AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE EM DIFERENTES LINHAGENS CELULARES DE DIFERENTES COMPOSIÇÕES DE VIDROS BIOCOMPATÍVEIS

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1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE EM DIFERENTES LINHAGENS CELULARES DE DIFERENTES COMPOSIÇÕES DE VIDROS BIOCOMPATÍVEIS Felipe Nogueira Ambrosio*, Roger Borges**, Ana Carolina Santos de Souza**, Juliana Marchi** e Christiane Bertachini Lombello* * CECS, Universidade Federal do ABC, São Bernardo do Campo, Brasil; ** CCNH, Universidade Federal do ABC, Santo André, Brasil felipe.nogueira@aluno.ufabc.edu.br RESUMO Neste trabalho buscou-se analisar a citotoxicidade de amostras de vidros biocompatíveis de diferentes composições base (BG1 e BG2) do sistema SiO 2 -Na 2 O- CaO-P 2 O 5, variando a razão Ca 2+ /Na + e dopadas com ferro gadolínio e itérbio. Os vidros foram obtidos por fusão dos óxidos seguida de resfriamento, moídos e conformados uniaxialmente em pastilhas cilíndricas de 0,2 g. Foram realizados testes de citotoxicidade direta e indireta, utilizando as linhagens celulares MC3T3-E1 e Vero, respectivamente por análises qualitativas com a observação da morfologia e crescimento celulares com microscopia de luz e eletrônica. No ensaio de citotoxicidade direta ocorreu deposição de partículas provenientes da degradação das amostras, que dificultaram a visualização das culturas. Já o indireto permitiu observar que a composição BG1, com maior razão Ca 2+ /Na +, apresentou dados indicativos de citotoxicidade, enquanto que as BG2 não apresentaram citotoxicidade, indicando uma relação entre composição, taxa de degradação e citotoxicidade dos vidros. Palavras-chave: Citotoxicidade, Materiais Biocompatíveis, Técnicas de Cultura Celular, Vidros Biocompatíveis.

2 INTRODUÇÃO Vidros biocompatíveis são materiais vítreos bioativos que em contato com o sistema biológico podem apresentar diferentes taxas de dissolução em função de sua composição, sendo classificados como bioativos ou bioabsorvíveis no tecido hospedeiro, onde são capazes de estimular a atividade de células responsáveis pela formação da matriz mineral óssea, os osteoblastos. Esta diversidade torna-os particularmente interessantes para diversas aplicações, principalmente em reparo tecidual ósseo. Os vidros biocompatíveis podem ser utilizados tanto na forma pura quanto em sua forma dopada, ou seja, quando são adicionados outros elementos em sua composição visando obter propriedades específicas do material (1). Dentre as aplicações possíveis desses vidros investiga-se a utilização para tratamentos de câncer ósseo. Devido a afinidade com esse tipo de tecido é possível que estes materiais possam ser usados como coadjuvantes em terapias antitumorais como a hipertermia, provocando um aumento da temperatura em tecidos tumorais (2), sendo associado à algum elemento magnético, como o ferro. Também pode ser utilizado para braquiterapia, uma técnica que consiste na entrega de partículas radioativas para o tecido tumoral, com potencial efeito letal para as células cancerígenas (3), sendo associado a um radioisótopo, como o itérbio. Para tais utilizações, porém, é necessário primeiramente determinar se a utilização desses biomateriais não compromete os tecidos saudáveis do hospedeiro, através de testes de citotoxicidade. Os testes de citotoxicidade são ensaios in vitro, utilizando em geral linhagens celulares estabelecidas, sendo verificados os padrões de morfologia celular e possíveis alterações causadas pelo efeito citotóxico de biomateriais. Estes ensaios podem ser

3 realizados na forma de contato direto, onde as células são cultivadas em contato com o biomaterial, permitindo a observação desta interação, mas expondo as células a danos mecânicos ou indireto, por extração, realizado a partir de uma solução de extrato do biomaterial, evitando danos mecânicos (4, 5). Neste trabalho é proposta a avaliação de citotoxicidade direta e indireta de vidros biocompatíveis em sistemas de culturas de células não tumorais. MATERIAIS E MÉTODOS Composições de Vidros Biocompatíveis Os vidros biocompatíveis foram desenvolvidos de acordo com os protocolos desenvolvidos pelo grupo (6) por meio de fusão de óxidos, a 1600ºC/2h, utilizando 2 composições básicas, com diferentes razões de Ca 2+ /Na + (BG1 com menor razão e BG2 com maior razão), que foram dopadas com ferro (Fe), gadolínio (Gd) e itérbio (Yb) como mostrado na Tabela 1.

