COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA A GERMINAÇÃO DE PÓLEN DE VARIEDADES DE LARANJA-DOCE

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1 MELHORAMENTO E BIOTECNOLOGIA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA A GERMINAÇÃO DE PÓLEN DE VARIEDADES DE LARANJA-DOCE LEILA APARECIDA SALLES PIO 1, KEIZE PEREIRA JUNQUEIRA 4, JOSÉ DARLAN RAMOS 2, JOSÉ CARLOS MORAIS RUFINI 3 e FABÍOLA VILLA 1 RESUMO Em programas de melhoramento genético convencional, procura-se procedimentos simples para identificar grãos de pólen viáveis, de modo a dar maior flexibilidade ao trabalho dos melhoristas. O presente trabalho foi realizado visandose a obtenção do melhor meio de cultura para grãos de pólen das variedades de laranja doce Natal, Pêra e Valência, coletando-se botões florais em estádio balão. Foi avaliado o efeito de nitrato de cálcio e ácido bórico, sacarose e ph na composição do meio de cultura para a germinação de grãos de pólen das laranjas Valência, Natal e Pêra. Para avaliar o efeito do cálcio, empregou-se o meio de cultura contendo 10 g L -1 de ágar, 100 g L -1 de sacarose, acrescido de nitrato de cálcio, nas concentrações de 400, 800, e mg L -1, e ph ajustado para 6,5. Em seguida, testaram-se várias concentrações de ácido bórico (0, 200, 400 e 800 mg L -1 ) com o mesmo meio de cultura. Para verificar o efeito da sacarose, o meio de cultura foi constituído de 10 g L -1 de ágar, 800 mg L -1 de nitrato de cálcio e 200 mg L -1 de ácido bórico, acrescido de sacarose a 0, 50, 100, 150 e 200 g L -1. Para verificação do ph satisfatório, inocularam-se os grãos de pólen em meio de cultura contendo 10 g L -1 de ágar, 800 mg L -1 de nitrato de cálcio, 200 mg L -1 de 1 Engenheira Agrônoma, MSc. em Fitotecnia DAG/UFLA. Laboratório de Cultura de Tecidos, DAG/ UFLA, Lavras (MG). leilapio@ufla.br 2 Professor, Doutor, DAG/UFLA. 3 Engenheiro Agrônomo, Doutor em Fitotecnia, DAG/UFLA. 4 Acadêmica do curso de Agronomia, UFLA. ARTIGO CIENTÍFICO

2 88 LEILA APARECIDA SALLES PIO et al. ácido bórico,100 g L -1 de sacarose e ph de 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 e 6,5. Os melhores resultados foram obtidos com 800 mg L -1 de nitrato de cálcio, 200 mg L -1 de ácido bórico, 100 g L -1 de sacarose e ph 6,5, para Pêra e Natal. Para Valência, a melhor germinação ocorreu na ausência de boro. Termos de indexação: Citrus sinensis, palinologia, melhoramento genético. SUMMARY COMPOSITION OF CULTURE MEDIUM FOR POLLEN GERMINATION OF SWEET ORANGES VARIETIES Conventional plant breeding programs look for the quickest and easiest identification procedures to keep the pollen grains viable for enough time to allow more flexibility to the plant breeders. The present work was carried out to evaluate the best medium for the viability of pollen grain from sweet orange varieties Natal, Pêra and Valencia sweet oranges. It was evaluated the effect of calcium nitrate, boric acid, sucrose and ph in composition of culture medium for germination of pollen grains from Valencia Americana, Natal and Pêra Rio Tardia. To evaluate the effect of calcium, it was used culture medium containing 10 g L -1 agar and 100 g L -1 sucrose, and calcium nitrate in various concentrations (400; 800; 1,200; and 1,400 mg L -1 ) with ph 6.5. Then, several concentrations of boric acid (0, 200, 400, and 800 mg L -1 ) were tested with the same culture medium. To verify the sucrose effect, the culture medium (10 g L -1 agar, 800 mg L -1 calcium nitrate, and 200 mg L -1 boric acid) was enriched with sucrose (0, 50, 100, 150, and 200 g L -1 ). To check for satisfactory ph, pollen grains were inoculated in culture medium with 10 g L -1 agar, 800 mg L -1 calcium nitrate, 200 mg L -1 boric acid, 100 g L -1 sucrose and different ph levels (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, and 6.5). Best results were obtained with 800 mg L -1 calcium nitrate, 200 mg L -1 boric acid, 100 g L -1 sucrose and ph 6.5, for Pera and Natal. For Valencia the best germination was found in the absence of boron. Index terms: Citrus sinensis, palinology, genetic improvement.

