AVALIAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA E TEMPERATURAS DE INCUBAÇÃO NO ISOLAMENTO DE Salmonella SPP. EM SUABES

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1 AVALIAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA E TEMPERATURAS DE INCUBAÇÃO NO ISOLAMENTO DE Salmonella SPP. EM SUABES Greice Filomena Zanatta Stoppa 1, Ana Lúcia Sicchiroli Paschoal Cardoso 1, Eliana Neire Castiglioni Tessari 1, Renato Luís Luciano 1, Ana Maria Iba Kanashiro 1 1 Pesquisador Científico do Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola, Instituto Biológico (greice@biologico.sp.gov.br) Descalvado - São Paulo - Brasil Recebido em: 31/3/215 Aprovado em: 15/5/215 Publicado em: 1/6/215 RESUMO Objetivou-se avaliar a eficiência das temperaturas de incubação (37ºC e 41ºC), os caldos de enriquecimento (tetrationato-novobiocina, Rappaport-Vassiliadis, selenito e BHI - brain heart infusion) e os meios para plaqueamento (XLT4, MacConkey, verde brilhante e Hektoen) utilizados no isolamento de Salmonella spp., a partir de suabes provenientes de granjas comerciais de matrizes e frangos de corte. O procedimento bacteriológico foi realizado de acordo com a metodologia oficial estabelecida pela Portaria nº 126. Os resultados indicaram que as temperaturas de incubação, os caldos de enriquecimento, os meios de plaqueamento e a associação entre caldos e meios de plaqueamento apresentaram diferença significativa no isolamento de salmonela (p <,5). A associação entre os meios tetrationato e XLT4 apresentou melhor desempenho no isolamento de Salmonella, independente da temperatura de incubação utilizada. A partir da análise dos dados, pode-se concluir que as variáveis utilizadas neste estudo interferiram na recuperação deste patógeno. PALAVRAS-CHAVE: caldos de enriquecimento, meios de plaqueamento, metodologias, procedimento bacteriológico, salmonelas aviárias. EVALUATION OF CULTURE MEDIA AND INCUBATION TEMPERATURES FOR ISOLATION OF Salmonella SPP. FROM SWABS ABSTRACT This work was to evaluate the efficiency of incubation temperatures (37ºC and 41ºC), the enrichment broths (tetrathionate-novobiocin, Rappaport-Vassiliadis, selenite and BHI - brain heart infusion) and the plating media (XLT4, MacConkey, brilliant green and Hektoen) used in the isolation of Salmonella spp., from swabs of the commercial breeder farms and broiler chickens. The bacteriological procedure was performed according to the official methodology established by Ordinance No The results indicated that incubation temperatures, the enrichment broths, plating media and the association between broths and plating media showed a significant difference in the isolation of salmonela (p <.5). The association between tetrathionate and XLT4 demonstrated the best performance in the Salmonella isolation, regardless of the incubation temperature used. Based on analysis of data, it is possible to conclude that the variables used in the study interfered with the recovery of the pathogen. KEYWORDS: avian salmonellae, enrichment broths, plating media, methodologies, bacteriological procedure ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

