Avaliação do Uso Tópico de Sulfato de Condroitina A (Ciprovet ) no Tratamento de Úlcera de Córnea Experimental em Coelhos*
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- Olívia Caires Gonçalves
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1 Trabalho de Pesquisa Avaliação do Uso Tópico de Sulfato de Condroitina A (Ciprovet ) no Tratamento de Úlcera de Córnea Experimental em Coelhos* Evaluation of the Topic Uses of Chondroitin Sulfate A (Ciprovet ) as a Treatment to Experimental Corneal Ulcer in Rabbits José Joaquim Titton Ranzani 1 Daniela Nogueira Cremonini 2 Cláudia Valéria S. Brandão 3 Geórgia Nadalini Rodrigues 4 Noeme Sousa Rocha 5 Rodrigo Mannarino 6 Adalberto José Crocci 7 Ranzani JJT, Cremonini DN, Brandão CVS, Rodrigues GN, Rocha NS, Mannarino R, Crocci AJ. Avaliação do uso tópico de sulfato de condroitina A (Ciprovet ) no tratamento de úlcera de córnea experimental em coelhos. MEDVEP Rev Cientif Med Vet Pequenos Anim Anim Estim 2004; 2(5):51-6. Pretendeu-se avaliar a eficácia do sulfato de condroitina A como tratamento de úlceras de córnea experimentais em coelhos, analisando-se seu potencial antiinflamatório, além da redução de tecido cicatricial por ele promovida. Utilizaram-se 15 coelhos, divididos em tratados e não tratados, subdivididos em três grupos de cinco animais cada, sacrificados no sétimo, 14º e 30º dias após a ceratectomia. Esta, do tipo lamelar, foi feita em ambos os olhos, sendo um deles tratado com Ciprovet colírio (sulfato de condroitina A e ciprofloxacina associados) e o contralateral, como controle, com colírio de ciprofloxacina. Os olhos foram avaliados quanto aos sinais clínicos, bem como suas córneas, em exame histopatológico. Quanto aos sinais, verificou-se hiperemia de conjuntiva e blefarospasmo nos dois primeiros dias e teste de fluoresceína positivo até, no máximo, o 5 o dia. Não se observou diferença quanto aos sinais clínicos entre os grupos tratados e não tratados. No corte histológico, puderam ser vistos maior organização lamelar, melhor distribuição de colágeno e fibrócitos e menor edema estromal, no grupo tratado com Ciprovet, indicando assim uma cicatrização mais eficiente. PALAVRAS-CHAVE: Úlcera da córnea/patologia; Coelhos; Sulfatos de condroitina. * Apoio financeiro: FAPESP (Auxílio Pesquisa e Bolsa de Aprimoramento Técnico nível III) 1 Docente do Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária FMVZ UNESP Botucatu, SP; Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária FMVZ UNESP; Dist. Rubião Jr, s/n CEP , Botucatu, SP; quim@fmvz.unesp.br 2 Mestranda em Medicina Veterinária Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária FMVZ UNESP Botucatu, SP 3 Docente do Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária FMVZ UNESP Botucatu, SP 4 Doutoranda em Medicina Veterinária Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária FMVZ UNESP Botucatu, SP 5 Docente do Departamento de Clínica Veterinária FMVZ UNESP Botucatu, SP 6 Doutorando em Medicina Departamento de Anestesiologia FM UNESP Botucatu, SP 7 Docente do Departamento de Bioestatística Instituto de Biociências UNESP Botucatu, SP INTRODUÇÃO A córnea é composta por quatro camadas: epitélio, estroma, membrana de Descemet e endotélio. Sua transparência é atribuída à ausência de vasos sangüíneos e pigmento, ao epitélio não queratinizado e
