Nucleótidos e ácidos nucleicos

Transcrição

1 Nucleótidos e ácidos nucleicos

2 Nucleótidos e ácidos nucleicos. Constituintes dos nucleótidos e nucleósidos. Principais nucleótidos no DNA e RNA. Bioquímica do DNA. O DNA como armazenador da informação genética.

3 Watson and Crick Nature 171 (1953) A structure this pretty just had to exist J. Watson, The double helix, 1968 PN Medicina 1962

4 Funções dos nucleótidos Constituintes dos ácidos nucleicos (DNA e RNA) Intermediários de energia nas transacções metabólicas (ATP) Elo químico essencial na resposta da célula a estímulos hormonais e outros estímulos extracelulares(camp) Componente estrutural de cofactores e de diversos metabolitos

5 Genes e DNA Segmento da molécula de DNA que contém a informação para a síntese de uma biomolécula (proteína ou RNA) Uma célula tem milhares de genes DNA é uma grande molécula (supercoiled) O cromossoma mede 1,7 mm e a célula tem 2 m de diâmetro! DNA após a lise de uma célula de E.coli

6 RNA Funções distintas RNA ribossomal rrna Componentes dos ribossomas RNA mensageiro mrna Intermediário da informação genética RNA de transferência trna Moléculas adaptadoras envolvidas na síntese proteica Estrutura química dos ácidos nucleicos (DNA e RNA) Poli(desoxi)ribonucleótidos

7 Fosfato O que é um nucleótido? Base púrica ou pirimídica - Base azotada - Pentose - Fosfato Base azotada + Pentose = Nucleósido Estruturas heterocíclicas (átomos numerados) Desoxi Ligação -N-glicosídica N-9 purina/n-1 pirimidina Carbono 1 ose Ligação éster Carbono 5 ose - fosfato

8 Bases - I Purina Adenina (A) DNA, RNA Bases - II Guanina (G) DNA, RNA

9 Bases - II Pirimidina Citosina (C) DNA, RNA Timina (T) DNA Uracilo (U) RNA

10 Pentoses Ribose aldose Forma furanósica 4 dos 5 átomos do ciclo estão no mesmo plano. C3 vs C5 C2 vs C5

11 Nomenclatura de nucleótidos e ácidos nucleicos Base Nucleósido Nucleótido Ácido nucleic o Purinas Adenina Adenosina Adenilato RNA Desoxiadenosina Desoxiadenilato DNA Guanina Guanosina Guanilato RNA Pirimidinas Desoxiguanosina Desoxiguanilato DNA Citosina Citidina Citidilato RNA Desoxicitidina Desoxicitidilato DNA Timina Desoxitimidina Desoxitimidilato DNA Uracilo Uridina Uridilato RNA

12 Desoxirribonucleótidos Nucléotido Desoxiadenilato (5 -monofosfato de desoxiadenosina) Desoxiguanilato (5 -monofosfato de desoxiguanosina) Desoxitimidilato (5 -monofosfato de desoxitimidina) Desoxicitidilato (5 -monofosfato de desoxicitidina) Símbolo A, da, damp G, dg, dgmp T, dt, dtmp C, dc, dcmp Nucléosido Desoxiadenosina Desoxiguanosina Desoxitimidina Desoxicitidina

13 Ribonucleótidos Nucléotido Adenilato (5 -monofosfato de adenosina) Guanilato (5 -monofosfato de guanosina) Uridilato (5 -monofosfato de uridina) Citidilato (5 -monofosfato de citidina) Símbolo A, AMP G, GMP U, UMP C, CMP Nucléosido Adenosina Guanosina Uridina Citidina

14 Outras bases azotadas menos comuns 5-Metilcitidina N 6 -Metiladenosina N 2 -Metilguanosina 5-Hidroximetilcitidina

15 Inosina Pseudouridina 7-Metilguanosina 4 - Tiouridina

16 Os nucleótidos podem ter grupos fosfatos em várias posições Adenina Adenina Adenosina 5 -monofosfato Adenina Adenosina 2 -monofosfato Adenina Adenosina 3 -monofosfato Adenosina 2,3 monofosfato cíclico

17 Nível primário de estrutura de DNA e RNA - I Terminal 5 Terminal 5 Ligação fosfodiéster Fosfato 5 de um nucleótido ligado ao OH 3 de outro nucleótido Alternância fosfato-pentose Estrutura hidrófila (ligações de H com água) Terminais 5 e 3 Terminal 3 Terminal 3