2 INTRODUÇÃO Salmonella spp. é um agente patogênico de distribuição mundial, com importância epidemiológica tanto do ponto de vista humano quanto animal. Esta bactéria está relacionada com contaminações nas indústrias alimentícias e consequentemente com surtos de doenças veiculadas por alimentos (BEAM et al., 213). A detecção desse patógeno em animais e produtos alimentícios de origem avícola é fundamental devido aos prejuízos causados na indústria avícola e problemas na saúde pública (FERREIRA et al., 213). Dessa forma, o Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) exige o controle de Salmonella spp. em granjas avícolas, analisando-se distintas amostras como suabes de cloaca, arrasto, fundo de caixa de pintos, ovos bicados, aves mortas e mecônio. A Portaria nº 126 de 3/11/1995 determina como método oficial o isolamento bacteriológico e identificações bioquímica e antigênica (BRASIL, 1995). O sucesso de detecção de Salmonella é dependente da escolha de um procedimento de amostragem adequado combinado com um método de cultura sensível (CARRIQUE-MAS & DAVIES, 28). Métodos utilizados rotineiramente para isolar e identificar Salmonella necessitam de pré-enriquecimento em meios não seletivos, enriquecimento seletivo, plaqueamento em meios seletivos e diferenciais e identificação bioquímica e sorológica (EFSA, 21; WHO, 211). As etapas de enriquecimento e plaqueamento são as que apresentam maior número de recomendações de diferentes meios de cultura e temperaturas de incubação (FLOWERS et al., 1992; WRAY & DAVIES, 1994). Estas etapas são empregadas para auxiliar na recuperação e desenvolvimento de Salmonella e inibir o crescimento de microrganismos competidores (FERNANDES et al., 24). Importantes variáveis limitam a recuperação de Salmonella, incluindo-se os diferentes meios de cultura, o número de patógenos em relação aos competidores, os materiais examinados, o período e a temperatura de incubação (ALBUQUERQUE et al., 2). A influência da concentração de Salmonella e de bactérias interferentes sobre o desempenho de meios de cultura foi reportada por diversos autores (COX & MERCURI, 1978; FLOWERS et al. 1992; WRAY & DAVIES, 1994; ARROYO & ARROYO, 1995). Por este motivo, BERCHIERI JUNIOR et al. (1986) e NASCIMENTO et al. (2) recomendaram o uso concomitante de caldos para o isolamento da bactéria. KUIJPERS et al. (21) relataram que a escolha do meio de enriquecimento seletivo causa maior influência no número de isolamentos positivos do que o tipo de meio de cultura utilizado para plaqueamento. Métodos de detecção de salmonela dependem também do sorovar para o êxito do isolamento, pois determinados sorovares são mais competitivos que outros (JONES, 211). A falta de resultados claros abordando essas variáveis propicia ampla discussão e constante reformulação de meios habitualmente utilizados, bem como o surgimento de novos produtos (FERNANDES et al., 24). Portanto, o objetivo desta pesquisa foi estudar o procedimento de isolamento bacteriológico de Salmonella spp. em amostras de suabes de cloaca e de arrasto, avaliando a influência de duas temperaturas de incubação, dos caldos de enriquecimento e da associação entre os caldos de enriquecimento e os meios de plaqueamento, preconizados pela metodologia oficial do MAPA. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

3 MATERIAL E MÉTODOS Foram analisadas 52 amostras de suabes de cloaca e arrasto, procedentes de três empresas produtoras de matrizes e frangos de corte, localizadas nos estados de São Paulo e Goiás. As amostras foram enviadas ao Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola (CAPTAA), Instituto Biológico, Descalvado-SP, onde foi realizada a análise bacteriológica. O procedimento bacteriológico foi realizado de acordo com a Portaria n 126 de 3/11/1995 (BRASIL, 1995). Os caldos utilizados foram tetrationato-novobiocina, selenito, Rappaport-Vassiliadis, brain heart infusion (BHI) e os ágares MacConkey, verde brilhante e Hektoen. O ágar xilose-lisina-tergitol (XLT4) foi incluído no estudo apesar de não constar na Portaria citada. As amostras foram submetidas à etapa de pré-enriquecimento, com a utilização de água peptonada