INFLUÊNCIA DA RAZÃO Na/Ca SOBRE A BIOATIVIDADE E CINÉTICA DE DISSOLUÇÃO DE BIOVIDROS
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- Tomás Costa do Amaral
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1 INFLUÊNCIA DA RAZÃO Na/Ca SOBRE A BIOATIVIDADE E CINÉTICA DE DISSOLUÇÃO DE BIOVIDROS R. Borges e J. Marchi Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH), Universidade Federal do ABC (UFABC), Campus Santo André, SP, Brasil Av. dos Estados, 5001, Bangu, Santo André, SP, , Brasil roger.borges@aluno.ufabc.edu.br, juliana.marchi@ufabc.edu.br RESUMO Apesar do mecanismo de bioatividade dos biovidros ser bem estabelecido na literatura, o processo de dissolução de materiais vítreos, de modo geral, ainda necessita de estudos experimentais mais aprofundados. Neste trabalho, biovidros com diferentes razões Na/Ca foram obtidos por fusão/resfriamento e caracterizados quanto ao perfil de dissolução em solução TRIS-HCl e bioatividade em solução SBF por diferentes períodos. Os vidros foram analisados por difração de raios X e microscopia eletrônica de varredura para a avaliação das fases cristalinas e caracterização morfológica dos materiais. Após diferentes períodos do teste de dissolução, alíquotas da solução tampão foram retiradas para avaliação elementar dos íons liberados (cálcio, sódio, fósforo e silício) por espectroscopia por emissão de plasma acoplado indutivo. Os resultados indicaram a existência de dois diferentes mecanismos de dissolução: a criação de canais propiciados por átomos de cálcio e a difusão de sódio coordenados por outros átomos de sódio. Além disso, a bioatividade é afetada pela razão Na/Ca devido às mudanças no comportamento de dissolução. Palavras-chave: biocerâmicas, biovidros, dissolução, bioatividade INTRODUÇÃO Biovidro é um termo genérico que abrange uma classe de biocerâmicas vítreas propostas por Larry Hench na década de 70. Inicialmente baseada no sistema SiO2- Na2O-CaO-P2O5, hoje esta classe abrange sistemas mais complexos e/ou reduzidos, como vidros boratos (1,2). Contudo, todos estes vidros, independentemente de suas composições química, exibem o fenômeno de bioatividade, que consiste na 1814
2 nucleação de uma camada superficial de hidroxiapatita formada durante a interação do biovidro com o tecido adjacente. Durante o processo de bioatividade dos biovidros, as expressões de alguns genes de células osteoblásticas são estimulados (4), além disso, biovidros também podem exibir outras propriedades, tais como estimular a angiogênese in vitro e in vivo (4), além de atividade bactericida (3). Tem sido observado que os produtos de dissolução iônica dos vidros (Si 4-, Ca 2+, PO4 3-, Na + ) são os responsáveis pela resposta biológica destes materiais quando implantados em um tecido hospedeiro. Neste processo, há a dissolução dos biovidros e os produtos iônicos deste processo, presentes em solução, interagem com receptores na superfície celular (4). Assim, a dissolução dos biovidros pode ser controlada através de alterações na composição química dos óxidos da estrutura vítrea. Esta variação na composição química não altera apenas a cinética de dissolução, como também altera o comportamento biológico: bioinerte, bioativo ou bioabsorvível. Sendo: 1) bioativas as composições que apresentam baixa degradação, mas ligam-se quimicamente com o tecido adjacente através da nucleação da camada de hidroxiapatita; 2) bioabosrvíveis as composições que apresentam alta taxa de degradação, sendo completamente degradadas no corpo humano ao mesmo passo que induzem uma proliferação e regeneração do tecido adjacente danificado; 3) bioinerte as composições que apresentam baixa taxa de degradação e não interagem com o tecido adjacente, formando-se uma cápsula fibrosa envolta do material devido à falta de biocompatibilidade (1). Apesar da importância da dissolução dos vidros dentro do tecido hospedeiro, o mecanismo de dissolução dos biovidros ainda não é totalmente formalizado na literatura. De acordo com Da Silva et al. (5) o mecanismo de dissolução de biovidros ocorre devido à formação de canais de cálcio que favorecem a lixiviação iônica da rede vítrea. Este mecanismo é restrito aos vidros que pertençam ao diagrama de fases {[(CaO)y : (R2On)1-y]x : (SiO2)3-x}1-z : (Na2O)z. Nesta relação, as melhores taxas de formação de canais de percolação ocorrem quando 0,3 z 0,4. Contudo, este modelo é diferente do qual tem sido proposto por Tillloca (6), o qual observou, por dinâmica molecular, que o mecanismo de dissolução dos biovidros seria favorecido por difusão de átomos de sódio pela matriz vítrea por meio de canais de sódio. Nestes canais, átomos de sódio substituem a posição do átomo subsequente, levando a um mecanismo de difusão, o qual tem energia minimizada quando um átomo de sódio também é coordenado por outros átomos de sódio. 1815
3 O objetivo deste trabalho foi relacionar o comportamento da dissolução de biovidros em solução TRIS-HCl com seu comportamento de bioatividade in vitro após ensaios em SBF em diferente períodos para ambos os testes. Para tanto, foram obtidos biovidros com três diferentes razoes Na/Ca, cujas composições apresentam diferentes características de comportamento biológico (bioativo, bioabsorvível e intermediário). MATERIAIS E MÉTODOS Os biovidros foram obtidos a partir do sistema 48SiO2-(37-x)Na2O-(9+x)CaO- 6P2O5 (x = 0, 5 e 20). Optou-se por estudar vidros com diferentes razões Na/Ca, pois vidros com maiores teores de sódio (x=0), apresentam comportamento bioabsorvível (BG-Na), enquanto vidros com maiores teores de cálcio (x=20) apresentam comportamento bioativo (BG-Ca). Vidros com valores intermediários de Na e Ca (BG, x=5) apresentam comportamento de transição entre bioabsorvível e bioativo. Os precursores utilizados para a obtenção dos biovidros foram: óxido de silício (SiO2), hidróxido de sódio (NaOH), óxido de cálcio (CaO) e pentóxido de fósforo (P2O5). Os precursores foram submetidos a tratamento térmico para obtenção de biovidros por fusão, em 1500 C/2h (taxa de aquecimento de 5 C/min), seguido de rápido resfriamento em placas de latão (temperatura ambiente). Os materiais resultantes foram moídos em almofariz e peneirados em peneira #125µm. Os materiais foram caracterizados por difração de raios-x (DRX, Multiflex, Rigaku) para verificação da natureza amorfa dos vidros. A microestrutura das amostras foi avaliada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV, JSM-6010LA, JEOL). A dissolução dos biovidros foi realizada em solução TRIS-HCl, de acordo com a ISO (International Standard, 2001). As amostras na forma de pó foram imersas em solução TRIS-HCl a 37 o C, a 120 r.p.m, pelos períodos de 1h, 3h, 24h e 120h. Após cada período de imersão, uma alíquota do sobrenadante foi retirada e armazenada sob refrigeração para avaliação da análise elementar de Ca, P, Na e Si por Espectrometria de Emissão Atômica por Plasma Acoplado Indutivamente (ICP- OES). A bioatividade foi avaliada por imersão em solução SBF (Simulated Body Fluid) em condições corpóreas (37 C e ph 7,25). Após o ensaio de bioatividade, os vidros foram avaliados por difração de raios X, espectroscopia de infravermelho na transformada de Fourier e microscopia eletrônica de varredura para identificação das fases cristalinas, estrutura e microestrutura das partículas, respectivamente. 1816
