação verbal entre gerações, ou nos sistemas oficiais de saúde (OMS 28). A Organização Mundial de Saúde (OMS), visando diminuir o número de excluídos dos sistemas governamentais de saúde, recomenda aos órgãos responsáveis pela saúde pública de cada país que: procedam a levantamentos regionais das plantas usadas na medicina popular tradicional e identifiquem-nas botanicamente; estimulem e recomendem o uso daquelas que tiverem comprovadas sua eficácia e segurança terapêutica; desaconselhem o emprego das práticas da medicina popular consideradas prejudiciais; desenvolvam programas que permitam cultivar e utilizar as plantas selecionadas na forma de preparações dotadas de eficácia, segurança e qualidade (OMS 28). As plantas medicinais correspondem às mais antigas armas empregadas pelo homem no tratamento de enfermidades de todos os tipos, ou seja, a utilização de plantas na prevenção e/ou na cura de doenças é um hábito que sempre existiu na história da humanidade (MORAES; SANTANA, 21). Sendo que o homem dependia fundamentalmente da natureza para sua sobrevivência. No decorrer da história da humanidade, vários povos desenvolveram conhecimentos acerca da cura, utilizando-se principalmente das plantas e recursos minerais. Todas as culturas sempre buscaram estratégias que lhes permitissem desenvolver seus próprios sistemas e técnicas de uso do mundo vegetal (ALBUQUERQUE 22; MOREIRA et al., 22). Entretanto, a total aceitação de drogas derivadas de plantas e a fitoterapia na medicina científica só poderão ocorrer se estes produtos cumprirem os mesmos critérios de eficácia, segurança e controle de qualidade que os produtos sintéticos (Rates, 21), ou seja, os produtos derivados de plantas devem ter eficácia avaliada e confirmada, assim como deve ser

31 28 garantida que sua administração a organismos vivos ocorra sem riscos para sua saúde (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 25). No Brasil as fases de um estudo toxicológico não-clínico estão bem definidas atualmente. Uma das normas que regulamentam este estudo é a Resolução RDC nº 26, de 13 de maio de 214, que dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Esta resolução determina que os ensaios de toxicologia não-clínica deverão seguir a Instrução Normativa n 4 de 18 de junho de 214 que preconiza seguir como parâmetros mínimos o Guia para a condução de estudos não clínicos de toxicologia e segurança farmacológica necessária ao desenvolvimento de medicamentos (BRASIL, 213e). O objeto do estudo foi avaliar a toxicidade não-clínica agudo e crônico do Extrato Etanólico da casca da raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg), por via oral, seguindo o Guia para a condução de estudos não clínicos de toxicologia e segurança farmacológica necessária ao desenvolvimento de medicamentos (BRASIL, 213e), conforme a IN 4/214 (ANVISA). A Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae), popularmente conhecido como "mucuna", "mucuna -de- caroço" e "olho-de -boi", é uma planta trepadeira que cresce na caatinga e cerrado, regiões do Nordeste do Brasil. De acordo com a tradição popular, a casca das sementes desta planta e das raízes têm sido amplamente utilizada para tratar doenças da próstata e as pedras nos rins (LIMA, 1989). Estudos fitoquímicos mostraram a presença de várias substâncias na Dioclea grandiflora, tais como o flavanonas paraibanol, agrandol e diosalol (JENKINS et al., 1999), dioclein, dioflorin, diidroflavonol, dioclenol (BHATTACHARYYA et al., 1995, 1997, 1998), isolado a partir do clorofórmio (CHCI3) porção solúvel do extrato de casca da raiz desta planta. Investigações anteriores evidenciaram uma atividade significativa do SNC do extrato de etanolico obtido a partir da casca da raiz seca (BATISTA et al., 1995), e do extrato hidroalcoólico a partir das sementes de Dioclea grandiflora (ALMEIDA et al., 23). O seu principal constituinte, diocleina, tem um efeito analgésico significativo em roedores (BATISTA et al., 1995) e um efeito vaso relaxante no endotélio da aorta de rato (LEMOS et al., 1999). A triagem farmacológica também revelou a atividade antinoceptiva de dioclenol e dioflorin em camundongos (ALMEIDA et al., 2). Um estudo foi realizado com uma outra parte da planta, as vagens, e relatou uma atividade antinoceptiva eficaz em camundongos (SÁ et al., 21). Uma espécime registrada sob o número 444, e depositado no Herbário Lauro Pires Xavier da Universidade Federal da Paraíba (UFPB ).