tamponada na concentração de 1%, sendo as amostras homogeneizadas e incubadas a 36 ± 1ºC, por um período de 18 a 24 horas. Alíquotas das amostras foram submetidas ao enriquecimento seletivo utilizando-se os caldos tetrationato-novobiocina, Rappaport-Vassiliadis, selenito e BHI e incubadas a 37 ± 1ºC e 41 ± 1ºC, entre 18 a 24 horas. Após este período realizou-se plaqueamento com os meios de cultura XLT4, MacConkey, verde brilhante e Hektoen, sendo incubados a 37 ± 1ºC e 41 ± 1ºC, entre 18 a 24 horas. As colônias suspeitas foram submetidas a uma triagem através de testes bioquímicos utilizandose o ágar lisina descarboxilase (LIA), ágar tríplice açúcar ferro (TSI), caldo uréia e meio sulfeto indol motilidade (SIM Medium). As colônias que apresentaram perfil bioquímico compatível com o gênero Salmonella foram inoculadas na série bioquímica complementar. A caracterização antigênica foi realizada segundo exigências do PNSA. Os isolados foram encaminhados para caracterização antigênica completa pelo setor de Enterobactérias do Laboratório de Referência Nacional, Fundação Instituto Osvaldo Cruz (FIOCRUZ) no Rio de Janeiro. Para a análise estatística dos dados de temperaturas de incubação utilizou-se o teste Qui-quadrado (X 2 ), descrito por THRUSFIELD (1995), com um nível de significância de 5% e um intervalo de confiança de 95%. Para a análise das variáveis múltiplas (temperatura, meios de enriquecimento, plaqueamento e suas associações) foi utilizado o teste de Tukey (BANZATTO & KRONKA, 1992). RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram isolados 17 diferentes sorovares de Salmonella spp. Os sorovares identificados foram 11 S. Enteritidis, 9 Salmonella spp., 6 S. 8, 2; z4, z23;-, 5 S. Heidelberg, 4 S. Agona, 3 S. Lexington, 2 S. Anatum, 2 S. Newport, 2 S. Saintpaul e uma cepa de cada dos seguintes sorovares: S. Albany; S. Infantis; S. Mbandaka; S. Schwarzenground; S. Tennessee, S. rugosa; S. O:3, 1:-:1,5 e S. O:9,12:-:-. As frequências de isolamento de Salmonella encontradas neste estudo foram de 48 (92,3%) à 37ºC e 49 (94,2%) à 41 o C. Entretanto, os dados da análise estatística pelo teste Qui-quadrado (X 2 ), mostraram que houve diferença significativa (p <,5) entre as temperaturas de incubação, os caldos de enriquecimento e os meios de plaqueamento utilizados neste estudo. Os resultados referentes aos meios de enriquecimento incubados nas duas temperaturas estão apresentados na Tabela 1. O tetrationato foi estatisticamente melhor para o isolamento de Salmonella, em ambas as temperaturas de incubação. Os caldos selenito e Rappaport-Vassiliadis não apresentaram diferenças estatísticas. Entretanto, observou-se que o Rappaport-Vassiliadis demonstrou ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

4 melhor desempenho quando incubado a 41 o C. O caldo BHI apresentou baixa freqüência de recuperação da bactéria. TABELA 1 Frequência de isolamento de Salmonella spp. em suabes, considerando as temperaturas e os meios de enriquecimento. Temperatura 37 C 41 C Caldos Tetrationato a 4 (76,9%) 43 (82,7%) Selenito b 27 (51,9%) 27 (51,9%) Rappaport b 19 (36,5%) 31 (59,6%) BHI c 3 (5,77%) 2 (3,85%) a, b, c caldos com letras distintas diferem significativamente (p <,5) pelo Teste Tukey A Tabela 2 apresenta os dados referentes ao isolamento de Salmonella considerando-se os caldos de enriquecimento incubados a 37ºC e a 41ºC e os meios de plaqueamento. A análise realizada pelo teste de Tukey demonstrou que as associações entre temperatura / caldo de enriquecimento e temperatura / meio para plaqueamento não apresentaram diferenças estatísticas significativas (p >,5). A análise estatística entre os meios