2 ao arranjo ordenado de suas fibrilas colágenas, as quais estão dispostas em lâminas paralelas à superfície corneana; seu grau de hidratação também contribui para a sua transparência 1,2. O estroma da córnea é formado por fibrilas colágenas (Tipo I e II), queratócitos e fibras nervosas amielínicas. A matriz extracelular é composta por glicosaminoglicanos (sulfato de condroitina/dermatana, queratossulfato, ácido hialurônico) e proteoglicanos, essenciais para a manutenção da adequada hidratação da córnea 1,2. Similarmente à função dos condrócitos no tecido cartilaginoso, os queratócitos são responsáveis pela manutenção e renovação da matriz extracelular, secretando o colágeno e os glicosaminoglicanos (GAGs) 2. Os GAGs são polissacárides de alto peso molecular, que podem apresentar-se como: polímeros monossulfatados, entre eles o sulfato de condroitina; polímeros polissulfatados; e polímeros não sulfatados, como o ácido hialurônico 2. O proteoglicano e o colágeno tipo I constituem os principais componentes do estroma corneano. Os proteoglicanos ocupam a região entre as fibrilas de colágeno e influenciam na organização estromal. Assim, eles podem representar um importante papel na manutenção da transparência corneana 3. Os glicosaminoglicanos sulfatados atuam como antiinflamatórios, uma vez que inibem competitivamente várias enzimas lisossomais e proteases, incluindo beta-glicosaminidase, beta-glucuronidase, catepsina e elastase; também possuem efeitos inibitórios sobre o influxo leucocitário, síntese de prostaglandina E2, síntese de interleucina 1 e formação de complementos. Outro efeito desta substância é estimular o aumento do diâmetro das fibras colágenas, influenciando assim sua maturação. Portanto, possui efeito condroprotetor, pois reduz a ação enzimática destrutiva local, e estimula a regeneração da cartilagem 4,5,6,7,8. O sulfato de condroitina (SC) é um GAG encontrado predominantemente na cartilagem articular e é um componente natural de diversos outros tecidos corporais, como tendões, ossos, discos vertebrais, coração e córnea 9. Estimula a síntese de GAG e proteoglicanos por mecanismos intra e extracelulares 10. O SC também contribui para manter as características da cartilagem ao aumentar o pool de GAG usado pelo condrócito para síntese de proteoglicanos; em adição a este efeito restaurativo, a incorporação do SC à cartilagem articular diminui o processo inflamatório, agindo diretamente sobre as enzimas, inibindo o sistema complemento e a atividade anti-prostaglandina 11,12. A ceratite ulcerativa, ou úlcera de córnea, é caracterizada por processos erosivos superficiais ou profundos na córnea, com perda de epitélio e exposição do estroma. Os agentes causais envolvidos com este tipo de ceratite são com freqüência os traumas, defeitos palpebrais, desordens relacionadas com o sistema lacrimal, além de infecções por fungos, bactérias e/ou vírus. Os sinais mais evidentes são blefarospasmo, fotofobia, epífora, edema, secreção ocular e vascularização 13. Devido à diversidade de causas, os procedimentos terapêuticos seguem primordialmente a identificação e a eliminação da causa, tendo como objetivo a restauração e a preservação da córnea. Entre os procedimentos clínicos adotados, encontram-se a terapia antibiótica, os analgésicos, os agentes lubrificantes, a atropina e as drogas antiproteases (EDTA, acetilcisteína e heparina). As úlceras que não respondem aos tratamentos clínicos convencionais devem ser tratadas de forma cirúrgica, com ceratotomia, flap de conjuntiva ou de terceira pálpebra, tarsorrafia ou aplicação de membranas biológicas 13,14. Outros trabalhos avaliaram o uso de SC 15 e de glicosaminoglicanos polissulfatados no tratamento de úlceras de córnea indolentes em cães 16 e cavalos 17, mostrando serem uma alternativa terapêutica eficaz no tratamento de úlceras persistentes refratárias aos tratamentos convencionais. OBJETIVOS Avaliar a eficácia do sulfato de condroitina A a 20% no tratamento de úlceras de córnea experimentais em coelhos, analisando-se seu potencial antiinflamatório, além da formação reduzida de tecido cicatricial. MATERIAL E MÉTODO Foram utilizados 15 coelhos hígidos, da raça Norfolk, machos e fêmeas, com peso variando entre 2200 e 3000g, com idade variando entre 5 e 6 