MICROCÁPSULAS DE QUITOSANA E HIDROXIAPATITA

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1 1 MICROCÁPSULAS DE QUITOSANA E HIDROXIAPATITA M. C. Melo (1), B. D. Carraro (1), K. C. Garcia (2), E. C. S. Rigo (3), A O Boschi (1) (1) DEMa/Biolab, Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) (2) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Departamento de Fármacos e Medicamentos, UNESP, Rodovia Araraquara/Jaú Km 1 - CP 502, (0xx- 16) , Araraquara - S.P. (UNESP) (3) Programa Pós Graduação-Engenharia e Ciência dos Materiais (USF) kellecgarcia@yahoo.com.br RESUMO Os fosfatos de cálcio, em especial a hidroxiapatita (HA), já são utilizados como biomateriais, e, mais recentemente, polímeros de origem natural estão sendo pesquisados. Dentre esses polímeros, a quitosana (QS), polissacarídeo derivado da quitina, encontrada em abundância em crustáceos, apresenta como fator de interesse seu caráter básico, atribuído à presença do grupamento amina em unidades repetidas, e a biocompatibilidade, demonstrando assim um grande potencial para sua utilização como um biomaterial em diversas aplicações, inclusive na odontologia. A combinação da quitosana e hidroxiapatita na forma de microcápsulas biodegradáveis parece ser uma interessante rota para regenerações ósseas, visto que a quitosana também demonstra ter um caráter de osteocondução. No presente trabalho, microcápsulas de QS contendo HA foram preparadas e caracterizadas mediante a utilização de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia no infravermelho (IV). O pó de HA foi incorporado e uniformemente distribuído nas microcápsulas de QS. Palavras-chave: Microcápsulas, quitosana, fosfato de cálcio, hidroxiapatita. INTRODUÇÃO É desafio constante da ciência e da tecnologia criar mecanismos que melhorem a qualidade de vida da população em todos os seus aspectos. Dentro deste

2 2 contexto, os desafios relacionados ao desenvolvimento e aprimoramento dos biomateriais vêm recebendo destaque e muita importância ao longo desses anos. Dentre as inovações tecnológicas apresentadas, a microencapsulação tem despertado grande interesse, uma vez que este processo permite aplicar finos revestimentos a partículas sólidas, líquidas e dispersões, permitindo revestimentos que variam de décimos de mícron em diâmetro até 5000 microns, além de poder liberar seu conteúdo sob velocidade e condições especificas ( 1 ). Na técnica de microencapsulação o grande diferencial está no tamanho das partículas, no seu uso, na adaptação e na variedade de formas e produtos ( 2 ). A capacidade de retenção nas microcápsulas está associada principalmente ao estado físico do material de revestimento e às suas propriedades físico-químicas como peso molecular, conformação molecular e funcionalidade química ( 3 ). Vários polímeros podem ser utilizados como materiais de revestimento em processos de microencapsulação. Atualmente, encontram-se em destaque, o aproveitamento de polímeros biodegradáveis naturais, que apresentam baixo custo, baixa toxicidade e fácil obtenção, tais como os polissacarídeos como a quitosana, o alginato, a celulose, o amido e a pectina ( 4 ). A quitosana é um polissacarídeo derivado da desacetilação da quitina. A quitina é encontrada naturalmente na parede celular de fungos, leveduras, insetos e crustáceos ( 5 ). A reatividade dos grupos funcionais da quitosana conferem propriedades adequadas principalmente para sua utilização em técnicas de ( ) microencapsulação 6 ; além disso, a quitosana apresenta características farmacológicas, e de regeneração tecidual e óssea ( 7 ). Recentemente microcápsulas contendo fármacos e/ou materiais osteocondutores, estão recebendo grande atenção como coadjuvantes no tratamento de periodontopatias ( 8 ). Um biomaterial que apresenta um grande potencial como substituto ósseo, devido a sua biocompatibilidade, são as biocerâmicas de fosfato de cálcio, visto que o osso humano é composto por sais de fosfatos de cálcio e colágeno; elas demonstram ser uma alternativa viável para o tratamento ortopédico e odontológico. Os compostos inorgânicos sintéticos como a hidroxiapatita e o fosfato tricálcico, têm sido aplicados como materiais de preenchimento, espaçadores e substitutos para os enxertos ósseos, devido principalmente a sua bioatividade e característica de osteocondução em relação ao tecido hospedeiro. A aplicação biomédica da