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados de difração de raios X mostraram um perfil predominantemente amorfo em todas as composições estudadas (Fig. 1a detalhe), caracterizadas pela ausência de picos de difração e por uma banda de difração próximo à Esta banda é típica de vidros silicatos, evidenciando a obtenção de materiais vítreos sem uma possível cristalização durante o seu processamento. Na Fig. 1a são apresentados os resultados de difração de raio X dos biovidros após 1 dia de imersão em solução SBF a 37 o C para as composições BG e BG-Ca e após 7 dias de imersão para a composição BG-Na, os quais foram os tempos mínimos necessários para observar a formação da camada superficial de hidroxiapatita cristalina. a) b) c) d) Figura 1: Difratogramas de raios X dos biovidros (a) antes (em detalhe) e após imersão em solução SBF. Espectros de Infravermelho das amostras BG-Na (b), BG (c) e BG-Ca (d) antes e após diferentes períodos de imersão em solução SBF. Legenda: * = Hidroxiapatita. 1817
5 Nas Fig. 1b, 1c e 1d são apresentados os espectros de infravermelho das composições BG-Na, BG e BG-Ca, respectivamente. Em relação à composição BG- Na, apesar dos resultados de DRX sugerirem formação de hidroxiapatita apenas após o 7º dia de imersão em solução SBF, os espectros de FTIR demonstram que após 3 dias de imersão já foi possível detectar a presença de picos associados à P=O cristalino (565 e 605 cm -1 ). Para a composição BG, a presença das mesmas ligações também é observada após 3 dias de imersão em solução. Para a composição BG-Ca, no entanto, não é possível observar este comportamento. As divergências entre os dados de FTIR e DRX podem ser explicadas devido à uma deposição de fosfato de cálcio amorfo ou parcialmente amorfo na superfície dos biovidros, não sendo possível verificar ligações P=O cristalino como no caso da composição BG-Ca, bem como não sendo possível ser detectado fases cristalinas na difração de raio X, como no caso da composição BG-Na. As superfícies das amostras antes dos ensaios podem ser observadas nas Fig. 2a-c. Com o intuito de observar quando é formada uma camada de fosfato de cálcio na superfície dos biovidros, independentemente de ser amorfa ou cristalina, verificou-se por MEV o primeiro período o qual formou-se tal camada. Foi observado que após 1 dia de imersão em SBF já possível observar a deposição de uma camada de fosfato de cálcio para as composições BG-Na (Fig. 2d) e BG (Fig. 2e), enquanto que para a composição BG-Ca (Fig. 2f) só é possível observar após 7 dias de imersão. a) b) c) d) e) f) Figura 2: Micrografias eletrônicas de varredura da superfície inicial das amostras BG-Na (a) BG (b) e BG-Ca (c). Superfície das amostras BG-Na (d), BG (e) e BGCa (f) após imersão em solução SBF. 1818
6 Na Fig. 3 estão apresentados os perfis de dissolução dos biovidros. De forma geral, a dissolução dos biovidros pode ser dividida em dois diferentes fenômenos: a variação da concentração de cálcio e fosforo em solução e a variação da concentração de silício e sódio. Isto porque o cálcio e fósforo apresentam uma maior tendência à precipitação e posterior adesão à superfície das partículas durante o processo de degradação (7). Como pode ser observado na Fig. 3, a variação da concentração de fosforo é positiva até o período de 24h para a composição BG-Na e até o período de 3h para as composições BG e BG-Ca. Após este período, ocorre uma variação negativa na concentração do fósforo, a qual está associada com a sua deposição na superfície das partículas. De forma análoga, na composição BG-Na há um aumento na concentração de cálcio até o tempo de 1h, procedida de uma diminuição da concentração até o tempo de 24h, novamente procedida de um aumento da concentração. Acredita-se que esta variação negativa entre 1h e 24h está associada à deposição de cálcio na superfície do vidro. Além disso, possivelmente esta variação negativa da concentração de cálcio não foi observada para as composições BG e BG-Ca devido ao fato de que estas composições apresentam maior quantidade em massa de cálcio