18 Nível primário de estrutura de DNA e RNA - II Carga negativa a ph7 ionização completa dos grupos fosfato Interacções com cargas positivas Proteínas (histonas), metais (Mg 2+ ), poliaminas (espermina) Terminal 5 Terminal 3 Convenção de escrita 5 para 3 pa-c-g-t-a OH papcpcptpa pacgta Oligonucleótido versus Poli(desoxi)ribonucleótido

19 Ocorre in vitro Hidrólise alcalina do RNA O DNA é resistente (ausência de grupo 2 -OH) Mistura de derivados com fosfatos em 2 e 3 RNA mais curto

20 Propriedades das bases nucleotídicas Bases Moléculas com elevado nível de conjugação (ressonância carácter parcial das ligações duplas. As pirimidinas são planas, as purinas quase planas Absorvem luz na gama UV

21 Propriedades das bases nucleotídicas (cont.) São hidrófobas e insolúveis em água a ph7 Ficam empacotadas de modo a maximizar as interacções hidrófobas Adenina Guanina Timina Citosina Átomos de N e O (grupos carbonilo) Formação de ligações por H Watson e Crick, 1953 Padrões A-G e C-T

22 Estrutura do DNA Níveis hierárquicos de complexidade Nível primário Cadeia de poli(desoxi)ribonucleótidos (sequência de bases e ligação covalente) Nível secundário Qualquer estrutura regular e estável formada por todos ou alguns resíduos de nucleótidos num ácido nucleico Nível terciário Folding (complexo) de cromossomas na cromatina (eucariotas) ou nos nucleóides (bactérias)

23 Bioquímica do DNA Friedrich Miescher (1868) Primeiros estudos químicos sistemáticos do núcleo de uma célula Isolou substância contendo P, a que chamou nucleína leucócitos e esperma de salmão Atribuiu-lhe propriedades ácidas e básicas (DNA + proteína) Só nos anos 40 do séc.xx a estrutura veio a ser conhecida O.T.Avery, C. MacLeod e M. McCarty (1944) Primeira evidência directa de que o DNA é o portador da informação genética O DNA de uma estirpe virulenta confere virulência a uma estirpe não virulenta

24 A experiência de Avery, Macleod e McCarty - I Injecção Bactérias vivas virulentas encapsuladas Rato morto! Bactérias vivas não virulentas não encapsuladas Rato vivo!

25 A experiência de Avery, Macleod e McCarty - II calor Bactérias vivas virulentas encapsuladas Bactérias virulentas mortas pelo calor Rato vivo! F.Griffith Bactérias vivas não virulentas não encapsuladas Rato morto!

26 A experiência de Avery, Macleod e McCarty - III Bactérias vivas não virulentas DNA isolado de bactérias virulentas mortas pelo calor Bactérias vivas não virulentas não encapsuladas Bactérias vivas virulentas encapsuladas Rato morto! A mensagem genética da virulência está no DNA da estirpe virulenta

27 A experiência de Hershey e Chase - I O DNA transporta a informação genética (1952) Uso de fósforo ( 32 P) e enxofre ( 35 S) radioactivos É o DNA viral, e não as proteínas da cápside, que entra na célula do hospedeiro e fornece a informação genética para a replicação viral. Martha Chase e Alfred Hershey O DNA é o único componente cromossómico com informação genética!

28 A experiência de Hershey e Chase - II Experiência com 32 P Cápside não radioactiva DNA radioactivo Fago Experiência com 35 S Cápside radioactiva DNA não radioactivo E.coli Injecção

29 A experiência de Hershey e Chase - III As suspensões são agitadas para separar a cápside Não radioactivo Separação por centrifugação Radioactivo Radioactivo Não radioactivo

30 Nucleótidos e Ácidos Nucleicos 2 Estrutura do DNA. A dupla hélice. Estrutura dos RNAs. Replicação do DNA. Transcrição. Tradução (Biossíntese de proteínas). Nucleótidos funcionais: compostos de elevado conteúdo energético; cofactores; reguladores.

