IMPLANTE DE PROTEÍNA MORFOGENÉTICA DO OSSO (RHBMP-2) EM ARCABOUÇO DE OSSO INORGÂNICO NO TECIDO SUBCUTÂNEO DE RATO

Transcrição

1 IMPLANTE DE PROTEÍNA MORFOGENÉTICA DO OSSO (RHBMP-2) EM ARCABOUÇO DE OSSO INORGÂNICO NO TECIDO SUBCUTÂNEO DE RATO BONE MORPHOGENETIC PROTEIN (RHBMP-2) S IN BONE INORGANIC SCAFFOLD IMPLANTED AT RAT S SUBCUTANEOUS TISSUE Antonio Lucindo Bengtson 1, Eliza Maria Galvão Bengtson 2, Camilla Regina Galvão Bengtson 3, Nadya Galvão Bengtson 4, Ângelo Sementilli 5. RESUMO No presente trabalho foi avaliada a reação histológica de Proteína Morfogenética do Osso recombinante humana (rhbmp-2) em arcabouço de osso mineral natural desnaturado, extraído do fêmur de vitelo, e implantado em tecido subcutâneo de rato. Foram empregados 16 ratos, fornecidos pelo Biotério da Faculdade de Veterinária da Universidade Metropolitana de Santos. Os animais foram anestesiados e no dorso realizada uma incisão com divulsão do tecido subcutâneo onde foram implantadas rhbmp-2 em arcabouço inorgânico. Decorridos sete, 21, 40 e 112 dias após o implante, os animais em número de quatro para cada período foram novamente anestesiados, incisionados e removidas as peças contendo os implantes, os quais foram submetidos a processamento histológico de rotina. Os cortes obtidos de 5 µm foram corados em hematoxilina e eosina para estudo microscópico. Os resultados histológicos evidenciaram que na fase inicial há formação de processo inflamatório agudo identificado pelo exsudato de neutrófilos e depósito de fibrina. Nos períodos finais do experimento notouse neovascularização de maior intensidade, os implantes foram parcialmente reabsorvidos e o tecido subcutâneo circundante apresentava aspecto de normalidade o que evidenciou a biocompatibilidade dos implantes. A capacidade indutora de diferenciação celular da rhbmp- 2 foi inibida. Palavras-Chave: Arcabouço ósseo bovino, rhbmp-2, Rato. 1 Prof. Tit. Dr. UNIMES. Doutor em Odontopediatria pela USP. 2 Aluna do Dpto. de Zootecnia do Centro de Ciências Agrárias, UFV. 3 Mestranda em Dentística Operatória na Faculdade de Odontologia da USP. 4 Profa. Assistente, UNIMES. Mestre em Odontopediatria pela Faculdade de Odontologia da USP 5 Prof. Tit. UNIMES e Prof. Assistente da Disciplina de Fisiopatologia da UNILUS.

2 Bengtson, A.L. et al. 138 ABSTRACT The propose of this study was to evaluate the histologic reaction of the Bone Morphogenetic Protein recombinant human (rhbmp-2) delivered in natural mineral bone scaffold, extracted in the calf s femur and implanted in rats subcutaneous tissue. Sixteen rats came from Faculdade de Veterinária da Universidade Metropolitana de Santos. The animals were anaesthetized and a dorsal incision and subcutaneous tissue divulsion were realized and a rhbmp-2 delivered in inorganic scaffold was implanted. After the implant, the animals were anaesthetized and incisioned again. The implants were removed at intervals of 07, 21, 40 and 112 days (four animals for each study day) and the histologics routine process were realized. The 5 µm cuts obtained were stained by eosin and hematoxilin (H.E.) for microscope study. The histologic s results reveled that in the start fase has inflamatory s acute process that was characterized by the presence of neutrophils and fibrin. On the 40 th and 112 th days a rich neovascularization were observed, the implants were partially reabsorpted and the around cell s a subcutaneous tissue were looking normally, that was considered a biocompatible material. The induced capacity of rhbmp-2 cells differentiation was inhibited. Key Words: Bovine s bone scaffold, rhbmp-2, Rats. INTRODUÇÃO A ciência biológica mostra cada vez mais a tendência em utilizar a engenharia de tecido em muitas de suas áreas, que tem como meta a reposição de tecidos ou órgãos danificados por outros verdadeiramente biológicos e funcionais. Três são as estratégias utilizadas para este fim: a condução, o transplante de células e/ou tecidos e a indução na diferenciação celular (KAIGLER & MOONEY, 2001). Um aspecto comum para os três métodos da engenharia de tecido é que eles sempre estão associados a um arcabouço (matriz, carreador, mensageiro, veículo) de materiais orgânicos ou poliméricos (colágenos, osso inorgânicos, ácidos poliláctico e/ou poliglicolítico, etc.). No método de condução, o arcabouço normalmente é uma membrana que impede a atuação negativa de células específicas no processo regenerativo. No método de transplante de células o veículo não só transporta as células ou tecido como serve de guia para o crescimento de novo tecido. E no método de indução emprega o arcabouço para transporte e sustentação de proteínas indutivas. Na literatura são encontrados trabalhos que relatam as propriedades osteoindutoras e de biocompatibilidade das Proteínas Morfogenéticas do Osso (BMPs) e de seus diferentes e possíveis carreadores,