32 29 Os testes toxicológicos não-clínicos foram desenvolvidos levando-se em consideração aquilo que preconiza a legislação brasileira de fitoterápicos. Os ensaios de toxicidade aguda foram realizados durante um período de 14 dias, via oral, utilizando-se ratos Wistar, submetidos a uma única dose de 2 mg/kg do extrato e foram avaliados parâmetros comportamentais, evolução ponderais, parâmetros hematológicos e bioquímicos. Os ensaios de toxicidade crônica foram realizados com ratos Wistar, em um período de 9 dias de exposição à substância avaliada. Foram utilizadas três diferentes doses: 1, 5 e 25 mg/kg e os animais foram avaliados sob diferentes aspectos como: consumo de água e ração, evolução ponderal, temperatura corporal, avaliação glicêmica, testes comportamentais, tais como: rota Rod e campo aberto, parâmetros bioquímicos, parâmetros hematológicos e anatomopatológicos. 1.1 Considerações Gerais Resoluções A publicação da primeira edição da Farmacopéia Brasileira, em 1929, foi o primeiro ato normativo e o mais expressivo e importante com referência a plantas medicinais no Brasil. Foi elaborada por Rodolfo Albino durante doze anos e contemplava mais de 28 espécies botânicas brasileiras e estrangeiras contendo as monografias a serem utilizadas como referência nos aspectos de controle de qualidade na preparação de medicamentos (MARQUES, 23). No Brasil, as normas que regiam os ensaios toxicológicos de novos produtos, constantes da Resolução Normativa nº 1/78 da Câmara Técnica de Medicamentos do Conselho Nacional de Saúde, contém informações de caráter geral sobre os testes a serem realizados (CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE, 1978), não especificando, porém, como realizá-los e interpretá-los convenientemente. Em 1983, O Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais (PPPM) foi estabelecido pela Central de Medicamentos-CEME, órgão do MS criado pelo Decreto nº 68.86, de 25 de junho de 1971, responsável pela distribuição de medicamentos. O PPPM foi estruturado com o objetivo de promover a pesquisa científica das propriedades terapêuticas potenciais das espécies vegetais utilizadas pela população, mirando o futuro desenvolvimento de medicamentos ou preparações que sirvam de suporte para o estabelecimento de uma

33 3 terapêutica alternativa, considerando, inclusive, sua integração ao Relatório Nacional de Medicamentos Essenciais-RENAME Naquela ocasião foram selecionadas 74 espécies para o desenvolvimento de estudos, entre elas, 17 nativas. O PPPM possibilitou o desenvolvimento de pesquisas que levaram à comprovação da eficácia terapêutica de Espinheira santa Maytenus ilicifolia (SANT ANA; ASSAD, 24). Em 1983 a CEME constituiu a Comissão de Ensaios Pré-clínicos e Clínicos, através da portaria nº 14 de 29/12/82 (CEME, 1983b), destinada a elaborar protocolo detalhado de pesquisa integrada, baseada no conjunto de plantas definido pela Comissão de Seleção de Plantas. Este protocolo conteve especificação a nível de bateria de testes a ser executada por classe terapêutica do elenco de plantas, selecionado para estudo sistemático e completo. Em 1988 a Resolução nº 1/88 do Conselho Nacional de Saúde (CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE, 1988), aprovou Normas de Pesquisas em Saúde. Nesta resolução, define-se por pesquisa farmacológica as atividades científicas de estudos de medicamentos e produtos biológicos para uso em seres humanos, a respeito dos quais não se tenha experiência prévia no país, que não tenham sido registrados pelo Ministério da Saúde e, portanto, não sejam distribuídos em forma comercial, bem como os medicamentos registrados e aprovados para venda, quando se pesquisa seu uso com modalidades, indicações, doses ou vias de administração diferentes daquelas estabelecidas, incluindo seu emprego em combinações. A Resolução nº 1/88 ainda define as exigências da pesquisa pré-clínica e as fases para pesquisa clínica (fases I, II, III, IV) que somente deveria ser iniciada mediante expressa autorização do Comitê de Ética da instituição de atenção à saúde, devidamente credenciado pelo Conselho Nacional de Saúde. A extinção da CEME em 1997, sem dúvida, representou uma perda para os estudos e pesquisas sobre plantas medicinais no país (SANT ANA; ASSAD, 24). No início de 1995, foi publicada a Portaria nº 6 da ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária, de 31 de janeiro de 1995, onde foram apresentadas as principais exigências para a concessão do Registro do produto fitoterápico tais como: A) Apresentar estudos científicos que comprovem a segurança e a eficácia terapêutica do produto fitoterápico, de acordo com as exigências estipuladas na Resolução 1/88 do Conselho Nacional de Saúde- CNS: - Toxicologia pré-clínica. - Toxicologia clínica.