Classificação e Identificação de microrganismos

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1 Classificação e Identificação de microrganismos

2 Ex. colónia isolada (amostra clínica, ambiental, alimentar, etc) Morfologia Bioquímica Fisiologia (ex. ácidos nucleicos, proteínas) Biologia molecular Compilação de propriedades Ecologia Caracterização do isolado (+) Comparação com propriedades conhecidas de microrganismos (disponiveis em bases de dados, manuais, etc) (-) Identificação Classificação Descrição de microrganismo novo* TAXONOMIA Nomenclatura *Espécie nova? - Descrição detalhada; em publicação científica internacional Estirpe tipo depositada em colecções de culturas nacionais e/ou internacionais

3 Taxonomia É a ciência que distribiu os organismos por categorias taxonómicas ou taxa que traduzem o seu grau de semelhança Divide-se em: classificação define a forma de distribuição dos organismos em grupos taxonómicos (taxa; singular taxon) (com base em semelhança mútua ou relação evolutiva). nomenclatura atribui nomes aos grupos taxonómicos de acordo com regras pré-estabelecidas. identificação é o processo de determinar a que grupo taxonómico pertence um determinado isolado.

4 Importância da taxonomia Permite organizar grandes quantidades de informação Permite fazer uma previsão das características de um determinado isolado A criação de grupos com nomes precisos facilita a comunicação científica É essencial para a identificação correcta dos organismos

5 ESPÉCIE - unidade básica da taxonomia microbiana. conjunto de estirpes que partilham muitas características estáveis e diferem significativamente de outros grupos de estirpes (é subjectivo); conjunto de estirpes com composição G+C (genoma) idêntica, e em que a sequência de nucleotídeos do DNA apresenta 70% de semelhança. GÉNERO grupo bem definido de uma ou mais espécies, claramente separado de outros géneros. Sistema binominal para a designação da espécie Shigella flexneri S. flexneri espécie Género - Shigella aceae - família ales - ordem

6 Numero de grupos taxonómicos Conhecidos (domínio Bacteria) Hierarquia taxonómica (exemplo) Filos - 25 Classes - 34 Ordens - 78 Familias Géneros Espécies (in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.) 3 divisões maiores: domínios Bacteria, Archaea e Eukarya Os microbiologistas usam muitas vezes nomes informais - Por exemplo: bactérias purpúra, bactérias metanotróficas (que oxidam metano), etc

7 ESTIRPE população de organismos que se distingue de outras dentro de uma espécie descende de um único organismo ou cultura pura (isolado) Estirpes de uma espécie podem variar ligeiramente de várias formas biovar apresentam diferenças bioquímicas e fisiológicas morfovar diferem morfologicamente serovar diferem nas propriedades antigénicas ESTIRPE TIPO - primeira estirpe a ser estudada de uma espécie - É geralmente a mais bem caracterizada - Não é necessariamente o membro mais representativo da espécie

8 Características Usadas em Taxonomia, na classificação e identificação de microrganismos dois tipos: clássicas morfológicas fisiológicas e metabólicas ecológicas análise genética Características fenotípicas moleculares Ácidos nucleicos Proteínas Lípidos

9 Características Clássicas

10 Características ecológicas Ciclo de vida Relações simbióticas Capacidade de causar doenças em hospedeiros Habitat preferencial Factores que influenciam o crescimento Análise Genética Capacidade de troca de informação genética por transformação ou conjugação estes processos estão geralmente confinados ao género Existência de plasmídeos (embora a informação neles contida possa induzir em erro)

11 Exemplo - Identificação de um isolado de bactéria entérica com base em métodos de classificação clássica. O esquema aqui representado usa métodos microbiológicos clássicos e requere que uma população da bactéria a identificar seja crescida em cultura pura. TP. 6

12 Classificação fenética Agrupa os organismos com base em semelhanças fenotípicas mútuas; As características fenotípicas testadas têm todas o mesmo peso; É necessário comparar um grande número de propriedades (várias dezenas ou centenas de tipos diferentes: morfológicas; bioquímicas; fisiológicas) de diferentes microrganismos.

13 Exemplo de utilização de taxonomia numérica em Bacteriologia. O dendrograma ao lado mostra a distribuição de 105 estirpes de bactérias Gram-negativas e fermentativas da familia Enterobacteriaceae. Foram comparadas 238 característica de cada estirpe. (in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

14 Taxonomia Numérica Usada para estabelecer um sistema de classificação (comparação de grande nº de características de diferentes microrganismos; frequentemente > 50 características) Passos principais: Todas as propriedades testadas têm o mesmo peso: 1 = Presente; 0 = Ausente Determinação dos coeficientes de semelhança Usa computadores para comparar organismos Construição de matrizes de similaridade Construção de dendogramas que relacionam os microrganismos entre si

15 Coeficiente de semelhança Coeficiente simple matching Com base em todas as características, quer estejam presentes ou ausentes Coeficiente de Jaccard Ignora as características ausentes nos dois organismos. Coeficientes variam entre 0 (sem semelhança) e 1 (100% semelhança) (in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