31 As regras de Chargaff Chave da estrutura do DNA final da década de 1940 Dados obtidos a partir de DNA de uma grande variedade de espécies diferentes Erwin Chargaff 1. A composição do DNA em bases azotadas varia, em geral, de espécie para espécie. 2. O DNA de diferentes tecidos da mesma espécie tem a mesma composição. 3. A composição do DNA em bases azotadas não varia com a idade, estado nutricional nem com quaisquer alterações ambientais. 4. Em todos os DNA, independentemente da espécie, o número de resíduos de adenosina é igual ao número de resíduos de timidina (A = T) e o número de resíduos de guanosina é igual ao número de resíduos de citidina (G = C). Daí se conclui que A + G = T + C (purinas = pirimidinas).

32 A dupla hélice 1950s Rosalind Franklin Maurice Wilkins Uso da difracção de raios X na análise de fibras de DNA - as moléculas são helicoidais com dois tipos de periodicidade 1953 Watson e Crick Duas cadeias enroladas em torno do mesmo eixo para formar uma dupla hélice direita

33 A dupla hélice (cont.) Sulco menor Sulco maior ou 34Å? Esqueleto hidrófilo Desoxirriboses e fosfatos estão virados para o exterior. O anel da desoxirribose está na conformação C2 endo. Interior hidrófobo As bases quase planares estão viradas para o interior. O emparelhamento origina um minor groove e um major groove. Há emparelhamento específico A-T e C-G (explicação para as observações de Chargaff)

34 A dupla hélice (cont.) Quanto maior o conteúdo G-C, mais difícil a separação das duas cadeias. Emparelhamento A-T Emparelhamento C-G 2 ligações H 3 ligações H As cadeias são antiparalelas e complementares. O modelo foi construído com base em muitos resultados químicos e biológicos Base para um mecanismo de transmissão da informação

35 A dupla hélice do DNA é mantida por dois tipos de interacções: Ligações de hidrogénio entre bases complementares (A complementaridade das bases é devida às ligações de H entre pares de bases) Interacções hidrofóbicas entre as bases (Interacções não específicas que são o maior contributo para a estabilidade da dupla hélice)

36 A dupla hélice mecanismo para a replicação As cadeias pré-existentes (mãe) separam-se e cada uma delas serve de molde para a síntese de uma cadeia nova (filha) Mecanismo proposto por Watson e Crick (antes de existirem dados experimentais que o provassem) Cadeia mãe Cadeias filhas Cadeia mãe A replicação do DNA é semiconservativa

37 Variações estruturais no DNA

38 As 3 formas do DNA 36 pares de bases Estrutura de Watson e Crick Forma B Mais estável fisiologicamente Outras formas Forma A e Forma Z Estruturas cristalinas bem caracterizadas Forma A Forma B Forma Z

39 NATURE CHEMISTRY ARTICLE JAN 2013 Quantitative visualization of DNA G-quadruplex structures in human cells Giulia Biffi, David Tannahill, John McCafferty & Shankar Balasubramanian

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41 Estruturas dos RNA O DNA está quase exclusivamente no núcleo e a síntese proteica ocorre no citoplasma (ribossomas). Tem que existir um intermediário Anos 1950 O RNA é um forte candidato a ser o intermediário procurado O RNA existe no núcleo e no citoplasma O aumento na síntese proteica é acompanhado por um aumento de síntese do RNA e por um aumento da sua taxa de turnover François Jacob e Jacques Monod Propuseram a designação RNA mensageiro (mrna) e descreveram o processo PN 1965 DNA transcrição RNA

42 Aspectos estruturais dos RNA trna Ligação covalente a um aminoácido Emparelhamento com o mrna rrna Componentes dos ribossomas Outros RNA ribozimas (actividade catalítica) O RNA obtido a partir da transcrição do DNA é sempre em cadeia simples. Estrutura em hélice direita mantida por interacções entre as bases Pur-Pur >>> Pur-Pyr, Pyr-Pyr

43 Estruturas secundárias do RNA Ligações não previstas pelo modelo de Watson e Crick: O grupo 2 -OH da ribose pode fazer ligações de H com outros grupos. Emparelhamentos GU

44 Aspectos estruturais dos RNA (cont.) Phe-tRNA de levedura Emparelhamentos não convencionais Citosina Guanina 7-metilguanina Ribozima hammerhead Vírus de plantas Adenina N 2 -dimetilguanina Ribozima de T.thermophila Intrão com capacidade de autoexcisão Uracilo Diversidade estrutural e diversidade funcional Adenina Adenina

