ENSAIO DE CITOTOXICIDADE DE BLENDAS DE QUITOSANA/PVOH RETICULADAS COM GLUTARALDEÍDO E GLIOXAL

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1 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE DE BLENDAS DE QUITOSANA/PVOH RETICULADAS COM GLUTARALDEÍDO E GLIOXAL Felipe N. Ambrosio 1, Caue d S. Souza 1, Gustavo N. Nunes 1, José C. Moreira 1, Ana P. Romani 1, Christiane B. Lombello 1 1 Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas (CECS) da Universidade Federal do ABC (UFABC), São Bernardo do Campo (SP), Brasil felipe.nogueira@ufabc.edu.br Resumo. Biomateriais poliméricos apresentam ampla variedade de propriedades físico-químicas, o que permite sua utilização, de maneira versátil, para diversas aplicações de interesse clínico, tais como recobrimento de falhas criadas cirurgicamente para a remoção de câncer em tecido ósseo, promovendo a proteção do local, permitindo uma melhor recuperação do paciente. Podem ser associados com fármacos de propriedades antiinflamatórias e/ou antitumorais. Visando tal aplicação foram caracterizadas blendas de quitosana (QTS) e de poli(álcool vinílico) (PVOH) por ensaios de citotoxicidade direta para avaliar sua biocompatibilidade. Foram analisadas amostras puras de QTS e PVOH, bem como blendas de QTS/PVOH (3:1) sem reticulante e reticuladas com glutaraldeído ou glioxal. Amostras dos biomateriais foram depositadas em placas de múltiplos poços com células da linhagem Vero em condição de semi-confluência da monocamada. Os resultados foram observados em microscópio invertido de luz com contraste de fase após 24 horas de contato entre as amostras e a cultura de células, que foi mantida em temperatura de 37ºC em atmosfera com 5% de CO 2. Nenhuma amostra mostrou um comportamento citotóxico significativo, o que permite a continuidade do uso desses biomateriais em estudos futuros visando engenharia de tecidos. Palavras-chave: Células Vero, Citotoxicidade, Engenharia de tecidos, Poli(álcool vinílico), Quitosana 1. INTRODUÇÃO Na medicina o uso de biomateriais poliméricos já é uma prática consolidada, principalmente na substituição de tecido conjuntivo e em próteses permanentes ou temporárias. Porém, com o desenvolvimento de novos materiais e avanços na biologia molecular, estuda-se o uso desses biomateriais para engenharia de tecidos, onde atuam como um arcabouço tridimensional, auxiliando na recuperação de tecidos lesionados e também como uma forma de entrega de fármacos ou (Banoriya, 2017). Dentre os diferentes polímeros disponíveis, a quitosana (QTS) é um polímero natural, biocompatível, com potencial antimicrobiano e pode ser usada para desenvolver sistemas de entrega de fármacos, o que faz com que seja o foco de muitos estudos em desenvolvimento (Banoriya, 2017; Bhattarai, 2010). O poli(álcool vinílico) (PVOH) também pode ser utilizado como um sistema de entrega de fármacos, além de apresentar boas propriedades mecânicas, de adesão, ser hidrofílico e bioinerte (Pandele, 2014; Park, 2001). O uso da QTS, porém pode ser restrito devido as características físicas, como sua baixa resistência mecânica e dificuldade de processamento. A adição de PVOH para compor blendas entre os dois polímeros pode modificar as propriedades individuais de cada material preservando o potencial de biocompatibilidade para a entrega de fármacos que as matériasprimas apresentam (Pandele, 2014; Park, 2001). Para que um biomaterial possa ser submetido para o uso em aplicações clínicas ele deve passar primeiro por uma série de avaliações cujo objetivo é garantir que ele não provoque 366