3 139 Implante de Proteína... arcabouços que muitas vezes podem ser utilizados como enxerto nos defeitos ósseos (HUNT et al., 2001; BATISTA & SANT ANA-FILHO, 2001; ROCHA et al., 2002; SICCA et al., 2002; KIM & VALENTINI, 2002; JANUÁRIO et al., 2004; CORRÊA et al., 2004). As características desejadas de um material ósteo-substituto são: biocompatibilidade, previsibilidade e aplicação clínica sem riscos transoperatórios e seqüelas pós-operatórias mínimas, além da aceitação por parte do paciente (SICCA et al., 2000). Apesar de não ter sido encontrado um material que preencha todos esses requisitos, atualmente há uma grande variedade de opções para os enxertos e que também servem como carreadores de proteínas osteogênicas, tais como: materiais para enxertos alógenos mineralizados ou desmineralizados liofilizados e sintéticos (vidro bioativos, polímeros, hidroxiapatita sintética). Os enxertos xenogênicos são materiais orgânicos mais promissores, uma vez que os autógenos têm indicação limitada e os homógenos implicam na questão da bioética, além da dificuldade de se obter o material. O transporte e sustentação dos fatores de indução óssea podem ser realizados com arcabouço de osso bovino cortical ou medular desproteinizado, que tem estrutura morfológica semelhante à do osso humano, composição química similar e porosidade suficiente para abrigar as proteínas. Este trabalho teve como principal proposta avaliar a resposta histológica de tecido subcutâneo de rato, após o implante rhbmp-2 em arcabouço de osso mineral natural e desnaturado extraído do fêmur de vitelo desenvolvido pela Bionnovation Produtos Biomédicos S/A. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados 16 ratos, tipo Wistar, machos, com peso inicial médio entre 300 e 350 gramas, fornecidos pelo Biotério da Faculdade de Veterinária da Universidade Metropolitana de Santos. Os animais foram alocados em gaiolas próprias com água e ração ad libitum. Após jejum de 12 horas, os animais foram anestesiados com uma associação de cloridato de xilazina 2% e ketamina 5% na proporção de 1:1, com volume de 0,2 ml para cada 100g de peso por via intramuscular. No dorso foram realizadas tricotomia e anti-sepsia com álcool iodado. Os ratos foram posicionados em decúbito ventral para execução de uma incisão dorsal e divulsão no tecido subcutâneo, onde foram implantadas Proteína Morfogenética do Osso recombinante humana (rhbmp-2) em arcabouço inorgânico desenvolvida pela