45 A expressão da informação genética DNA mrna Polipéptido Terminal N Colinearidade da sequência codificante de DNA e mrna com a sequência de resíduos de aminoácidos numa cadeia polipeptídica. Replicação Transcrição Tradução Cadeia molde Terminal C Proteína

46 Transcrição do DNA : RNA polimerases Cadeia molde Bolha de transcrição Cadeia não molde O enzima necessita de DNA 5 -trifosfatos de ribonucleósidos (ATP, GTP, CTP, UTP) Mg 2+ (e Zn 2+ ) Canal para NTP Há a formação da bolha transcricional e de um híbrido DNA- RNA Híbrido DNA-RNA Local de síntese Direcção da transcrição

47 Cadeia molde e cadeia codificante As duas cadeias de DNA têm funções distintas na transcrição uma serve de molde à síntese do RNA (cadeia molde). A cadeia de DNA complementar ao molde designa-se por cadeia codificante ou cadeia não molde. É idêntica à molécula de RNA sintetizada (excepto devido à presença de ribose e uracilo). Cadeia não molde (codificante) de DNA Cadeia molde de DNA Transcrito de RNA A cadeia codificante de um dado gene pode estar em qualquer uma das cadeias num cromossoma. Transcritos de RNA

48 Biossíntese de proteínas + de 70 proteínas ribossomas + de 20 enzimas para activar os precursores dos aa + de 12 enzimas e factores auxiliares de iniciação, elongação e terminação + de 100 enzimas para o processamento final das proteínas + de 40 moléculas de trna e rrna ~300 macromoléculas envolvidas no mais complexo processo biossintético que se conhece ~90% da energia dispendida em processos biossintéticos ribossomas, proteínas envolvidas no processo, moléculas de trna existem numa célula bacteriana A síntese de um polipéptido com 100 resíduos de aa leva 5 seg a 37ºC em E.coli

49 Onde tem lugar a síntese proteica? Anos 1950 Injecção de ratos com aminoácidos radioactivos e sacrifício dos animais a tempos fixos após a injecção Preparação de homogenato de fígado Separação de fracções subcelulares por centrifugação Citosol Lúmen do RE Várias horas ou dias após a injecção Todas as fracções contêm proteínas marcadas Alguns minutos após a injecção As proteínas marcadas estão numa fracção que contém pequenas partículas ribonucleoproteicas, visíveis por microscopia electrónica os ribossomas Ribossomas

50 Como é transmitida a mensagem? Francis Crick Uma linguagem de 4 letras (a do DNA) pode ser traduzida numa linguagem de 20 letras (a das proteínas). É necessário um adaptador, talvez um pequeno RNA que se ligue em 2 locais Aminoácido Local de ligação ao aminoácido Adaptador O trna serve de adaptador e traduz a mensagem nucleotídica do mrna na linguagem de aminoácidos. Ao processo de síntese proteica guiada por um mrna chama-se tradução. Tripleto de nucleótidos codificante

51 O Código Genético Anos 1960 Grupos de 2 Grupos de São precisos 3 nt para 1 aa! = 16 < = 64 > 20 As primeiras conclusões Um codão é um tripleto de nucleótidos que codifica para um aa específico A tradução decorre com a leitura sequencial dos codões e sem sobreposição destes. O primeiro codão da sequência inicia uma grelha de leitura. Não há pontuação, i.e. os codões são contínuos. Código sem sobreposição Código com sobreposição

52 O Dicionário da informação genética Primeira letra do codão (extremidade 5 ) Segunda letra do codão Codão de iniciação AUG Codões de terminação UAA UAG UGA (1 em 20) ORF Grelha de leitura aberta

53 Estrutura do RNA de transferência Determinantes estruturais comuns 8 ou mais nucleótidos modificados 5 pg 3 CCA Estrutura em trevo de 4 folhas Braço variável Loop do anticodão com 7 nucleótidos desemparelhados Braço D resíduos de dihidrouridina T ribotimidina - pseudouridina G* - guanilato ou 2 -O-metilguanilato Py pirimidina Pu purina

54 O codão de iniciação O codão AUG especifica o resíduo de metionina que fica no terminal amina. Existe um único codão AUG, mas dois trna Met (um exclusivo para iniciação, o outro para resíduos de metionina no interior da cadeia). Em bactérias, existe um trna Met e um trna fmet. O aminoácido incorporado em resposta ao codão AUG é a N-formilmetionina, que chega ao ribossoma sob a forma de N- formilmetionil-trna fmet.