4 Cultura de Células Foram padronizadas as condições de cultura de células precursoras de osteoblastos, linhagem MC3T3-E1, estabelecida a partir de calvária de rato e da linhagem Vero, mantidas em meio alfa-mem e HAM-F10, respectivamente, suplementados com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina, ambas mantidas a 37ºC e 5% CO 2. Para o controle da viabilidade celular foi usado o corante vital azul de tripan e sua morfologia foi observada com microscópio invertido de contraste de fase (Axiovert A1, Zeiss). Citotoxicidade por Contato Direto O teste de citotoxicidade direta foi realizado com a inoculação de 3,5 x 10 4 células por poço, em 2 placas de 24 poços, utilizando as células da linhagem MC3T3-E1. Após 24 horas, com a confluência da monocamada celular, foi depositada uma amostra de 0,2 g de vidro biocompatível nos poços. Para verificação dos efeitos do contato das células com os biomateriais por 24 horas a monocamada celular foi avaliada quanto a morfologia por meio de microscopia de contraste de fase, ao microscópio invertido (Axiovert A1, Zeiss). (5) Como controle negativo de citotoxicidade foi utilizado papel-filtro e como controle positivo, látex ou fenol 0,25% adicionados ao meio de cultura. Todos os ensaios foram realizados em triplicata para cada composição de vidro. Após um período de 24 horas a monocamada celular foi fixada em glutaraldeído 0,25% em tampão fosfato e coradas com azul de toluidina 0,05% para ser observada com o auxílio do microscópio invertido. Citotoxicidade por Contato Indireto Para o teste de citotoxicidade indireta foram inoculadas cerca de 2 x 10 4 células por poço, em 2 placas de 24 poços, da linhagem Vero. As culturas celulares foram incubadas por 24 horas, até atingir a condição de subconfluência. O meio de cultura foi então substituído pelos extratos dos biomateriais, obtidos previamente por incubação

5 em meio de cultura durante 24 horas. Decorridas 24 horas do contato com os extratos foi realizada a observação da morfologia celular por microscopia de contraste de fase em microscópio invertido, seguida da fixação em glutaraldeído 0,25% em tampão fosfato e de coloração com azul de toluidina 0,05%. As células fixadas e coradas foram observadas com o auxílio do microscópio invertido. Como controle negativo de citotoxicidade foi utilizado apenas o meio de cultura e como controle positivo, o fenol 0,25% adicionado ao meio de cultura. Todos os ensaios foram realizados em triplicata para cada composição de vidro. Avaliação das Amostras de Vidros Biocompatíveis após Contato Com as Culturas Celulares Utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura Para a análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura (MEV, Jeol 6010), foi utilizada uma placa de 12 poços, com cerca de 10 4 de células inoculadas por poço sobre as amostras de vidro, em contato direto. Após 24 horas as amostras foram fixadas em glutaraldeído 0,25%, em tampão fosfato, desidratadas em série de etanol e acetona e recobertas com ouro (com o equipamento SCANCOAT SIX, Edwards) (7). RESULTADOS E DISCUSSÃO Citotoxicidade Direta Foi observado que para todas as amostras ocorreu uma liberação inesperada de partículas para o meio de cultura (Figura 1) e que sua deposição inibiu a adesão e proliferação das células nos poços da placa de cultura, sendo observados muitos detritos e baixa concentração de células. No geral a grande quantidade de material depositado dificultou a observação da morfologia celular ao bloquear o campo de visão. De forma geral, para todas as amostras foram observadas morfologias celulares condizentes com células não saudáveis, com tamanho reduzido, prolongamentos celulares e células amorfas, além da ausência de observação de confluência da monocamada celular (8, 9).

6 Figura 1: Micrografia da análise morfológica para teste de citotoxicidade por contato direto referente a amostra [A] BG1 puro e [B] BG2 puro. Células em contraste de fase (coluna 1) e coradas com azul de toluidina (coluna 2). Era esperado que não fosse observado efeito citotóxico nem que o material sofresse uma quantidade expressiva de degradação, de acordo com outros trabalhos disponíveis na literatura (10-13) e experiências prévias do grupo de pesquisa (6). Por causa disso está em andamento uma investigação mais aprofundada do comportamento de degradação do material. Microscopia Eletrônica de Varredura A utilização do microscópio eletrônico de varredura (MEV) permitiu a observação das amostras com resolução muito superior à de luz e possibilitou avaliar a interação das células da linhagem MC3T3 com os vidros biocompatíveis. A análise das amostras BG1 e suas variantes dopadas (Figura 2) revelou que o material, após ter ficado em contato com o meio de cultura e com as células, sofreu