em sua estrutura. Assim, é possível que a quantidade de cálcio liberado em solução foi maior do que a quantidade precipitada, não havendo variação negativa. De acordo com Spulveda et al. (7) a cinética de dissolução dos biovidros pode ser dividida em dois estágios por um conjunto de duas equações diferenciais de cinética química de primeira ordem em função da concentração de silício e do tempo. Devido ao fato de serem duas equações, a dissolução dos biovidros pode ser também caracterizada por duas taxas de dissoluções, X K1 e X K2, onde X é o elemento químico associado à taxa de dissolução. A escolha de determinar a concentração de silício deve-se ao fato que a rede tridimensional de silício é a última estrutura ao sofrer quebra das ligações químicas, sendo os íons alcalinos e alcalinos terrosos(também denominados modificadores de rede vítrea) os primeiros elementos à serem lixiviados. 1819
7 a) b) c) Figura 3: Perfil da variação da concentração elementar de cálcio, fósforo, sódio e silício dos biovidros de diferentes composicoes em função do tempo de imersão em solução TRIS-HCl. Na Fig. 4 estão apresentados os gráficos da variação da concentração de Na (Fig. 4a) e Si (Fig. 4b) em função do tempo. Nos resultados obtidos, a cinética de dissolução dos biovidros foi dividia em duas constantes, K1 e K2, que estão associadas à dissolução antes e após ao tempo de 3h, respectivamente. A região em destaque em azul no gráfico denota o período da reação em que a taxa de dissolução é governada pela constante K1, enquanto a outra região remanescente é governada pela constante K2. Nas Figuras 5a-b e 6a-b estão apresentadas, respectivamente, a variação da concentração de Na e Si nas regiões governadas pelas diferentes constantes de cinética de dissolução. A Figura 6c apresenta a correlação entre Si K1 e a razão Na/Ca das amostras. Os valores das constantes de cinética de dissolução, K1 e K2, estão apresentados na Tabela 1 em função da concentração de Si e Na, a) b) Figura 4: Perfil da taxa de dissolução dos biovidros em função da concentração de (a) Na e (b) Si. Destaque para as duas diferentes regiões com diferentes taxas de dissolução, Na K1 e Na K
8 a) b) Figura 5: Variação da concentração de Na em função do tempo nas regiões governadas pelas cinéticas de dissolução (a) Na K1 e (b) Na K2. a) b) c) Figura 6: Variação da concentração de Si em função do tempo nas regiões governadas pelas cinéticas de dissolução (a) Si K1 e (b) Si K2. Relação entre a taxa de dissolução Si K1 e a razão Na/Ca (c) evidenciando uma correlação entre a quantidade molar de cálcio na composição química e as taxas de dissolução. Tabela 1: Valores da taxa de dissolução de Si ( Si K) e Na ( Na K) em função das diferentes composições químicas dos biovidros. Composição dos biovidros Si K 1 (µg.ml -1.t -1/2 ) Si K 2 (µg.ml -1.t -1/2 ) Na K 1 (µg.ml -1.t -1/2 ) Na K 2 (µg.ml -1.t -1/2 ) BG-Na 19, ,44 39,78 BG 23,17 2,23 78,72 21,85 BG-Ca 26,70 1,68 22,58 29,
9 Em relação à região governada pela taxa de dissolução Si K1, observa-se que a degradação da rede vítrea é diretamente influenciada pela relação Na/Ca, de forma que quanto maior a concentração de Ca nas amostras, maior é a taxa de dissolução (Fig. 6ª e 6c). Este fenômeno está de acordo com experimentos realizados por Da Silva et al. (5), os quais demonstraram que o mecanismo de percolação é favorecido pela presença de íons cálcios, que por sua vez competem com espécies R2On por posições de modificadores de rede vítrea. Por outro lado, em relação à taxa de dissolução Na K1, observa-se que a mesma varia proporcionalmente à concentração de sódio na composição química das amostras, como já se era de esperar, uma vez que estes íons apenas participam do processo de lixiviação sem interferir no processo de degradação da matriz vítrea