3 COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA A GERMINAÇÃO INTRODUÇÃO Vários estudos têm sido desenvolvidos visando determinar qualitativa e quantitativamente os componentes necessários para a melhor composição do meio de cultura para a germinação de grãos de pólen, o qual deve ser constituído basicamente por carboidratos e elementos estimulantes como ácido bórico, ácido cítrico, nitrato de cálcio e reguladores de crescimento, entre outros. Na germinação de grãos de pólen in vitro, geralmente considera-se que o tubo polínico foi emitido quando seu comprimento for igual ou maior que o diâmetro do grão de pólen. O método consiste em germinar a amostra num meio apropriado e observar em microscópio, depois de determinado período, o número de grãos que emitiram tubo polínico. A composição do meio e o ph estão entre os fatores que afetam a germinação. Os grãos de pólen das angiospermas necessitam de uma fonte de carbono, de boro e, freqüentemente, de outros nutrientes para promover a sua germinação (GALLETA, 1983). Os principais componentes do meio de cultura para a germinação de pólen têm sido os tipos e concentrações de açúcares e distintas concentrações de boro (MIRANDA & CLEMENT, 1990). A sacarose empregada no meio de cultura tem por finalidade proporcionar o equilíbrio osmótico entre o pólen e o meio de germinação e fornecer energia para auxiliar o processo de desenvolvimento do tubo polínico (STANLEY & LINSKENS, 1974). KOBAYASHI et al. (1991) obtiveram 50% de germinação de grãos de pólen de híbrido de Citrus sinensis x Poncirus trifoliata utilizando meio de cultura contendo 20% de sacarose. Concentrações de glicose foram testadas na germinação de grãos de pólen de variedades cítricas, sendo os melhores resultados obtidos com 150 g L -1 de glicose, apresentando, em média, 59% de germinação (BUTT et al., 1993). BOMBEN et al. (1999), estudando a germinação de grãos de pólen em quivi (Actinidia chinensis), utilizaram meio de cultura composto por 100 g L -1 de sacarose, 0,025 g L -1 de ácido bórico e 6 g L -1 de ágar. OLIVEIRA JÚNIOR et al. (1996), pesquisando emissão de tubos polínicos em limoeiro Cravo (Citrus limonia) obtiveram bons resultados

4 90 LEILA APARECIDA SALLES PIO et al. com concentração de 800 mg L -1 de cálcio. BEYOUNG (1965) observou, em 46 espécies hortícolas, que a adição de cálcio promoveu a germinação de pólen e o crescimento do tubo polínico em todas as espécies estudadas. KWACK & BREWBAKER (1963), trabalhando com 86 espécies e 39 famílias, mostraram que o cálcio e o boro são elementos essenciais para a germinação do tubo polínico in vitro. Em trabalhos com germinação de grãos de pólen de três cultivares de citros após um ano de armazenamento, SAHAR & SPIEGEL (1980) estimularam a germinação utilizando ácido bórico e nitrato de cálcio. SILVA (1996) constatou que o melhor meio para a germinação de pólen de maracujazeiro (Passiflora edulis) é composto por 50 g L -1 de sacarose, 0,2 g L -1 de ácido bórico e 1,0 g L -1 de nitrato de cálcio. A germinação de grãos de pólen in vitro é uma ferramenta valiosa empregada por geneticistas e melhoristas que desejam verificar a fertilidade do pólen, o que auxiliará em programas de melhoramento de plantas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito das diferentes concentrações de cálcio, boro e sacarose, bem como o ph do meio de cultura para a germinação in vitro de grãos de pólen das laranjeiras Valência, Natal e Pêra. 2. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido em Lavras (MG), em 2002, durante o período de floração, setembro e outubro, dos cultivares Valência, Pêra Rio e Natal [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. Utilizaram-se plantas com 6 anos de idade, componentes de uma coleção de cultivares cítricas localizada no pomar da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG), no município de Lavras. Para esse trabalho, selecionaram-se duas plantas de cada variedade, coletando-se os botões florais em estádio balão, eliminando-se aqueles que estavam abertos, de acordo com o método de PASQUAL et al. (1982). Foram coletados aleatoriamente, em todas as partes da planta ao redor da copa, no período da manhã, próximo às 8h, e transportados para o laboratório em placas de Petri fechadas.