7 degradação, tendo liberado partículas para o meio. Tal degradação é observada pela alteração da textura da superfície dos vidros, apresentando um aspecto de rachaduras e superfície irregular. Também foi constatado que a adição dos íons terapêuticos aparentemente modificou o comportamento de dissolução do vidro ao diminuir a magnitude de degradação superficial observada. Figura 2: Micrografia obtida por MEV da superfície da amostra de [A] BG1 puro, [B] BG1+Fe, [C] BG1+Fe+Gd, [D] BG1+Fe+Gd+Yb. As amostras BG2 (Figura 3) aparentaram ter sofrido menos degradação do que as BG1, mas ainda assim com padrão semelhante, com as rachaduras formando placas superficiais sobre um fundo de aparência mais granulosa e com as células observadas também com morfologia arredondada.

8 Figura 3: Micrografia obtida por MEV da superfície da amostra de [A] BG2 puro, [B] BG2+Fe, [C] BG2+Fe+Gd, [D] BG2+Fe+Gd+Yb. De modo geral, as amostras BG2 apresentaram uma degradação aparentemente menor do que as BG1, efeito o qual pode estar associado com uma maior coesão da rede vítrea devido à maior concentração de cálcio e menor concentração de sódio nas amostras BG2. A ausência de células na superfície das amostras, ou em alguns casos a presença de poucas células, pode ter sido provocada pela degradação das mesmas, pois conforme o material foi degradado não houve uma superfície estável para que as células se mantivessem aderidas. Esta hipótese é fortemente indicada pelo fato de que os poucos locais onde foram identificadas células, foram aqueles que sofreram menos degradação, tendo, portanto, preservado melhor sua camada mais superficial e um microambiente mais propício para a adesão celular. Também é importante ressaltar que foi observada liberação de partículas pelas amostras tanto na fase do teste de citotoxicidade quanto durante a preparação delas para a observação no MEV (fixação e

9 lavagens), onde a liberação de partículas pelo material se mostrou ainda mais acentuada, podendo ter removido células previamente aderidas. Citotoxicidade Indireta Os resultados do teste de citotoxicidade indireta nas amostras BG1 e BG2 podem ser observados nas Figuras 4 a 6. Foram realizadas análises morfológicas das células da linhagem Vero cultivadas na presença de extratos dos vidros biocompatíveis e dos controles positivos (látex e fenol) e negativos (papel-filtro). Figura 4: Micrografia do ensaio de citotoxicidade indireta utilizando células Vero com extrato do vidro BG1 puro. [A] Células não coradas, contraste de fase. [B] Células fixadas e coradas com azul de toluidina.

10 Figura 5: Micrografia do ensaio de citotoxicidade indireta utilizando células Vero com extrato da amostra BG1+Fe+Gd+Yb. [A] Células não coradas, contraste de fase. [B] Células fixadas e coradas com azul de toluidina. Figura 6: Micrografia do ensaio de citotoxicidade indireta utilizando células Vero com extrato do vidro BG2 puro. [A] Células não coradas, contraste de fase. [B] Células fixadas e coradas com azul de toluidina. Foi observado que as composições BG1 puro, BG1+Fe e BG1+Fe+Gd mostraram um efeito levemente citotóxico às células, porém a composição BG1+Fe+Gd+Yb se mostrou, aparentemente, não citotóxico. Isso, em adição com o fato de que todas as composições de BG2 se mostraram, também, não citotóxicas, reforça a hipótese de que houve uma alteração na taxa de dissolução do vidro devido às variações de sua composição associada com uma maior coesão da rede vítrea que, por fim, possivelmente influenciou sua citotoxicidade. De fato, uma vez que as composições BG1 apresentaram maior citotoxicidade, acredita-se que estas se degradaram mais rapidamente e que os níveis de íons lixiviados para o extrato ultrapassaram a concentração máxima tolerável pelas células. Portanto, é desejável investigar mais essa hipótese, com a realização de ensaios para determinação quantitativa da taxa de