3 3 hidroxiapatita pura (HA) é limitada devido a sua fragilidade; e dessa forma, diversos estudos envolvem a modificação da HAp com polímeros como ácido polilático, colágeno, quitosana e polietileno ( 9 ). O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento e a caracterização de um biomaterial, na forma de microcápsulas biodegradáveis de quitosana com pectina (PC) contendo hidroxiapatita, objetivando seu uso como material osteocondutor. MATERIAIS E MÉTODOS Purificação da quitosana (QS) Na etapa de purificação da quitosana, de origem comercial, pesou-se uma quantidade do material ao qual foi adicionado uma solução de ácido clorídrico 0,1M, sob agitação constante. Em seguida essa dispersão foi filtrada a vácuo e ao material obtido foi adicionado uma solução de NaCl 1M para precipitação da QS, a qual foi novamente filtrada. A QS pura obtida foi congelada por 24 horas; após esse período foi liofilizada por mais 24 horas e novamente pesada. Determinação do grau de desacetilação (GD) Neste trabalho o GD da QS foi determinado pelo método de primeira derivada na região de UV de acordo com o método descrito por ( 10 ). Para este ensaio a quitosana purificada e a N-acetil-glucosamina (NAG) foram dispersas em ácido acético (0,01; 0,02 e 0,03 M) com o objetivo de verificar a interferência deste solvente no espectro de absorção das amostras. Para determinação do GD da amostra QS foi necessária a obtenção da curva padrão da NAG. Método de preparação das microcápsulas QS:PC Sendo a QS um policátion e a pectina (PC) um poliânion, as microcápsulas foram preparadas por coacervação, complexação e gelificação. Neste processo dois colóides de cargas opostas se neutralizam, formando um precipitado insolúvel ( 11 ). Duas dispersões foram preparadas: uma solução aquosa de PC 1,5% e ph 5,0 e

4 4 outra QS 0,5% em ácido ácetico 0,1M e ph 4,8. Utilizou-se uma seringa de 10 ml com agulha de 250µm de diâmetro interno para o gotejamento da produção das microcápsulas. As microcápsulas foram mantidas em agitação magnética constante por um periodo de 2 horas, para completa reticulação do sistema. Após esse período foram filtradas, lavadas com água e congeladas em nitrogênio líquido. As microcápsulas foram mantidas congeladas por 24 horas e posteriormente foram liofilizadas por mais um período de 24 horas. Obtenção do pó de hidroxiapatita O pó de hidroxiapatita (HA) foi obtido por precipitação química mediante a reação entre ácido ortofosfórico e hidróxido de cálcio de acordo com metodologia adotada por Rigo ( 12 ). Para a execução desse trabalho adotou-se um pó com tamanho de partículas passante em malha 80 (<0,177mm). Obtenção das microcápsulas de QS:PC:HA O pó de HA, na concentração de 2%, foi adicionado na dispersão de PC durante o processo de obtenção das microcápsulas descrito anteriormente. Caracterização por espectroscopia no infravermelho (IV) As microcápsulas de quitosana contendo ou não o pó de hidroxiapatita foram desaglomeradas em almofariz de ágata para o preparo de pastilhas com KBr para a análise em um espectroscopia no infravermelho Perkin Elmer Spectrum GX FT-IR System. Caracterização por microscopia eletrônica de varredura (MEV) As microcápsulas de quitosana contendo ou não o pó de hidroxiapatita foram fixadas a um suporte metálico e revestidas com ouro para análise morfológica. As imagens e microanálises referentes aos substratos em questão foram obtidas de um microscópio eletrônico de varredura modelo Zeiss DSM 940-A.

5 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES Grau de desacetilação (GD) A determinação do grau de desacetilação da quitosa foi realizada mediante o método de primeira derivada de espectrometria na região do UV (10). De acordo com a metodologia adotada, obteve-se um valor médio do GD de 82% Esse resultado de GD está de acordo com valores obtidos por outros pesquisadores (10), ( 13 ). Caracterização por espectroscopia no infravermelho (IV) O espectro no infravermelho das amostras de QS:PC com e sem HA são apresentados nas figuras 1a e 1b respectivamente. As bandas principais para o espectro da QS (Figura 1a) são: 1650 cm -1, correspondente a amida I, 1560 cm -1, relacionada a amida II, 1070 cm -1 e 1030 cm -1, devido ao estiramento C-O, próximo a 3470 cm -1, estiramento O-H, e 1380 cm -1 devido ao grupo CO-N (7). A Figura 1b apresenta o espectro da amostra QS:PC com HA, a banda na região de 1650 cm -1, correspondente a amida I e a banda na região de 1560 cm -1, relacionada a amida II estão presentes, porém não tão intensas quanto na Figura 1a.Esse espectro apresenta as bandas características da HA, bandas próximas a região de 600 cm -1 e 1100 cm -1 correspondem às vibrações dos grupos PO 3-4. A banda larga na região de 3500 cm é característica de molécula de água estrutural ou adsorvida na amostra. Banda estreita na região de 3570 cm -1 se deve aos íons OH - estruturais.