5 COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA A GERMINAÇÃO As anteras foram separadas das estruturas florais por intermédio de uma pinça e colocadas em placas de Petri forradas com papel-filtro, mantidas destampadas e submetidas à temperatura de 28 ± 1 C por 48 horas para que ocorresse a antese (abertura das anteras) e também para que o pólen tivesse seu teor de umidade reduzido, de acordo com o método descrito por SOUSA (1988). A viabilidade do pólen in vitro foi estudada mediante a germinação dos grãos de pólen em diferentes meios de cultura, em experimento constituído de 4 etapas. Para avaliar o efeito do cálcio, utilizou-se o meio de cultura contendo 10 g L -1 de ágar, 100 g L -1 de sacarose, acrescido de nitrato de cálcio nas concentrações de 400, 800, e mg L -1 e ph ajustado para 6,5. Em seguida, testaram-se várias concentrações de ácido bórico (0, 200, 400 e 800 mg L -1 ) em meio de cultura contendo 10 g L -1 de ágar, 100 g L -1 de sacarose e ph ajustado para 6,5. Para verificar o efeito da sacarose, o meio de cultura foi constituído de 10 g L -1 de ágar, 800 mg L -1 de nitrato de cálcio e 200 mg L -1 de ácido bórico acrescido de sacarose (0, 50, 100, 150 e 200 g L -1 ). Para verificação do ph satisfatório, o pólen foi inoculado em meio de cultura contendo 10 g L -1 de ágar e 800 mg L -1 de nitrato de cálcio, 200 mg L -1 de ácido bórico,100 g L -1 de sacarose e ph de 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 e 6,5. O meio de cultura foi vertido em placas de Petri de plástico (aproximadamente 10 ml por placa) e, os grãos de pólen espalhados sobre a superfície do meio com o auxílio de um pincel, colocando-se as placas de Petri contendo o pólen em BOD à temperatura de 25 ± 2 C por 12 horas. Efetuaram-se as avaliações pela porcentagem de grãos de pólen germinados, em microscópio óptico com objetiva de aumento de 10x, avaliando quatro campos de visão, que foram equivalentes a quatro repetições. Em cada campo de visão foram contados todos os grãos de pólen germinados ou não. Na análise da variância, utilizou-se o teste de F e para a comparação de médias, o teste de Scott Knott. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise da variância dos dados obtidos indicaram efeitos significativos a 1% de probabilidade na germinação dos grãos de pólen para cálcio