2 efeitos adversos em uma escala que torne seu uso inadmissível (FDA, 2016). Uma das primeiras avaliações que qualquer biomaterial deve passar é a de citotoxicidade in vitro, que avalia os efeitos do mesmo sobre culturas de linhagens celulares estabelecidas, por meio de metodologia normalizada e reconhecida internacionalmente (ISO, 2009; Masson, 2016). Para este atual trabalho foi proposta a avaliação da citotoxicidade in vitro de blenda de QTS/PVOH não reticulada e na presença de diferentes agentes reticulantes. 2. METODOLOGIA 2.1 Linhagem Celular Neste projeto foram utilizadas células da linhagem Vero, originadas a partir de tecido epitelial renal de um macaco da espécie Cercopithecus aethiops. É caracterizada por ser um tipo celular aderente e por se comportar como fibroblastos (ATCC, 2017). As células foram mantidas em garrafas de cultura com meio de cultura HAM-F10 suplementado com 10% de soro fetal bovino, a 37ºC e com atmosfera contendo 5% de CO2. O meio de cultura foi trocado a cada 3 dias. Nas ocasiões em que a monocamada celular atingia confluência, ou seja, quando ocupava praticamente toda a área disponível para cultura, era realisado um procedimento de subcultura, ou repique, quando o meio é substituído por uma solução de tripsina e EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) para que as células percam sua adesão e entrem em suspensão, que é, então, diluída e transferida para uma nova garrafa. 2.2 Citotoxicidade por contato direto Os materiais de estudo foram amostras de filmes poliméricos de QTS, PVOH, da blenda QTS/PVOH (3:1) não reticulada e de blendas reticuladas com 1% e 5% de glutaraldeído (Vetec, 50% em H2O) e 1% e 5% de glioxal (DAG Química, grau de pureza 95%). A amostra PVOH com 88% de grau de hidrólise e de massa molar numérica média Mn = g/mol e massa molar ponderada média de Mw = g/mol foi fornecida pela empresa Celanese, conhecido como Celvol 205. A amostra de QTS foi fornecida pela empresa Polymar, com massa molar ponderal média (Mw) da ordem de g/mol e grau de desacetilação de 80,0 ± 5%. Amostras dos biomateriais foram cortadas de forma a apresentarem uma área superficial de aproximadamente 10% da área de cultura celular, e esterilizadas por meio de irradiação de luz ultravioleta por 30 minutos em cada face. As amostras foram, então, depositadas cada uma sobre uma cultura de células da linhagem Vero em semi-confluência. Os resultados foram obtidos de forma qualitativa, com a observação da morfologia das células em cultura na presença dos biomateriais em microscópio de luz invertido com contraste de fase (Axiovert A1, Zeiss). Foi realizada a comparação com a morfologia dos controles, sendo o controle positivo citotóxico uma amostra de látex e o negativo não citotóxico foi o papel-filtro. Também foi mantida a cultura da linhagem celular sem a presença de biomateriais ou controles. Os ensaios foram realizados com triplicata de amostras. O ensaio foi realizado seguindo metodologia determinada pela norma ISO e reconhecida internacionalmente. 367

3 2.3 Adesão celular Para estudar como as células se comportam no que se refere à adesão sobre os biomateriais foi utilizado o microscópio eletrônico de varredura (MEV - FEI Quanta 250) devido à possibilidade de observar as células sobre a superfície das amostras. Amostras dos biomateriais foram inoculadas com uma suspensão com alta densidade de células Vero. Após 24 horas dessa cultura mantida nas condições padrão, descritas anteriormente, as amostras foram levadas para uma solução de 2,5% de glutaraldeído, o que resulta na fixação das células por meio da formação de ligações cruzadas. As amostras, agora fixadas, foram desidratadas em série crescente de etanol e levadas a um secador de ponto crítico (Leica EM CPD300). Por fim as amostras foram recobertas com uma camada de 10 nm de ouro em um equipamento de pulverização catódica, ou sputtering (Leica EM ACE600), permitindo sua observação ao MEV. Como controle de comparação foi utilizada uma lamínula de microscopia que passou pelo mesmo processo de inóculo e preparo que as outras amostras, servindo como um controle de adesão. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Citotoxicidade por contato direto Ao observar os controles do ensaio, percebe-se que as células na condição do controle positivo citotóxico (C+) apresentam uma morfologia levemente arredondada, com uma significativa presença de grânulos no citoplasma e com algumas células em suspensão, o que é condizente com uma condição de citotoxicidade. Já o controle negativo não citotóxico (C-) se mostrou muito similar com a da própria linhagem, com as células em formato alongado, poucos grânulos visíveis no citoplasma e sem grande presença de células arredondadas ou em suspensão, sendo essas as condições esperadas para um efeito não citotóxico. Comparando os controles com as culturas em contato com os biomateriais foi constatado que as matérias-primas de QTS e de PVOH, quando em estado individual, provocaram uma leve alteração na morfologia celular, com uma pequena elevação na quantidade observada de células mais arredondadas. Porém, de modo geral, a monocamada celular estava ainda similar com a morfologia de C- e sem a observação de lise celular ou redução de proliferação, o que permite considerar estes casos como padrão levemente citotóxico. Também vale a pena ressaltar que o PVOH, quando em contato com o meio de cultura, rapidamente se solubilizou quase que completamente, podendo essa ser a causa da alteração observada para esta amostra. Para as blendas, tanto no caso da blenda não reticulada quanto para as reticuladas com glutaraldeído e com glioxal, foram observadas morfologias semelhantes à C-, sem desvios significativos do que se espera para um biomaterial não citotóxico. A comparação entre os efeitos dos diferentes biomateriais para as células Vero pode ser vista na Fig