de plaqueamento indicou que XLT4 e Hektoen foram os melhores, enquanto MacConkey e verde brilhante não diferiram entre si. Houve diferenças estatísticas quando foram comparados caldos de enriquecimento / meios para plaqueamento. As combinações de BHI com todos os meios de plaqueamento apresentaram resultados significativos estatisticamente inferiores às demais associações, cujos resultados não diferiram entre si. TABELA 2 Frequência de isolamento de Salmonella spp., considerando-se a associação de meios de enriquecimento e plaqueamento em duas temperaturas. Ágar XLT4 MacConkey Verde Brilhante Hektoen Caldos 37 C 41 C 37 C 41 C 37 C 41 C 37 C 41 C Tetrationato ,1% 8,8% 19,2% 28,8% 15,4% 25% 48,1% 44,2% Selenito 18 34,6% 18 34,6% 11 21,1% 8 15,4% 4 7,7% 6 11,5% 25 48,1% 2 38,5% Rappaport Vassiliadis 32,7% BHI 2 3,8% 48,1% 2 3,8% 5,8% % 13% % 3,8% % 5,8% % 28,8% 1 1,9% 51,9% % Os isolamentos do presente trabalho indicaram melhor recuperação de Salmonella com as associações dos caldos tetrationato, Rappaport-Vassiliadis e selenito com os plaqueamentos em XLT4 e Hektoen, apesar de estatisticamente não significativos. No caso do Rappaport-Vassiliadis, os dados sugerem um melhor desempenho quando incubado a 41 o C. FLORES-ABUXAPQUI et al. (23) salientam que esta temperatura diminui a competição de bactérias gram negativas e ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

5 permite um aumento de células de Salmonella. Em outros estudos também foram reportados maior frequência de isolamentos de Salmonella à temperatura de 42 C (LECLERC et al., 197; ALBUQUERQUE et al., 2; FLORES-ABUXAPQUI et al., 23). Com relação aos caldos de enriquecimento, os resultados do presente trabalho discordam daqueles encontrados na literatura. Os caldos selenito e tetrationato não apresentaram diferença estatística no relato de PAIVA et al. (26). HAMMACK et al. (1999) consideraram o Rappaport-Vassiliadis superior aos demais caldos testados, por ser mais seletivo. Para isolamento de Salmonella em carcaças de aves refrigeradas, os caldos tetrationato e Rappaport-Vassiliadis, mesmo não apresentando diferença estatística significativa, obtiveram taxas de isolamento superiores ao caldo selenito cistina (RALL et al., 25). FLORES-ABUXAPQUI et al. (23) e FERNANDES et al. (24) constataram que o tetrationato apresentou desempenho superior, embora sem diferença significativa, quando comparado ao caldo selenito-novobiocina. Estes autores observaram que o caldo tetrationato apresentou maior número de isolamentos em fezes incubadas a 37ºC ou a 42ºC, quando comparados ao caldo selenito, corroborando com os resultados obtidos na presente pesquisa. NASCIMENTO et al. (2), observaram que existe dificuldade em se determinar qual o melhor caldo ou ágar para o isolamento de Salmonella spp. em diferentes tipos de amostras, e que o melhor desempenho vem da combinação de dois ou mais caldos de enriquecimento e meios para plaqueamento. Embora o ágar XLT4 não seja preconizado na Portaria nº 126 (BRASIL, 1995), esse meio permite uma inibição maior dos microrganismos competidores quando comparados com outros meios e melhor diferenciação das colônias de Salmonella, devido a sua composição (MILLER et al., 1991). O ágar XLT4 pode inibir possíveis competidores e diminuir o número de resultados falsos (FERNANDES et al., 24), inibindo o crescimento de Proteus e favorecendo o isolamento de Salmonella (MILLER et al., 1991). MICHAEL et al. (23) verificaram que o ágar XLT4 foi estatisticamente melhor quando comparado ao ágar verde brilhante. Quando estes autores avaliaram a associação do ágar XLT4 ao tetrationato Müller-Kauffmann a uma temperatura de 37ºC, os