6 92 LEILA APARECIDA SALLES PIO et al. e cultivares, não havendo interação entre fatores estudados. Houve diferença também a 1% entre os cultivares e as diferentes doses de ácido bórico, ocorrendo interação entre esses dois fatores. Detectou-se diferença no mesmo nível de significância para os diferentes níveis de ph e cultivares, bem como a interação dos fatores estudados. E ainda, efeito a 1% de probabilidade para sacarose e interação, não havendo diferença significativa para o fator cultivares. A Figura 1A apresenta resultados obtidos utilizando o nitrato de cálcio, referente à porcentagem de grãos de pólen germinados nos diferentes cultivares. Pode-se observar que a Valência mostrou-se superior aos demais, com 10,24% de germinação. Na Figura 1B, observa-se a porcentagem de grãos de pólen germinados em diferentes concentrações de nitrato de cálcio. Melhor resultado foi obtido com a concentração de 800 mg L -1 de nitrato de cálcio, concentração a partir da qual houve um decréscimo acentuado para a variável analisada. Esses resultados concordam com os autores, que afirmam que o cálcio é essencial para a germinação dos grãos de pólen, bem como o desenvolvimento do tubo polínico (KWACK & BREWBAKER, 1963; BEYOUNG, 1965; SAHAR & SPIEGEL, 1980). OLIVEIRA JUNIOR et al. (1996) também verificaram que a melhor concentração de nitrato de cálcio é de 800 mg L -1 para limoeiro Cravo. É necessário, portanto, um correto ajuste na concentração de nitrato de cálcio para a germinação de grãos de pólen de citros. Para o experimento com ácido bórico, pode-se observar que nos grãos de pólen de Pêra e Natal, a germinação ocorreu na presença de ácido bórico no meio de cultura, sendo o melhor tratamento a adição de 200 mg L -1 desse nutriente. Entretanto, Valência apresentou melhor germinação na ausência de ácido bórico, de acordo com a Figura 2. Diversos autores enfatizam a importância do boro na germinação de grãos de pólen de várias culturas (PFAHLER, 1967; BOMBEN et al, 1999). A resposta do boro para a germinação e formação do tubo polínico está de acordo com KWACK & BREWBAKER (1963), que sugeriram ser o cálcio e o boro elementos essenciais para o início do prolongamento da intina e formação do tubo polínico in vitro. A alta exigência do boro e sua baixa concentração no interior do pólen conferem a este íon a responsabilidade pelo crescimento do tubo polínico, tanto in vitro quanto in vivo.

7 COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA A GERMINAÇÃO A Grãos de pólen germinados (%) Grãos de pólen germinados (%) Valência Pêra Natal Variedades Y = 0, ,3413x - 1,1439x 2 R 2 = 0,64 B Nitrato de cálcio (mg L -1 ) Figura 1. Porcentagem de germinação de grãos de pólen (A) em diferentes cultivares cítricos e porcentagem de grãos de pólen germinados (B) em diferentes concentrações de nitrato de cálcio. UFLA, Lavras (MG), 2003.

8 94 LEILA APARECIDA SALLES PIO et al. Pólen germinado (%) Concentração de boro (mg/l) Pêra Valência Natal Y Pêra = 6, ,012x - 0,000038x 2 R 2 = 72,59 Y Valência = 12,177-0,1999x 2 R 2 = 71,36 Y Natal = 5,9325-0,008338x R 2 = 87,09 Figura 2. Porcentagem de grãos de pólen de citros germinados em diferentes concentrações de ácido bórico. UFLA, Lavras (MG), A Figura 3 representa a porcentagem de grãos de pólen germinados em diferentes níveis de ph, podendo-se notar que há tendência de crescimento linear à medida que o ph sobe até o nível de 6,5 para Valência e Natal. Entretanto, para Pêra, melhores resultados foram obtidos com ph em torno de 5. A partir desses resultados, verifica-se que o nível de ph estimulou marcadamente o processo de germinação de pólen, concordando com as observações de KWACK & BREWBAKER (1963) e STANLEY & LINSKENS (1974), os quais mostraram que o ph no meio beneficia o processo de indução de germinação de pólen. A importância da determinação do ph ideal nos processos fisiológicos que envolvem os grãos de pólen está associada à maior porcentagem de germinação, auxiliando o trabalho de melhoristas que desejam verificar a fertilidade do pólen visando ao melhoramento genético.

9 COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA A GERMINAÇÃO Na avaliação da melhor dose de sacarose, os cultivares apresentaram comportamento semelhante, sendo o melhor resultado obtido na concentração de 100 g L -1 de sacarose, a partir da qual houve um decréscimo na porcentagem de grãos de pólen germinados (Figura 4). Esses resultados concordam com a maioria dos autores, ao afirmar que a sacarose é um dos componentes necessários para a germinação de pólen e também exerce a função do equilíbrio osmótico da solução, além de fornecer energia necessária para o crescimento do tubo polínico (STANLEY & LINSKENS, 1974). Por outro lado, KOBAYASHI et al. (1991) obtiveram melhores índices de germinação quando utilizaram 200 g L -1 de sacarose de grão de pólen de um híbrido de Citrus sinensis vs Poncirus trifoliata. Possivelmente, essa diferença de concentração possa ser explicada por se tratar de genótipos diferentes. De maneira geral, pode-se dizer que a melhor concentração de sacarose para a germinação de grãos de pólen varia entre 100 e 150 g L -1. Grãos de pólen germinados (%) ph Pêra Natal Valência Y Pêra = 3,8, ,301x - 1,726x 2 R 2 = 0,76 Y Natal = 0, ,0411x R 2 = 0,69 Y Valência = 3, ,2304x R 2 = 0,81 Figura 3. Porcentagem de grãos de pólen de citros germinados em diferentes níveis de ph. UFLA, Lavras (MG), 2003.