dentro do regime K1. Na região governada por Si K2, por outro lado, já é observado o oposto: a variação de taxa de dissolução é dependente da concentração de Na. Isso ocorre pelo mecanismo de difusão demonstrado por Tilloca (6) através de simulação computacional por dinâmica molecular. Neste mecanismo, íons Na + são percolados na rede vítrea através de canais. Nestes canais, íons de Na + ocupam a posição do íons Na + sucessores, até atingirem a superfície do material vítreo e serem lixiviados para a solução. Durante a percolação, se íons Na + são coordenados por outros íons Na + (Na-Na), esta difusão é mais facilitada do que se os mesmos fossem coordenados por íons Ca (Na-Ca), devido a uma diminuição da energia requerida para o sódio migrar de uma região para a outra. Desta forma, a composição BG-Na, que tem uma maior concentração de Na, tem um maior número de átomos que apresentam a coordenação Na-Na, favorecendo a difusão de Na até a superfície dos vidros. A diminuição das taxas de dissolução nas regiões Si K2 e Na K2, em relação à Si K1 e Na K1, respectivamente, podem ser explicadas de acordo com a ilustração da Fig. 7. Este mecanismo ocorre em 5 diferentes estágios: 1) no primeiro estágio, ligações de oxigênio não ponte são atacadas quimicamente por moléculas de água favorecidas por sítio ricos em sódio e cálcio; 2) como consequência desta reação, há a liberação dos íons modificadores de rede e o início da dissolução dos biovidros à uma taxa denominada K1 devido a criação de canais de percolação favorecidos por cálcio. Durante este processo, ocorre a formação de uma camada de silanol (Si-OH) na superfície dos vidros, devido às reações de hidratação de oxigênios pontes e não pontes com as moléculas de água; 3) esta camada superficial de silanol favorece a 1822
10 precipitação de fosfatos e cálcio livres na forma iônica em solução, levando à nucleação de hidroxiapatita na superfície dos vidros; 4) a partir deste momento, a taxa de liberação dos demais íons à solução é governada pela taxa de dissolução K2, onde a difusão dos íons é favorecida por coordenação do tipo Na-Na, promovendo a lixiviação de sódio para a solução. Uma vez que os produtos de degradação da rede vítrea têm que ultrapassar a camada de hidroxiapatita até alcançarem a solução, pode-se entender que esta camada de HAp retarda a difusão destes íons, sendo responsável pelos menores valores da taxa de dissolução na região K2; 5) por fim, há a intensificação da dissolução da rede vítrea controlada pela taxa de dissolução K2, bem como aumento da espessura da camada de hidroxiapatita. Figura 7: Representação esquemática do mecanismo de dissolução relacionado com as taxas de dissolução K1 e K2. Considerando que os fenômenos de dissolução e bioatividade estão associados um ao outro, o retardo da bioatividade observado para a amostra BG-Ca poderia estar associado à uma menor dissolução destas amostras. Dados de simulação computacional de Tilloca & Cormarck (8) mostraram que a razão Na/Ca também pode influenciar na formação de clusters de Ca-P na rede vítrea, bem como alterar a coordenação de espécies Si(Q) n. Para razões Na/Ca > 1, átomos de sódio poderiam formar clusters na estrutura vítrea, possivelmente favorecendo a difusão destes átomos. Para razões Na/Ca <1, os átomos cálcio deslocam os átomos de sódio para regiões de coordenação Q 2, além de favorecer a formação de clusters de cálcio. Além disso, quando Na/Ca < 1, há também a formação de clusters de cálcio possivelmente associados à fósforo, isto impediria uma maior dissolução da rede vítrea e uma possível retardação da dissolução. De fato, foi observado que quanto 1823