meses, fornecidos pelo Biotério Central do campus de Botucatu UNESP. Foi realizado exame oftalmológico individual para exclusão dos animais que apresentassem quaisquer alterações. Finalmente, os animais foram identificados e mantidos em gaiolas individuais, onde receberam ração (Ração para coelhos Purina ) e água à vontade. Os coelhos foram inicialmente tranqüilizados com acepromazina* (1mg/Kg, IM) e, após 15 minutos, receberam tiopental**, via intravenosa, até atingirem plano anestésico adequado para o procedimento. Procedeu-se, então, à ceratectomia lamelar em ambos os olhos, demarcando-se a córnea com punch de 5mm de diâmetro e removendo-se o botão com auxílio de pinça colibri e lâmina de bisturi nº15, para excisão de 1/3 da espessura corneana total, sob mensuração de paquimetria. O olho direito de cada animal foi tratado com Ciprovet *** colírio (sulfato de condroitina A a 20% 52
3 e ciprofloxacina a 0,3%) e o contralateral, como controle, com colírio de ciprofloxacina****, na mesma concentração. Instituiu-se tratamento duas vezes ao dia no 1º dia e uma vez ao dia, nos subseqüentes. Os animais foram subdivididos em três grupos, de acordo com os períodos de coleta das córneas, para avaliação histopatológica aos 7, 14 e 30 dias. Os animais foram avaliados, diariamente, com uso de iluminação artificial direta, quanto aos seguintes sinais clínicos: fotofobia, blefarospasmo, quemose, hiperemia conjuntival, secreção, opacidade e neovascularização, além do teste da fluoresceína. Estas alterações foram quantificadas de forma subjetiva em: 0 ausente; 1 leve; 2 moderado; 3 intenso; 4 grave 18. Ao final de cada período, os animais foram novamente anestesiados, sob o mesmo protocolo, e em seguida sacrificados com 10ml de cloreto de potássio em bolus, via intravenosa, para enucleação e posterior coleta das córneas. O exame histopatológico foi realizado em microscopia de luz com coloração de hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson. Nesse exame avaliaram-se parâmetros referentes a edema epitelial e estromal, presença de abrasão e células jovens epiteliais, neoformação vascular, infiltração de leucócitos mono e polimorfonucleares, proliferação de fibrócitos e rearranjo das fibrilas de colágeno, observados segundo observações descritas por Spencer 19 (1985) e Margot, Grossniklaus 20 (1991). Estes parâmetros morfológicos foram avaliados no mesmo padrão utilizado para os sinais clínicos. neste último. Verificou-se, ainda, desorganização lamelar e edema estromal, além de intensa proliferação de fibrócitos e fibrilas de colágeno, sendo que no grupo controle houve maior edema e desorganização lamelar e menor proliferação de fibrócitos e fibrilas de colágeno. Nas córneas coletadas no 14º dia, mantiveram-se as alterações observadas na fase anterior (sétimo dia), porém, com menos intensidade, principalmente em relação às áreas de descamação e à desorganização lamelar, sendo mais intensas no grupo controle. Na última fase (30º dia), as áreas de descamação estavam muito reduzidas e as células jovens e o edema estavam presentes, mas em menor intensidade. A relação entre as alterações estromais dos grupos controle e tratado manteve-se, sendo, também, menos intensa que nas outras fases. ANÁLISE ESTATÍSTICA Para cada variável avaliada no experimento e representada por escores, foram utilizados testes não-paramétricos 21 visando à comparação do efeito de momentos em cada olho, pelo teste de Friedman, e do efeito nos olhos em cada momento, pelo teste de Wilcoxon. O nível de significância adotado foi de 5% de probabilidade. Mostrou-se significância (p<0,05) apenas entre os resultados histopatológicos aos 14 e 30 dias, mas não entre os grupos. RESULTADOS Não se observaram, durante todo o tratamento, sinais de fotofobia, neovascularização, quemose ou