10 96 LEILA APARECIDA SALLES PIO et al. Grãos de pólen germinados (%) Sacarose (g/l) Natal Valência Pêra Y Natal = 0, ,1597x - 0,0008x 2 R 2 = 0,88 Y Valência = 2, ,0727x - 0,0004x 2 R 2 = 0,80 Y Pêra = 0, ,1407x - 0,0006x 2 R 2 = 0,70 Figura 4. Porcentagem de grãos de pólen de citros germinados em diferentes concentrações de sacarose. UFLA, Lavras (MG), CONCLUSÕES 1. A melhor germinação de grãos de pólen foi obtida com 800 mg L -1 de nitrato de cálcio, e 100 g L -1 de sacarose para todos os cultivares e 200 mg L -1 de ácido bórico para Pêra e Natal. Para Valência, a melhor resposta foi obtida na sua ausência. 2. À medida que se elevou o valor do ph até o nível de 6,5, aumentou a quantidade de grãos de pólen germinados para Natal e Valência. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BEYOUNG, H.K. The effects of calcium on pollen germination. Proceedings of the American Society of Horticultural Science, Alexandria, v. 86, p , 1965.

11 COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA A GERMINAÇÃO BOMBEN, C.; MALOSSINI, C.; CIPRIANI, G.; TESTOLIN, R. & RETAMALES, J. Long term storage of kiwifruit pollen. Acta Horticulturae, Amsterdam, v. 498, p , BUTT, S.J.; YUSUF, A.; ALI, S. & KHAN, M.A. In vitro studies on viability and germination of pollen in various citrus species. Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research, Rawalpindi, v.36, n.10, p , GALLETA, G.J. Pollen and seed management. In: MOORE, J.N. & JANICK, J. Methods in fruits breeding. Indiana, p KOBAYASHI, S.; OIYAMA, I.; YOSHINAGA, K.; OHGAWARA, T. & ISHII, S. Fertility in an intergeneric somatic hybrid plant of Rutaceae. HortScience, Alexandria, v.26, n.2, p.207, KWACK, B.H. & BREWBAKER, J.L. The essential role of calcium ion pollen germination and pollen tube growth. American Journal of Botany, New York, v.50, n.9, p , MIRANDA, P.A. & CLEMENT, C.R. Germination and storange of pejibaye (Bactris gasipaes), palmae pollen. Revista de Biologia Tropical, San José, v.38, n.1, p.29-33, OLIVEIRA JÚNIOR, A.F. de; RAMOS, J.D.; SANÁBIO, D.; RIBEIRO, V.G.& PASQUAL,M. Efeito do cálcio na germinação de grãos de pólen do limoeiro Cravo e do pessegueiro Aurora. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FRU- TICULTURA, 14., 1996, Curitiba. Anais... Curitiba: SBF, p.419. PASQUAL, M.; PETRI, J. L.; MATTOS, C. S. Polinização da macieira. III. Cultivares BR-1 e Mollies Delicious. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.17, n.10, , PFAHLER, P.L. Fertilization ability of maize pollen grains. II. Pollen genotype, female sporophyte and pollen storage interactions. Genetics, v.57, n.3, p , SAHAR, N. & SPIEGEL, R.P. Citrus pollen storage. HortScience, Alexandria, v.15, n.1, p.81-82, SILVA, M.M. da. Influência das abelhas na polinização e de agrotóxicos na germinação de pólen do maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) p. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. SOUSA, V.A. de. Manejo e viabilidade do pólen de Eucalyptus spp p. Dissertação (Mestrado em Engenharia Florestal) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba. STANLEY, R. G. & LINSKENS, H.F. Pollen: biology, biochemistry and management. New York: Springer Verlag, p.