11 menor a relação Na/Ca (3.7, 2 e 0.5 para as amostras BG-Na, BG e BG-Ca, respectivamente), menor é a liberação de fósforo para solução, como observado na Fig. 8. Figura 8: Variação da concentração de fósforo em função do tempo 1/2. A região destacada em verde evidencia uma possível precipitação de fósforo devido à formação de hidroxiapatita. Observa-se que a variação de P ( [P]) é maior para valores da razão Na/Ca maiores. CONCLUSÕES Os resultados indicam que a cinética de dissolução dos biovidros pode ser controlada pela razão Na/Ca, sendo governada por átomos de cálcio no regime K1 e átomos de sódio no regime K2. Quanto maior a concentração de sódio na composição química, maior será a dissolução da amostra. Para razão Na/Ca < 1 (BG-Ca) foi observado um retardamento da nucleação de hidroxiapatita na superfície da amostra. Estes dados colaboram para a compreensão dos fenômenos associados com a dissolução de biovidros e podem auxiliar no desenvolvimento de biovidros com melhores propriedades biocompatíveis. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Universidade Federal do ABC (UFABC), CNPq e FAPESP pelo suporte financeiro; ao CCTM/IPEN, em especial ao Laboratório de de Microscopia, pela disponibilidade de utilização do microscópio eletrônico de 1824
12 varredura e ao CLA/IPEN, em especial ao aluno de doutorado Cássio Lima, pela disponibilidade e auxilio no manuseio do espectrômetro de infravermelho. REFERÊNCIAS (1) Hench LL, Wilson J. An introduction to bioceramics. Advanced Series in Ceramics. World Scientific, USA, (2) Hench, L.L.; Ethidge, E.C. Biomaterials: An Interfacial Approach. Academic Press, NY, (3) Wilson, J.; Noletti, D.; Bonding of soft tissues to bioglass, in: T. Yamamuro, L.L. Hench, J. Wilson (Eds.). Handbook of Bioactive Ceramics, Bioactives Glasses and Glass Ceramics, 1. CRC Press, Boca Ration, FL, (4) Xynos I.D. et al. Gene-expression profiling of human osteoblast following treatment with the ionic products of Bioglass 45S5 dissolution. J Biomed Mater Res., (2001) 55(2), 151; (5) Da Silva et al. Vidros com efeito percolativo: possível modelo composicional. Anais do Congresso Brasileiro de Cerâmica (2014), (6) Tilocca, A. Sodium migration pathways in multicomponent silicate glasses: Car Parrinello molecular dynamics simulations. The Journal of Chemical Physics (2010) 133, (7) Sepulveda P., Jones, JR, Hench, LL. In vitro dissolution of melt-derived 45S5 and sol-gel derived 58S bioactive glasses. Journal of Biomedical Materials Research. (2002) 61(2), (8) Tilocca, A., Cormack, AN. The Structure of Bioactive Silicate Glasses: New Insight from Molecular Dynamics Simulations. Chem. Mater. (2007) 19,
13 Na/Ca RATIO INFLUENCE ON THE BIOACTIVITY AND DISSOLUTION KINETICS OF BIOGLASSES RESUME Although the bioactivity mechanism of bioglasses is already well established, the dissolution process is not well detailed. In this work, bioglasses containing different Na/Ca ratios were synthesized, and had their dissolution profile evaluated in TRIS- HCl solution, and bioactivity ability tested in SBF solution. The glasses were characterized by X ray diffraction, scanning electron microscopy, and Fourier transform spectroscopy, in order to evaluate the crystalline phases and morphology. After different periods immersed in the dissolution test, aliquots were taken out for subsequent analysis of the released ions (calcium, sodium, phosphorus and silicon) by inductive coupled plasma emission. The results suggest there are two different dissolution mechanism involved, where the first one is associated with the formation of Ca channels into the glass matrix, and another related to Na diffusion promoted by Na atoms coordinated by other Na atoms. In addition, the relation Na/Ca directly influences on the bioactivity due to change in the dissolution behavior. Key words: bioceramics, bioglasses, dissolution, bioactivity 1826
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