resultados foram semelhantes aos reportados na presente pesquisa. NASCIMENTO et al. (2) constataram que os meios de plaqueamento, indistintamente, são eficientes para detecção de Salmonella quando as amostras testadas contêm alta concentração do patógeno, mas conforme há um decréscimo no número de células viáveis as diferenças de rendimento dos meios começam a se acentuar. Os meios MacConkey e verde brilhante não apresentaram bom desempenho na presente pesquisa. Segundo COX et al. (1972) e BERCHIERI JUNIOR et al. (1983), o rendimento desses dois meios é semelhante. FLOWERS et al. (1992), relataram em seus estudos que o ágar MacConkey é considerado como o meio que oferece menor chance de isolar Salmonella. Esses dados coincidem com os relatados no presente estudo. Segundo OIE (212), meios como MacConkey e verde brilhante são indicados para isolamento de S. Gallinarum e S. Pullorum, sorovares que não foram identificados nesta pesquisa. Conforme READ et al. (1994), há variação na freqüência de sorovares de Salmonella dependendo dos meios utilizados tanto para enriquecimento quanto para plaqueamento. Porém, ARROYO & ARROYO (1995) afirmam que o isolamento de ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

6 Salmonella independe do tipo de sorovar, sendo o mais importante a concentração do patógeno e da flora competidora. CONCLUSÃO Os dados apresentados no presente estudo indicaram que para o isolamento de Salmonella spp. em suabes de cloaca e de arrasto em granjas avícolas, os melhores desempenhos foram obtidos com o caldo tetrationato, sem influência das temperaturas de incubação, e os meios de plaqueamento XLT4 e Hektoen. AGRADECIMENTOS Ao professor Dr. Euclides Braga Malheiros, do Departamento de Ciências Exatas, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Campus de Jaboticabal, pela contribuição nas análises estatísticas utilizadas neste estudo. REFERÊNCIAS ALBUQUERQUE, R.; ITO, N.M.K.; MIYAJI, C.I. Estudo comparativo de diferentes meios de cultura para o isolamento de salmonelas em matérias-primas e rações. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.37, n.1, 2. ARROYO, G.; ARROYO, J.A. Efficiency of different enrichment and isolation procedures for the detection of Salmonella serotypes in edible offal. Journal of Applied Bacteriology, v.79, n.4, p , BANZATTO, D.A.; KRONKA, S.N. Experimentação Agrícola. Jaboticabal: Funep- Unesp, p. BEAM, A.; GARBER, L.; SAKUGAWA, J.; KOPRAL, C. Salmonella awareness and related management practices in U.S. urban backyard chicken flocks. Preventive Veterinary Medicine, v.11, n.3-4, p , 213. BERCHIERI JUNIOR, A.; ÁVILA, F.A.; PAULILLO, A.C.; SCHOCKENITUTTINO, R.P., MARQUES, M.A.S.; MATSUDA, H.J. Pesquisa de salmonelas em farinhas de origem animal utilizadas no preparo de ração. Científica, v.11, n.2, p , BERCHIERI JUNIOR, A.; IRINO, PAULILLO, A.C.; NEME, S.N.; FERNANDES, S.A.; KRONKA, S.N.; PESSOA, G.V.A. Eficácia dos caldos selenito-novobiocina e tetrationato-novobiocina na pesquisa de Salmonella em farinha de carne. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.6, p , BRASIL. Portaria n 126, de 3 de novembro de Normas para credenciamento e monitoriamento de laboratórios de diagnóstico das salmonelas aviárias. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 6 de nov Seção I, p , CARRIQUE-MAS, J.; DAVIES, R. Sampling and bacteriological detection of Salmonella in poultry and poultry premises: a review. Revue Scientifique et Technique, v.27, p , 28. COX, N.A.; DAVIS, B.H.; KENDAL, J.H.; KENDALL, J.H., WATSS, A.B., COLMER, ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

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