16 dendrograma diagrama em árvore um grupo de organismos com um grau de semelhança superior a 80% = espécie bacteriana matriz de similaridade (a) Clustering (b) Dendrograma (c) (in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

17 Kits comerciais para identificação de microrganismos (Ex. diagnóstico de patogénicos em amostras clínicas ou em alimentos; em amostras ambientais (ex. análise de água)) - Baseados principalmente em características fisiológicas e bioquímicas - Sistemas automatizados - Perfis de características observadas são comparadas com perfis disponíveis em bases de dados - Requer cultivo dos microrganismos em cultura pura - API e mini-api - Vitek

18 BIOLOG ability of the cell to metabolize all major classes of biochemicals; physiological properties such as ph, salt, and lactic acid tolerance, reducing power, and chemical sensitivity; > 1900 species couverage (bacteria, yeast, filamentous fungi)

19 Identificação de espécies bacterianas com base na composição das células em ácidos gordos: FAME FAME Fatty Acid Methyl Ester Mais de 200 ácidos gordos diferentes foram descobertos em procariotas do domínio Bacteria.

20 CLASSIFICAÇÃO MOLECULAR - Análise molecular de componentes celulares específicos Comparação de proteínas Comparação da composição dos ácidos nucleicos - Ex. conteúdo G + C do DNA (determina-se com base no valor da temperatura de fusão, T m ) Hibridação de ácidos nucleicos Comparação de sequências de bases de ácidos nucleicos - Ex. do RNA ribossómico - rrna (Filogenia ou classificação filogenética)

21 Comparação de proteínas comparação da mobilidade electroforética comparação de propriedades enzimáticas determinação da sequência de aminoácidos, alinhamento de sequências (ferramentas de Bioinformática)

22 Composição de bases dos ácidos nucleicos Conteúdo G + C Mol% G + C = (G + C)/(G + C + A + T) Variação dentro de um género é geralmente < 20% - % G+C só tem valor taxonómico quando aliado a outras características fenotípicas e/ou moleculares DNA cadeia simples DNA cadeia dupla

23 (in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

24 HIBRIDAÇÃO DNA:DNA como ferramenta taxonómica Mede o grau de similaridade (ou, homologia) no DNA de dois organismos espera-se que duas moléculas de DNA desnaturadas (em cadeia simples) hibridizem uma com a outra (i.e. emparelhem, estabelecendo pontes de H entre bases homólogas) proporcionalmente à complementaridade das sequências de bases nos seus genes (i.e. à similaridade dos seus genes). É um método sensível para revelar diferenças subtis nos genes de dois organismos; é útil para distinguir organismos ao nível da espécie. EXEMPLO (figuras seguintes): 1. DNA de um dos microrganismos é marcado com isótopo de fósforo radioactivo. 2. DNA dos 2 microrganismos é desnaturado e depois misturado. (Geralmente, o DNA de um dos microrganismos está fixado a uma membrana de Nylon ou nitrocelulose); 3. No final, é removido o DNA não ligado e medida a quantidade de radioactividade sobre a membrana.

25 HIBRIDAÇÃO DNA:DNA como ferramenta taxonómica (T > T m ) In general, the DNA of organism 2 (non-radioactive) is attached to a membrane (made of Nylon or nitrocelulose)

26 (T < T m ) 1x1 positive control

27 > 70% DNA similarity + Probably, same species < 5% diference in T m (% G+C)

28 (in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

29 EVOLUTION and SPECIATION - Mutations - Horizontal gene transfer (conjugation, transformation, transduction) - Adaptation / new ecotype Ecotype population of cells that compete for the same resource New species population of cells genetically different from the cells of the original ecotype.

30 FILOGENIA ou CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA Traduz a história evolutiva de um grupo de organismos. A hierarquia taxonómica revela relações evolutivas ou filogenéticas É a área da taxonomia que estuda as relações evolutivas entre os organismos vivos (é a base da classificação moderna) Evolução alterações numa linhagem de descendência ao longo do tempo conduzindo a novas variedades e espécies. FILOGENIA grego: phylon tribo, raça; genesis - origem As relações evolutivas são mostradas em árvores filogenéticas

31 Árvores filogenéticas Nó = unidade Ramos: O comprimento representa a distância evolutiva ou o grau de relacionamento evolutivo entre os organismos A B C D A B C taxonómica (e.g., espécie ou um gene) Nós internos: Representam organismos ancestrais E Nó externo: Representam organismos conhecidos, actuais Combinação de métodos de Biologia Molecular e Análise Computacional, com base em Algoritmos Matemáticos Bioinformática D E Árvore com raíztem um nó que corresponde ao ancestral comum

32 A Árvore filogenética universal (Carl Woese, 1977) (Bacteria that gave rise to mitochondria) (Bacteria that gave rise to chloroplasts) Universal ancestor(s)