4 Figura 1: Micrografias da morfologia celular das culturas da linhagem Vero em contato com diferentes biomateriais. [C+] Controle positivo com látex. [C-] Controle negativo com papel-filtro. [Blenda] Quitosana/PVOH (3:1). [Gluta] Blenda reticulada com glutaraldeído. [Glioxal] Blenda reticulada com glioxal. 369

5 Estes resultados sugerem que as propriedades ganhas ao se desenvolver a blenda de QTS/PVOH resultam no padrão de não citotoxicidade observado. O uso dos agentes reticulantes, glutaraldeído e glioxal não contribuíram para o surgimento de nenhum efeito citotóxico em nenhuma das concentrações utilizadas, de 1% e de 5%. 3.2 Adesão celular Como descrito anteriormente, a adesão celular sobre os biomateriais foi avaliada por observação em MEV. Foram observadas diferentes condições de adesão e espalhamento celular para as diferentes amostras. Não foi possível a avaliação da adesão sobre o PVOH, uma vez que sua solubilização no meio de cultura evitou que houvesse qualquer substrato sólido sobre o qual as células pudessem aderir. Nenhuma outra amostra sofreu do mesmo problema, de modo que apenas o PVOH não pôde ser avaliado nesta etapa. A QTS pura não se mostrou um substrato ideal para a adesão das células, pois no MEV, o que se observou foi um baixo número de células sobre a superfície da amostra e estas apresentaram uma morfologia arredondada ou irregular, indicando que não foram capazes de realizar a adesão de maneira adequada. No caso da blenda não reticulada não foi observado um grande número de células aderidas. Mas as células aderidas apresentaram morfologia espalhadas típicas de adesão, e a morfologia arredondada de uma célula não totalmente aderida, sugerindo que um tempo maior de estudo permita uma avaliação mais adequada deste parâmetro. Na amostra da blenda reticulada com 1% de glutaraldeído foi observada uma quantia considerável de células em morfologia condizente com boa adesão e proliferação. Porém na amostra reticulada com 5% de glutaraldeído foram observados muitos detritos, sem ser possível distinguir se eram de origem do próprio biomaterial ou se eram detritos celulares, mas ainda assim foi observada uma quantia razoável de células e estas também apresentavam morfologia boa adesão sobre o biomaterial. Já nas blendas reticuladas com glioxal foram observadas boas condições de adesão, com um grande número de células sobre a superfície da amostra, com morfologia poligonal e espalhada de uma célula com boa adesão a um substrato. Uma comparação entre os diferentes biomateriais pode ser observada na Figura

6 Figura 2: Micrografias de MEV da superfície das diferentes amostras estudadas para adesão celular. Os formatos circulares foram usados para destacar células em boas condições de adesão, enquanto que os formatos retangulares destacam as células em más condições de adesão. [Blenda] Quitosana/PVOH (3:1). [Gluta] Blenda reticulada com glutaraldeído. [Glioxal] Blenda reticulada com glioxal. 371