11 dissolução dos vidros biocompatíveis em um ambiente que simule as condições biológicas. CONCLUSÕES Os resultados obtidos da análise de citotoxicidade direta foram insuficientes para a conclusão sobre a biocompatibilidade dos vidros estudados, devido à degradação dos materiais e subsequente dificuldade de observação. O MEV revelou que a dopagem dos biovidros com outros elementos influenciou no comportamento de degradação das amostras. Para um melhor entendimento do comportamento dos materiais e da resposta biológica à eles é fundamental a realização de estudos sobre seu processo de degradação, estudo atualmente em andamento pelo grupo de pesquisa. Já no que se refere ao teste de citotoxicidade por meio indireto (por extrato), ele permitiu avaliar satisfatoriamente e de maneira qualitativa os efeitos citotóxicos dos materiais de interesse, os vidros biocompatíveis BG1 e BG2, puros e dopados. Os resultados indicam que, das composições analisadas, o biovidro BG2 apresenta um menor potencial citotóxico, sendo que estudos futuros, com ensaios quantitativos, como o uso de MTT para análise de viabilidade celular, podem fornecer maiores informações a cerca da interação entre o tecido ósseo e os vidros biocompatíveis. AGRADECIMENTOS Agradecimentos à Universidade Federal do ABC (UFABC) pelas bolsas PIC de Iniciação Científica (Edital 01/2014 e 01/2015) e também à Central Experimental Multiusuário (CEM), ao Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH) e ao Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas (CECS) por disponibilizarem dos equipamentos e da infraestrutura necessários para o desenvolvimento deste projeto.

12 REFERÊNCIAS (1) PINTO FILHO, F. Estudo do comportamento físico da hidroxiapatita dopada com ferro f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Engenharia e Ciência de Materiais, Departamento de Coordenação do Programa de Pósgraduação em Engenharia e Ciência de Materiais, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, (2) HERNÁNDEZ, A.V. et al. Hipertermia electromagnética, una alternativa para el tratamiento del cáncer: antecedentes, aspectos físicos y biológicos. Revista Mexicana de Ingeniería Biomedica, Cidade do México, v. 22, n. 2, p (3) NOGUEIRA, L.B.; CAMPO, T. P. R. Nuclear characterization of radioactive bioglass seed for brachytherapy studies. In: international conference on mathematics and computational methods applied to nuclear science and engineering (M&C 2011), 2011, Rio de Janeiro. Rio de Janeiro: American Nuclear Society, (4) ROGERO S.O, et al. Teste in vitro de citotoxicidade: estudo comparativo entre duas metodologias. Materials Research, v.6, p , (5) INTERNATIONAL STANDARDS ORGANIZATION. ISO Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. p.34, (6) Borges R, Silva AC. Evaluation of the Bioactivity Behavior of a 48 Wt %SiO2 Bioglass through Experiments in Simulated Body Fluid. Materials Science Forum. 2012; : (7) GLAUERT, A.M. Practical Methods in Electron Microscopy. Vol III: Fixation, Dehydration and embedding of biological specimens. North-Holland Publishing Company, P (8) HORIKAWA, Akira et al. Morphological Changes in Osteoblastic Cells (MC3T3-E1) due to Fluid Shear Stress: Cellular Damage by Prolongued Application of Fluid Shear Stress. J. Exp. Med.. [s.i.], p jun (9) ATCC. Catálogo: MC3T3-E1 Subclone 4 (ATCC CRL-2593TM). Disponível em: < Acesso em: 26 ago (10) MAÇON, Anthony L. B. et al. Unified in vitro evaluation for apatite-forming ability of bioactive glasses and their variants.journal Of Materials Science Materials In Medicine. [s.i.], p fev

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14 EVALUATION OF CYTOTOXICITY IN DIFFERENT CELL LINES OF DIFFERENT BIOCOMPATIBLE GLASSES COMPOSITIONS Felipe Nogueira Ambrosio*, Roger Borges**, Ana Carolina Santos de Souza**, Juliana Marchi** e Christiane Bertachini Lombello* * CECS, Universidade Federal do ABC, São Bernardo do Campo, Brasil; ** CCNH, Universidade Federal do ABC, Santo André, Brasil ABSTRACT This work seeks to evaluate the cytotoxicity of different compositions of biocompatible glasses (BG1 and BG2) of the SiO 2 -Na 2 O-CaO-P 2 O 5 system, with variations of the Ca 2+ /Na + ratio and also iron, gadolinium and ytterbium doping. The glasses were obtained by oxide fusion followed by cooling, grinding and shaped by uniaxial pressing into 0,2 g cylindrical samples. Direct and indirect cytotoxicity assays were done with the MC3T3-E1 and Vero cell lines, respectively, with qualitative analysis by morphological and growth observation via light and electron microscopy. During the direct cytotoxicity assay ocurred particle deposition originated from the samples degradation, wich resulted in difficulty to visualize the cultures. The indirect assay, however, allowed to observe that BG1 composition, with greater Ca 2+ /Na + ratio, presented indicative data of cytotoxicity, while BG2 didn't show cytotoxicity effects, indicating a relation between composition, degradation ratio and cytotoxicity of the glasses. Key-words: Cell Culture Techniques, Cytotoxicity, Biocompatible Materials, Biocompatible Glasses.