presença de pigmentos. Quanto aos sinais de blefarospasmo, hiperemia de conjuntiva e secreção seromucosa, os animais apresentaram-nos em grau leve a moderado, apenas no primeiro dia após a ceratectomia. O teste de fluoresceína positivo foi obtido em todos os animais até, no máximo, o 5º dia, não se observando diferença entre os grupos tratados e não tratados. A opacidade local, limitada apenas à área ceratectomizada, permaneceu por todo o tratamento, sendo mais discreta após 15 dias do mesmo. Todos os animais apresentaram este sinal clínico, não se observando diferença entre os grupos tratado e não tratado. Nos cortes histopatológicos dos animais sacrificados no sétimo dia, observou-se, na camada epitelial, grande quantidade de células jovens, edema, células descamadas e áreas de abrasão, tanto no grupo tratado como no controle, sendo este quadro mais intenso DISCUSSÃO Quanto aos efeitos antiinflamatórios do sulfato de condroitina A, pouco pôde-se observar, comparativamente, entre os grupos, visto que a ceratectomia lamelar induziu pouca ou nenhuma reação inflamatória local, por se tratar de um procedimento estéril, pouco abrasivo ou agressivo. Por este mesmo motivo, os sinais clínicos observados foram muito superficiais, sendo a reação inflamatória mínima, com ausência de edema ao redor da lesão, neovascularização, fotofobia, quemose, blefarospasmo intenso, pigmentação ou hiperemia conjuntival persistente. Quanto aos sinais de blefarospasmo, hiperemia de conjuntiva e secreção seromucosa, os animais apresentaram-nos em grau leve a moderado, apenas no primeiro dia após a ceratectomia. A reepitelização ocorreu até o 5 º dia, corroborando as observações de Rawe et al. 22 (1992), não se observando diferença entre os grupos tratados e não tratados. Segundo Spencer 19 (1985), a regeneração epitelial ocorre de modo extremamente rápido, sen- *Acepran (Univet) **Hypnol (Cristália) ***Labyes, Argentina ****Biamotil (Allergan-Frumtost) 53
4 Esta opacidade é causada pelo edema corneano associado à irregularidade das fibrilas de colágeno 19. Todos os animais apresentaram este sinal clínico, não se observando diferença entre os grupos tratado e não tratado. A avaliação histológica foi baseada nas alterações citadas por Spencer 19 (1985) e Margot, Grossnido que a córnea desnuda é recoberta dentro de 4 a 7 dias. A opacidade local, limitada apenas à área ceratectomizada, permaneceu por todo o tratamento, sendo observada também por Rawe et al. 22 (1992). FIGURA 1: Úlcera de córnea corada por fluoresceína, 24h após ceratectomia lame- FIGURA 2: Fotomicrografia corneana do olho esquerdo aos 7 dias; observar os defeitos na reepitelização (HE, 200X). FIGURA 3: Fotomicrografia corneana do olho direito aos 14 dias (HE, 200X). FIGURA 4: Fotomicrografia corneana do olho esquerdo aos 14 dias (mesmo animal da Figura 3); notar o edema estromal e desorganização lamelar mais intensos quando comparados aos do olho contralateral (HE, 200X). FIGURA 5: Fotomicrografia corneana do olho direito aos 14 dias (tricrômico de Masson, 200X). Notar o arranjo mais organizado que na Figura 6, referente ao olho contralateral do mesmo animal. klaus 20 (1991). Nos cortes histopatológicos da camada epitelial, a grande quantidade de células jovens, edema, células descamadas e áreas de abrasão, foi mais significativa no grupo controle. Neste mesmo grupo, edema mais intenso também foi observado, tanto no meio intra como no extracelular, ocorrendo principalmente próximo à membrana basal e caracterizado pela FIGURA 6: Fotomicrografia corneana do olho esquerdo aos 14 dias (mesmo animal da Figura 5); notar o desarranjo lamelar, principalmente próximo à membrana basal epitelial (tricrômico de Masson, 200X). coloração pálida do citoplasma celular e das áreas não preenchidas por epitélio, retratando igual observação de Spencer 19 (1985). Assim, também, a intensa desorganização lamelar e o edema estromal, associados à reduzida 54