4 Bengtson, A.L. et al. 140 Bionnovation Produtos Biomédicos S/A. As bordas da incisão foram coaptadas e suturadas, empregando fio náilon monofilamento nº 3.0. Decorridos sete, 21, 40 e 112 dias após o implante, os animais em número de quatro para cada período foram novamente anestesiados, incisionados e removidas as peças contendo os implantes e segmento do tecido que envolvia o material (fibroadiposo e muscular). Logo após as amostras foram fixadas em formalina tamponada a 10% processadas pela técnica rotineira de inclusão em parafina e obtidos cortes de 5 µm de espessura os quais foram corados pela técnica de Hematoxilina-Eosina (HE) para avaliação em microscopia de luz. Para cada fator de variação avaliado no experimento (matriz osteóide, inflamação aguda, inflamação crônica, depósito de fibrina, neovascularização e fibrose), foram feitas comparações entre os momentos. A quantificação de cada fator de variação foi dado em score seguindo os valores: ausente = (-), traços = (±), pequena quantidade = (+), moderada quantidade = (++), acentuada quantidade = (+++). Nas amostras colhidas no sétimo dia (Fig 1) foi observado infiltrado inflamatório agudo moderado evidenciado principalmente pela presença de neutrófilos e fibrinas, no decorrer do tempo, isto é, aos 20 dias (Fig 2) houve diminuição do exsudado devido à regeneração tecidual, caracterizada pela neovascularização e proliferação fibroblástica, aos 41 dias (Fig 3) as amostras apresentaram lamelas óssea com sinais de reabsorção separadas por tecido fibrótico, dados semelhantes foram obtidos por CORRÊA et al. (2004) e JANUÁRIO et al. (2004) quando implantaram em tecido subcutâneo de rato, osso bovino misto (OBM) que é basicamente constituído de colágeno e hidroxiapatita. Nas amostras removidas aos 112 dias foi observado que grande parte do material implantado foi reabsorvido e substituído por tecido conjuntivo subcutâneo próximo do normal e característico da área com mínima deposição de colágeno (Fig 4) (Tabela 1). RESULTADOS E DISCUSSÃO Após a coleta e análise dos dados, nos foi permitido confeccionar a tabela 1, e apresentar algumas microfotografias de amostras significativas para a discussão.

5 141 Implante de Proteína... TABELA 1 Quantificação dos eventos biológicos ocorridos após o implante de rhbmp-2 em arcabouço inorgânico nos diferentes períodos, ESTRUTURA PERIODO (dias) Matriz osteóide Inflamação aguda Inflamação crônica Depósito de Fibrina Neovascularização Granuloma de Corpo Estranho Fibrose FIGURA 1. Lamela óssea (LO) circundada por infiltrado inflamatório neutrofílico (IA) - Sete dias após cirurgia HE 400x. FIGURA 3. Lamelas ósseas (LO) com sinais de reabsorção parcial (RO) sugerindo atividade osteoclástica circundadas por fibrose (F), Células gigantes fagocitando corpo estranho (CGF) - 40 dias HE 100x. FIGURA 2. Aspecto de reação inflamação crônica (IC) com a presença atividade fibroblática (F) e neovascularização (NV) - 21 dias HE 40x. FIGURA 4. Lamelas ósseas reduzidas (LOR) (reabsorvidas) poucos remanescentes circundados com faixa de fibrose (F) (cicatrização) dias HE 100x.

6 Bengtson, A.L. et al. 142 Nos últimos períodos (Fig 3) do experimento pôde ser observado que parte do arcabouço ósseo estava sendo reabsorvido e ocorria aumento no número destas células gigantes, às vezes formando granulomas tipo corpo estranho, resultado que está em anuência com os de SPECTOR (1994) e BATISTA & SANT ANA FILHO (2001), os quais declaram nos resultados de suas pesquisas a presença do processo de reabsorção do osso bovino liofilizado quando implantado em tecido conjuntivo de ratos. Um achado importante que chamou atenção e que deve ser salientado foi com relação a algumas amostras colhidas no sétimo dia, onde discretos depósitos sugestivos de matrizes osteóide foram observadas no tecido fibroso neoformado (Fig. 5 e Tabela 1). Entretanto, nos demais grupos não foram apresentados estes depósitos. Pôde-se sugerir que as proteínas morfogenéticas do osso (rhbmp-2) que estavam sustentadas pelo arcabouço, iniciaram o processo de indução na diferenciação de algumas células em osteoblastos, que começaram a elaborar matriz osteóide e logo a seguir foram inativadas por algum sinal biológico. Esta inferência pode ser suportada pelo trabalho de URIST & STRATES (1970) que afirmam que a presença de matriz óssea mineralizada no tecido subcutâneo inibe a capacidade indutiva das proteínas osteogênicas. A osteogênese é inibida na presença de matriz mineralizada ou dela associada a matriz desmineralizada, devido à presença de células gigantes ricas em ácidos orgânicos, provavelmente relacionados com dissolução mineral, no local da implantação de matriz mineralizada conforme salientam REDDI & HUGGINS (1972). Talvez os íons minerais presentes na estrutura da matriz mineralizada, sejam os responsáveis pela ativação de células gigantes que são inibidoras de osteogênese. Outra possibilidade é que estas células atuem na reabsorção óssea com função osteoclástica. FIGURA 5 Fotomicrografia evidenciando tecido eosinófilo sugerindo matriz osteóide (MO); matriz osteóide com células inclusas (MOC); células gigantes fagocitando corpo estranho (CGF) - Sete dias após cirurgia HE 400x. O avanço na área da bioterapia através, principalmente, da utilização da engenharia de tecido, intensificou a procura de materiais ideais para cada situação de reparação tecidual, em especial na regeneração óssea. Sem dúvida alguma, se

