ESTUDO COMPARATIVO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ESGOTOS BRUTOS E TRATADOS

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1 ESTUDO COMPARATIVO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ESGOTOS BRUTOS E TRATADOS Patrícia Procópio Pontes* Engenheira Química, Mestre em Saneamento e Meio Ambiente, Doutoranda em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos pela UFMG, Professora do Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais, Coordenação de Química Carlos Augusto de Lemos Chernicharo Professor adjunto do Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais Marco Túlio Rocha Porto Mestrando do Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais Endereço (*): Av. do Contorno, 842/71 Belo Horizonte MG Brasil - CEP Tel: (55-31) Fax : (55-31) calemos@ desa.ufmg.br RESUMO O presente trabalho objetivou o estudo comparativo de metodologias para a determinação de proteínas em esgotos sanitários. Foram analisadas amostras de esgoto bruto e de efluentes tratados, pelos métodos do Micro-biureto, de Lowry e de Bradford. Realizou-se, ainda, uma comparação entre esses métodos e o método Kjeldahl. A análise dos resultados obtidos indica a obtenção de teores de proteínas mais elevados através do método do Micro-biureto em relação aos outros métodos. Os resultados do método de Lowry foram os mais próximos do método Kjeldahl, enquanto o método de Bradford pareceu apresentar uma tendência em subestimar o teor de proteínas nas amostras. Através do cálculo da DQO equivalente da amostra, a partir da sua concentração em termos de lipídios, carboidratos e proteínas, pôde-se observar que o método de Lowry e o método Kjeldahl propiciaram uma melhor estimativa da DQO filtrada das amostras. O método do Micro-biureto apresentou valores muito elevados para a estimativa da DQO filtrada. Palavras-chave: Determinação de proteínas, método de Bradford, método de Lowry, método do Micro-biureto, método Kjeldahl. INTRODUÇÃO A determinação de material orgânico em águas residuárias é realizada através de métodos indiretos, pelas análises de Demanda química de oxigênio (DQO) e Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO). Quando se deseja um maior conhecimento sobre o tipo de composto orgânico presente, outros métodos de análise tornam-se necessários. O método mais utilizado para análise de proteínas em águas residuárias é o Método Kjeldahl. Inúmeros métodos são citados na literatura especializada para a análise de proteínas, sendo mais comuns os métodos do Micro-biureto, de Lowry e de Bradford. Esses métodos apresentam como vantagens a rapidez e economia na realização das análises, entretanto, deve-se ter cuidado em relação à presença de compostos que causem interferências nos resultados. O método de Lowry, ou método do folin-fenol, é o método mais utilizado pelos pesquisadores, devido à sua simplicidade, precisão e sensibilidade. Entretanto, pode apresentar resultados diferentes para diferentes proteínas. O método de Bradford tem apresentado um aumento de popularidade nos últimos anos, como resultado de sua simplicidade e falta de interferência de reagentes laboratoriais, que geralmente afetam os outros métodos, entretanto pode, também, apresentar diferentes resultados em função do tipo de proteína presente. Quando se utiliza uma mistura com diferentes proteínas, os erros produzidos como conseqüência desse problema são reduzidos. O método do Micro-biureto tem como vantagem, em relação a esses métodos, o fato de seu resultado ser independente do tipo de proteína presente, entretanto tem uma menor sensibilidade em relação aos outros métodos colorimétricos e a turbidez da amostra pode causar grande interferência no resultado.