55 A tradução em bactérias A iniciação A elongação A formação da ligação peptídica

56 A tradução em bactérias (cont.) A translocação do ribossoma A terminação

57 Outras funções dos nucleótidos Transportadores de energia (moléculas de elevado conteúdo energético ) importância em todas as vias biossintéticas Componentes de cofactores enzimáticos Mensageiros químicos... Moléculas de elevado conteúdo energético 5 -fosfatos de ribonucleósidos 5 -fosfatos de desoxiribonucleósidos

58 Componentes de cofactores enzimáticos A adenosina é o elemento comum; não há qualquer outra semelhança estrutural. A adenosina não intervém na reacção, mas a sua remoção leva à remoção drástica da actividade dos cofactores. A adenosina é importante pois potencia a ligação entre o enzima e o substrato, servindo de elo de ligação

59 Componentes de cofactores enzimáticos (cont.) -mercaptoetilamina Ácido pantoténico Transferência grupos acilo Ligação tioéster Coenzima A (CoA) Difosfato de 3 -fosfadenosina Nicotinamida Dinucleótido de adenina e nicotinamida (NAD + )

60 Componentes de cofactores enzimáticos (cont.) Forma activa da vitamina B 12 Riboflavina Forma activa da vitamina B 2 Dinucleótido de adenina e flavina (FAD) 5 -desoxicobalamina

61 Mensageiros químicos As células respondem ao que as rodeia recebendo sinais transmitidos por hormonas ou por outros mensageiros químicos extracelulares. A interacção destes sinais com receptores na superfície da célula produz em geral segundos mensageiros, que medeiam uma resposta adaptativa no interior da célula. Receptor fora Hormona Adenilato ciclase dentro camp

62 Mensageiros químicos (cont.) Um dos segundos mensageiros mais comuns é o 3,5 -monofosfato cíclico de adenosina (camp) 3,5 -monofosfato cíclico de adenosina (camp) Regulador em todas as células excepto nas vegetais 3,5 -monofosfato cíclico de guanosina (cgmp) 3 -difosfato,5 -difosfato de guanosina (ppgpp) Produzido em bactérias em resposta a uma diminuição da síntese proteica (inibe síntese de trna e rrna)

63 Propriedades físico-químicas dos ácidos nucleicos

64 DNA de dupla cadeia Annealing Desnaturação e renaturação do DNA DNA parcialmente desnaturado Separação das cadeias Associação das cadeias por emparelhamento das bases Cadeias de DNA separadas, enroladas ao acaso

65 Espectro de absorção nos UV de DNA de E. coli nativo e desnaturado

66 Desnaturação do DNA pelo calor

67 Relação entre T m e o conteúdo em G+C de DNAs

68 DNA parcialmente desnaturado

69 Consequências da desnaturação do DNA: Diminuição da viscosidade Aumento da absorvência das radiações Aumento do coeficiente de sedimentação

70 Ácidos nucleicos de diferentes espécies podem formar hibridos Hibridação de DNA Análise genética: estudos de homologia entre amostras de DNA Construção de sondas moleculares para identificação de regiões específicas do genoma

71 Teste do DNA

72 Os ácidos nucleicos sofrem transformações não enzimáticas Mutações Alterações na estrutura do DNA que produzem alterações permanentes na informação genética. Espontâneas - desaminações dão origem a emparelhamentos incorrectos. Induzidas por radiação UV, raios X e raios ɣ Danos oxidativos

73 Formação de dímeros de pirimidina induzidos pelos UV Timinas adjacentes Radiação UV Radiação UV Dímero de timina 6-4 fotoproduto

74 A formação de dímeros introduz uma dobra ou kink no DNA A radiação ionizante (raios X e γ) pode causar abertura dos anéis e fragmentação das bases e quebras no esqueleto covalente dos ácidos nucleicos

75 Alguns agentes químicos que causam danos no DNA: precursores do ácido nitroso e agentes alquilantes Metionina Dimetilnitrosamina Dimetilsulfato S-Adenosilmetionina Adenosina Mostarda de azoto Agentes alquilantes