6 a) 60 % Transmitância Número de onda (cm -1 ) 80 b) 70 % Transmitância Número de onda (cm -1 ) Figura 1.: a)espectroscopia no infravermelho da cápsula de QS:PC e b) espectroscopia no infravermelho da cápsula de QS:PC com HA.

7 7 Caracterização por microscopia eletrônica de varredura (MEV) A forma esférica das cápsulas depende da viscosidade da dispersão da PC, da altura e velocidade do gotejamento e também do diâmetro da agulha, podendo apresentar uma deformidade do tipo cauda. Independente das condições de obtenção das microcápsulas (Figura 2a), elas apresentaram uma superfície rugosa (Figura 2b). O pó de HA, na concentração de 2%, foi adicionado na dispersão de PC durante o processo de obtenção das microcápsulas. Mediante as micrografias apresentadas na figura 3a e 3b, observa-se que a distribuição do pó foi homogênea. A superfície dessas microcápsulas apresentou uma superfície rugosa, porém foi possível observar a presença de partículas de forma arredondada caracterizando a presença do pó de HA, observado também mediante análise por EDS indicando a presença dos íons Ca e P (Figura 3c). a) b) Figura 2.: Microscopia eletrônica de varredura das microcápsulas de QS:PC; a) as diferentes formas obtidas durante a etapa de gotejamento; b) morfologia da superfície. De acordo com Granja e colaboradores (7), aumentando-se a concentração em massa de pó de HA as características morfológicas das microcápsulas sofrem alteração. Em seu trabalho quando utilizou uma concentração de 30% a superfície

8 8 da microcápsula apresentou uma morfologia lisa, além de uma maior homogeneidade na distribuição das partículas do pó de HA nas microcápsulas. a) b) cps 20 c) Ca P 5 Cl Ca Energy (kev) Figura 3.: Microscopia eletrônica de varredura das microcápsulas de QS:PC com HA; a) microcápsula; b) morfologia da superfície; c) microanálise por espectroscopia por energia dispersiva.

9 9 CONCLUSÕES De acordo com metodologia adotada foi possível a obtenção de microcápsulas de QS:PC. A morfologia das microcápsulas é afetada principalmente na etapa de gotejamento durante a obtenção das mesmas. As microcápsulas obtidas apresentaram um tamanho médio de aproximadamente 2mm de diâmetro. O pó de HA foi incorporado de maneira homogênea. Os resultados obtidos mostram-se promissores para a utilização das microcápsulas como possíveis materiais osteocondutores, porém são necessários mais estudos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. R.F. Sparks, Microencapsulation. Kirk-Othmer.Encyclopedia of Chemical Technology, 3ed.John Willey and Sons, New York, v.15, p F. Shahidi, X.Q. Han, Food science and nutrition, 33(6): , C. Whorton, G. A.Reineccius. Eds., American Chemical Society, Washiton, DC, p , K. M. N. C Canella., R. B. Garcia, Química Nova, vol. 24, 13-17, G. Borchard, H. E. Junginger. Adv. Drug Delivery.rev,. v.52, p.103, J. Karlsen, Manuf. Chem., vol. 62, 18-19, P.L. Granja, A. I. N. Silva, J. P. Borges, C. C. Barrias, I. F. Amaral, Key Engineering Materials, 254-2: American Academy of Periodontology, Ann Periodont., Chicago, V. 4, 1-6, F. Chen, Z. C. Wang, C. J. Lin, Materials Letters, 57, , S. C. Tan, E. Khor, T. K. Tan, Talanta 45, , K. Petrak, J. Bioactive and Compatible Polymers, 1, , E. C. S. Rigo, Dissertação de Mestrado, DEMa UFSCar, R. M. Lucinda-Silva, R. C. Evangelista, Journal of Microencapsulation, 20, , 2003.

10 10 CHITOSAN AND HYDROXYAPATITE MICROENCAPSULATION ABSTRACT Calcium phosphates, mainly hydroxyapatite (HA), are already used as biomaterials, and, more recently, natural polymers have been researched. Among those polymers, chitosan (CS), a polysaccharides from chitin, found in abundance in crustaceans, presents as interesting factor its basic character, due to the presence of amina groups in repeted units, and its biocompatibility,showing a great potential to application as biomaterial, even in odontology. The combination of chitosan and hydroxyapatite in biodegradable microcapsules seems to be an interesting route to bone regeneration, as chitosan also presents osteoconduction character. In this work, microcapsules of chitosan with hydroxyapatite were prepared and characterized by scanning electronic microscopy (SEM) and spectroscopy in infrared (IR). The HA powder were incorporated and uniformily distributed in microcapsules of chitosan. Key-words: Microcapsules, chitosan, calcium phosphates, hydroxyapatite.