7 143 Implante de Proteína... faz necessário que pesquisas sejam realizadas com o objetivo de se esclarecer a função e o mecanismo de cada componente envolvido (fatores de transformação do crescimento, proteínas morfogenéticas do osso, arcabouços, etc) na indução e formação óssea. CONCLUSÕES Portanto, o implante de osso bovino desnaturado como arcabouço para rhbmp-2 em tecido subcutâneo de rato: 1 É um conjunto biocompatível, uma vez que não promoveu necrose tecidual ou formação de micro-abscessos. 2 A capacidade indutora de diferenciação celular das rhbmp-2 foi inibida com a presença de matriz de osso desnaturado. REFERÊNCIAS CORRÊA, A.M; et al. Avaliação microscópica da resposta tecidual após a implantação de osso bovino misto macrogranular em subcutâneo de ratos [resumo Pb079]. In 21ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica; 2004 set. 8-12; Águas de Lindóia. Anais. São Paulo:SBPqO; p BATISTA, O.S., SANT ANA-FILHO, M. Avaliação Microscópica do processo de reparo em cavidades ósseas submetidas a implante de osso liofilizado bovino (BioOss ) em fêmur de ratas. RPG Rev Pós Grad. v.8, n.1l, p:62-69, 2001 HUNT, D.R., et al. Hyaluronan supports recombinant human bone morphogenetic protein-2 induced bone reconstruction of advance alveolar ridge defects in dogs. A pilot study. J Periodontol, v.72, n.5, p , May JANUÁRIO, D.D., et al. Biocompatibilidade do bloco de osso bovino misto (OBM) em subcutâneo e fêmur de ratos [resumo Pb082]. In 21ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica; 2004 set. 8-12; Águas de Lindóia. Anais. São Paulo:SBPqO; p KAIGLER, D., MOONEY, D. Tissue engineering s impact on dentistry. J Dent Educ, v.65, n.5, p , May KIM, H.D., VALENTINI, R.F. Retention ant activity of BMP-2 in hyaluoronic acidbased scaffolds in vitro, J. Biome Mat Res. v.59, n.3, p , REDDI, A.H.; HUGGINS, C. Biochemical sequences in the transformation of normal

8 Bengtson, A.L. et al. 144 fibroblasts in adolescent rats. Proc Natl Acad Sci USA; v.69,:p , ROCHA, L.B, GOISSIS, G., ROSSI, M.A. Biocompatibility of anionic collagen matrix as scaffold for bone healing. Biomater, v.23, n.2, p , Jan SICCA, C.M et al. Avaliação microscópica e bioquímica da resposta celular a enxertos de osso cortical bovino em subcutâneo de ratos. Efeito do tamanho da partícula. Rev FOB. v.8, n.1/2, p.1-10, SPECTOR, M. Anorganic bovine bone and ceramic analogs of bone mineral as implants to facilitate bone regeneration. Clin Plast Surg; v.21, n.3, p , URIST, M.R.; STRATES, E.S. Bone formation in implants of partially and wholly demineralized bone matrix. Clin Orthop Rel Res.; v.71, p.271-8, 1970.