33 CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA Baseia-se na comparação directa das sequências de material genético (genes) ou dos seus produtos (proteínas) RIBOSSOMAS Moléculas de RNA ribossomal (rrna) são excelentes ferramentas para determinar relações evolutivas entre organismos CRONÓMETROS EVOLUTIVOS PORQUE: - São universais (estão presentes em todos os organismos vivos e com a mesma função); - A sua função não se alterou ao longo do processo evolutivo; - Contém várias regiões em que a sequência de nucleotídeos é conservada em todos os tipos de células; -- Sequências assinatura / grupos taxonómicos específicos

34 rrna 16S (procariotas) rrna18s (eucariotas) Ribossomas (procariotas) rrna 16S rrna 16S rrna 18S (domínio Bacteria) (domínio Archaea) (domínio Eukarya) SSU Small Subunit A sequência de bases nestas moléculas de rrna é muito conservada ao longo do processo evolutivo

35 OBTENÇÃO DE ÁRVORES FILOGENÉTICAS COM BASE BNA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO rrna - RNA RIBOSSOMAL (a) extracção do DNA de células de cada um dos microrganismos que se pretende comparar (neste exemplo, são 3 bactérias, designadas por 1, 2 e 3); (b) Obtenção de muitas cópias do gene que codifica o 16S rrna em cada um dos microrganismos (técnica de PCR)

36 PCR Polymerase chain reaction - reacção em cadeia pela polimerase (Kary Mullis 1993) - Primers - DNA polymerase de bactérias termófilas ou hipertermófilos. Permite obter muitas cópias iguais de um gene específico.

37 Base de dados Ribossomal Database Project Onde está depositada uma colecção de mais de sequências de 16S rrnas de Archaea e Bacteria dados de Maio 2009). Comparação: 1 vs. 2 3 diferenças; 1 vs. 3 2 diferenças; 2 vs. 3 4 diferenças Algoritmo comparações e cálculo de distâncias evolutivas

38 Michigam State University - Filogenia molecular / biologia evolutiva - Identificação de bactérias - Caracterização de populações bacterianas - Compreensão da biodiversidade e da ecologia bacteriana

39 Sequências assinatura no rrna sequências curtas de nucelotídeos que ocorrem na maior parte ou em todos os membros de um grupo filogenético únicas podem servir de diagnóstico de um organismo particular ou de um grupo de organismos particulares; Por exemplo, são conhecidas: + conservadas - Sequências assinatura específicas para cada um dos três domínios (i.e., são conservadas no rrna de todas as espécies de cada um dos domínios); - Sequências assinatura que definem um grupo de organismos dentro de 1 domínio (são conservadas entre todos os géneros e espécies desse grupo); + variáveis - Sequências assinatura que estão presentes nos organismos pertencentes a um certo género ou a uma certa espécie (p.ex., são mais variáveis, isto é, diferem entre os organismos de grupo mais amplo )

40 O conhecimento sobre sequências assinatura específicas pode ser usado para gerar sondas filogenéticas úteis no dignóstico de microrganismos ou na análise de comunidades microbianas (Ex. técnica FISH Fluorescent in situ hybridization ).

41 SEQUÊNCIAS ASSINATURA SÃO A BASE PARA A IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS ATRAVÉS DE: - COMPARAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS EM REGIÕES DO rrna QUE SEJAM ESPECÍFICAS PARA MICRORGANISMOS PARTICULARES (p.ex. comparação com sequências de rrna depositadas em bases de dados p.ex. Ribossomal Database Project) - RECURSO A SONDAS FILOGENÉTICAS (Ex. técnica FISH) SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO Fragmento de ácido nucleico, em cadeia simples, que pode ser marcado ( labelled ), com Fósforo radioactivo ou com molécula fluorescente, e usado para hibridar (emparelhar) com sequência complementar de ácido nucleico numa mistura (p.ex. moléculas de ácidos nucleicos de uma população mista de microrganismos em amostra de alimento, ambiental ou clínica). Permite deste modo identificar de forma específica a presença de um microrganismo específico que contenha essa sequência-diagnóstico.

42 Fluorescent in situ Hybridization (FISH) na detecção e identificação de microrganismos específicos (NÃO requere que os microrganismos sejam cultivados em cultura pura) + Sonda filogenética marcada com fluorocromo 16S rrna procariotas 18S rrna - eucariotas Células (amostra com população mista) Ribossomas Microscópio de fluorescência Observação da fluorescência emitida pelas células (emparelhamento entre sonda e rrna)

43 Exemplo uso de sondas filogenéticas para detectar a presença de bactérias específicas em grânulo de lama activada tratamento biológico de efluentes

44 Classificação de Procariotas Bergey s Manual of Systematic Bacteriology Manual que contém descrições de todas as espécies bacterianas identificadas. 1ª Edição (1º volume em 1984) - Classificação fenética 2ª Edição (desde 2001) - usa classificação filogenética

45 Domínio Bacteria Metabólica e morfologicamente diversos Divididos em 23 filos ( phyla )

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47 Domínio Archaea halobactérias 2 phyla 8 classes 12 ordens metanogénicos termofílicos

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