5 proliferação de fibrócitos e fibrilas de colágeno, foram observados no grupo controle, comparativamente ao grupo tratado. A ausência de neovascularização ou de polimorfonucleares, a não formação de tecido cicatricial, caracterizado pela presença de tecido conectivo com arranjo irregular, corroboram as informações de Spencer 19 (1985). Rawe et al. 22 (1992) e Lance et al. 23 (1988) relataram uma alta densidade de fibrócitos próximo à área lesada, principalmente após 7 a 14 dias da ceratectomia, como foi observado nos cortes histológicos referentes a estes períodos. Lance et al. 23 (1988) observaram a presença de neutrófilos no estroma anterior, próximo à área lesada, ao contrário do que foi observado aos 7, 14 e 30 dias após ceratectomia. Apesar da análise estatística não apresentar diferenças significativas entre os grupos tratado e não tratado, considerou-se a avaliação histopatológica relevante, visto que o número de animais utilizados é reduzido, de modo que não fornece variações numéricas suficientes para indicar estas diferenças. CONCLUSÃO Quanto aos efeitos antiinflamatórios do sulfato de condroitina A a 20%, no tratamento de úlceras de córnea em coelho, pouco se pôde observar, comparativamente ao grupo controle. Este estudo, porém, mostrou eficácia no uso tópico de sulfato de condroitina A, quanto à organização cicatricial do tecido estromal, caracterizando sua ação sobre o tecido composto por colágeno. Ranzani JJT, Cremonini DN, Brandão CVS, Rodrigues GN, Rocha NS, Mannarino R, Crocci AJ. Evaluation of the topic uses of chondroitin sulfate A (Ciprovet, as a treatment to experimental corneal ulcer in rabbits. MEDVEP Rev Cientif Med Vet Pequenos Anim Anim Estim 2004; 2(5):51-6. The objective of this test was to measure the efficacy of chondroitin sulfate A as a treatment to experimental corneal ulcer in rabbits. We observed, through exams, its anti-inflammatory potential, as well as a reduction of cicatricial tissue. We utilized 15 rabbits that were divided into two categories: treated and non-treated. The rabbits were also subdivided into three groups with five animals, on the seventh, 15 th and 30 th days after lamellar ceratectomy. This one was done in both eyes. Only one eye was treated with Ciprovet eyewash (chondroitin sulfate A and ciprofloxacin associated) and the other, as a control, was treated only with ciprofloxacin. The eyes were evaluated as for clinical signs and its corneas underwent a histopathology exam. The signs observed were: hyperemic conjunctiva and blefarospasm in the two first days, and a positive fluorescein test within the following five days. There were no real significant differences in the clinical signs obtained from the treated and non-treated groups. In the histological exam, though, there was more lamellar organization, and a better collagen and fibrocytes distribution. There was less stromal edema in the group treated with Ciprovet, with indication of a more efficient cicatrisation. KEYWORDS: Corneal ulcer/pathology; Rabbits; Chondroitin sulfates. REFERÊNCIAS 1. Slatter D. Cornea and sclera. In:. Fundamentals of veterinary ophthalmology. 2ª ed. Philadelphia: Saunders; Banks WJ. Histologia veterinária aplicada. São Paulo: Manole; p. 3. Nakazawa K et al. Modification of proteoglycan synthesis by corneal stromal cells on co-culture with either epithelial or endothelial cells. J Biochem 1997; 122(4): Parry DAD, Craig AS. Growth and development of collagen fibrils in connective tissue. In: Ruggeric A, Motta PM (eds). Ultra structure of the connective tissue matrix. The Haghe, Martinus Nihoff; p Yovich JVW, McIlwraith CW. 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