7 As amostras com melhor desempenho, portanto foram as reticuladas com glioxal e com glutaraldeído a 1%. Lembrando que a adesão celular é fortemente influenciada pelo grau de desacetilação da QTS vale a pena explorar em trabalhos futuros se a variação deste parâmetro estimularia uma maior adesão na matéria-prima e nas blendas (Nascimento & Lombello, 2016). O que se observa após a análise destes resultados é que a concentração dos agentes reticulantes não parece influenciar no comportamento celular, com exceção da reticulada com 5% de glutaraldeído que teve uma capacidade de adesão celular não tão boa quanto as outras formas de reticulação. Ensaios futuros de interação celular serão realisados com as formas de reticulação com o melhor desempenho. 4. CONCLUSÕES Com este trabalho, o que é possível concluir é que as blendas de QTS e PVOH apresentam potencial de uso em aplicações clínicas, incluindo engenharia de tecidos. No que diz respeito à citotoxicidade, as blendas foram igualmente superiores em relação às matérias-primas individuais. Porém ao avaliar também a adesão e interação celular sobre os diferentes biomateriais, foi observado que a blenda reticulada com 5% de glutaraldeído teve um desempenho inferior, enquanto que as reticuladas com glioxal, em ambas as concentrações e a com 1% de glutaraldeído mostraram um excelente desempenho. Isso indica que as variações na adesão provavelmente tem sua origem em variações superficiais do material. Maiores investigações a respeito de caracterização dos biomateriais tais como rugosidade e molhabilidade superficiais, espectroscopia de FTIR e Raman serão realizados e com isso espera-se identificar como os diferentes métodos de reticulação afetam a estrutura química e as características superficiais deles e dão origem às diferenças na interação celular. AGRADECIMENTOS Agradecimentos são devidos para a Universidade Federal do ABC (UFABC) pela disponibilização da infraestrutura laboratorial para o grupo de pesquisa. Os autores também são gratos à Central Experimental Multiusuários (UFABC) pelo apoio experimental, em especial no que diz respeito à utilização do MEV. REFERÊNCIAS ATCC. (2017). "Vero (ATCC CCL-81 TM )". Disponível em: Banoriya, D., Purohit, R. e Dwivedi, R. K. (2017). "Advanced Application of Polymer based Biomaterials", Materials Today: Proceedings, 4(2), Bhattarai, N., Gunn, J. e Zhang, M. (2010). "Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery", Advanced Drug Delivery Reviews, 62(1), FDA. (2016). "Use of International Standard ISO , Biological evaluation of medical devices - Part 1: Evaluation and testing within a risk management process. " Disponível em: 90.pdf ISO. (2009). "Biological evaluation of medical devices Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity." Masson, A. O. (2016), "Estudo comparativo de ensaios de citotoxicidade aplicados à biomateriais : metodologias e condições de ensaio", Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do ABC, São Bernardo do Campo. Nascimento, M. H. M. do e Lombello, C. B. (2016). "Hidrogéis a base de ácido hialurônico e quitosana para engenharia de tecido cartilaginoso." Polímeros, 26(4),

8 Pandele, A. M., Ionita, M., Crica, L., Dinescu, S., Costache, M. e Iovu, H. (2014). "Synthesis, characterization, and in vitro studies of graphene oxide/chitosan-polyvinyl alcohol films", Carbohydrate Polymers, 102, Park, S. Y., Jun, S. T. e Marsh, K. S. (2001). "Physical properties of PVOH/chitosan-blended films cast from different solvents", Food Hydrocolloids, 15(4 6), CYTOTOXICITY ASSAY OF GLUTARALDEHYDE AND GLYOXAL CROSS-LINKED CHITOSAN/PVOH BLENDS Felipe N. Ambrosio 1, Caue d S. Souza 1, Gustavo N. Nunes 1, José C. Moreira 1, Ana P. Romani 1, Christiane B. Lombello 1 1 Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas (CECS) da Universidade Federal do ABC (UFABC), São Bernardo do Campo (SP), Brasil felipe.nogueira@ufabc.edu.br Abstract. Polymeric biomaterials show a wide variety of physicochemical properties, which allows for a versatile use into clinical applications, such as the overlaying of lesions originated from surgical proceedings for bone cancer removal, promoting the local protection, allowing a better recovering for the patient. They can be associated with antiinflammatory and/or anti-tumor drugs. Aiming such applications, chitosan (QTS) and poly(vinyl alcohol) (PVOH) blends were characterized by direct cytotoxicity assays to evaluate their biocompatibility. Pure samples of QTS and PVOH were evaluated, as well as QTS/PVOH (3:1) blends with and without cross-linking promoted by glutaraldehyde or glyoxal. Samples of the biomaterials were deposited into multiple well plates containing cells from the Vero lineage in semi-confluent conditions. The results were observed with phasecontrast light inverted microscope after 24 hours contact between the samples and the cell cultures, which were stored at temperature of 37ºC and with 5% atmospheric CO2. No sample showed significant cytotoxic behavior, this allows for the continued use of these biomaterials for future tissue engineering oriented studies. Keywords: Chitosan, Cytotoxicity, Tissue Engineering, Poly(vinyl alcohol), Vero cells 373