2 A escolha do método para análise de proteínas e o padrão utilizado pode, em casos extremos, provocar inconsistência entre os resultados. Recomenda-se o uso do método de Lowry como método de escolha para usos gerais para se obter uma maior consistência entre os laboratórios. Raunjaer et al. (1994) sugere o uso do método de Lowry para a análise de proteínas em águas residuárias. De acordo com os pesquisadores, embora o método de Lowry possa fornecer valores mais elevados de proteínas quando compostos interferentes estiverem presentes, a presença desse tipo de compostos interferentes não foi observada em águas residuárias. Os pesquisadores não avaliaram o uso do método em efluentes tratados. O presente trabalho objetivou o estudo comparativo entre os métodos do Micro-biureto, de Lowry e de Bradford para a análise de proteínas em esgotos sanitários. Realizou-se, ainda, uma comparação desses métodos com o método Kjeldahl e um cálculo da DQO equivalente da amostra, a partir da sua concentração em termos de lipídios, carboidratos e proteínas, para comparação com a DQO filtrada obtida para a amostra. MATERIAL E MÉTODOS Descrição do aparato experimental Para avaliação do uso dos métodos de análise de proteínas em esgotos sanitários e efluentes tratados, foi realizado o monitoramento de um sistema de tratamento de esgotos sanitários que consistiu de um reator UASB, em escala piloto, seguido de um filtro biológico percolador (FBP), utilizado para o pós-tratamento do efluente anaeróbio. O sistema reator UASB/FBP foi alimentado com esgoto sanitário retirado diretamente do interceptor da margem direita do ribeirão Arrudas, na cidade de Belo Horizonte - Brasil. Os esgotos passavam, inicialmente, por unidades de tratamento preliminar (cesto perfurado e caixa de areia) e por um tanque de acumulação/distribuição, localizados a montante do reator UASB. Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Instalações Piloto LIP do Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais. Monitoramento do sistema Durante o monitoramento das unidades piloto, foram realizadas análises do esgoto bruto, do efluente do reator UASB e do efluente final do decantador secundário do FBP. Os parâmetros analisados foram: DBO (total e filtrada), DQO (total e filtrada), Sólidos Suspensos Totais, alcalinidade, ácidos graxos voláteis, ph, e temperatura. Foram realizadas amostragens compostas, sendo as análises desenvolvidas segundo o Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (AWWA/APHA/WEF, 1998). Complementarmente, e para efeito de comparação, foram realizadas análises de proteínas, pelos métodos de Lowry (Lowry, et al., 1951), de Bradford (Bradford, 1976) e do Micro-biureto modificado (Itzhaki & Gil, 1964). Uma breve descrição desses métodos é apresentada a seguir. Método do Micro-biureto modificado O método consiste na adição de hidróxido de sódio e sulfato de cobre à solução que contém proteínas. O excesso de sulfato de cobre é removido por centrifugação. Mede-se a absorbância do sobrenadante, que apresenta cor violeta, em um espectrofotômetro a 31 nm. A intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de proteínas presente na amostra. Determina-se a concentração de proteínas através de uma curva padrão previamente construída, por exemplo, para a caseína. A determinação de proteínas é realizada em triplicata, sendo considerada para cálculo da concentração a absorbância média (Blundi & Gadelha, 1). Método de Lowry O método de Lowry se baseia na reação do cobre com a proteína, em meio alcalino, e posteriormente redução do reagente de fosfomolibdato-fosfotungstenato no reagente folin. Quando o reagente folin é adicionado à proteína tratada com o cobre, ocorre a redução do reagente folin que resulta em uma cor mais intensa, com absorção máxima em 55 nm. A concentração de proteínas é determinada através de uma curva padrão previamente construída para a soroalbumina bovina e a análise é realizada em triplicata. 2

3 Método de Bradford O método de Bradford se baseia na ligação do reagente Coomassie Blue com as proteínas. Utiliza-se soroalbumina bovina como padrão e realiza-se o teste em triplicata. A leitura da absorbância é realizada em espectrofotômetro a 595 nm. Determinação da DQO equivalente Para a determinação da DQO correspondente a carboidratos, proteínas e lipídios (DQO equivalente. ), foram realizadas, também, análises de lipídios (Postma & Stroes, 1968) e carboidratos (Dubois et al., 1956). A partir dos resultados destes constituintes específicos, foram utilizados os seguintes fatores de equivalência para se estimar a concentração de DQO filtrada equivalente: carboidratos = 1,1; proteínas = 1,5; e lipídeos = 2,9, conforme Miron et al. (). RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização das amostras Os resultados médios obtidos para a caracterização das amostras, em termos de DQO, DBO e SST, são apresentados na TABELA 1. TABELA 1: Valores médios obtidos para DBO, DQO e SST das amostras analisadas (N=21) Parâmetro Esgoto Bruto Efluente do reator anaeróbio Efluente do Filtro Biológico DBO (mg.l -1 ) 381 ± 5 68 ± ± 6 DQO (mg.l -1 ) 536 ± ± ± 19 SST (mg.l -1 ) 233 ± 7 33 ± ± 12 Comparação entre os métodos Kjeldahl, Lowry, Micro-biureto e Bradford Inicialmente, foram realizados experimentos com os métodos de Bradford, de Lowry e do Micro-biureto, para a determinação de proteínas em esgoto bruto e no efluente do reator anaeróbio. Os resultados obtidos são apresentados na TABELA 2 e nas Figuras 1 e 2. TABELA 2: Resumo dos resultados médios obtidos para a análise pelos métodos de Lowry, Bradford e Micro biureto (N=9) Método de análise Esgoto Bruto Efluente do reator anaeróbio Lowry (mg.l -1 ) 14 ± 3,9 51 ± 12 Bradford (mg.l -1 ) 24 ± 2,8 12 ± 3 Micro biureto (mg.l -1 ) 213 ± 8 18 ± 2 3

4 Biureto Lowry Bradford Figura 1: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Bradford para a análise de esgoto bruto Biureto Lowry Bradford Figura 2: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Bradford para a análise de efluente anaeróbio Observaram-se resultados muito diferentes, obtidos a partir de cada método de análise utilizado. O método de Bradford foi o que apresentou valores mais baixos e uma pior estimativa do teor de proteínas. Por esta razão, os experimentos passaram a ser realizados com os métodos de Lowry, do Micro-biureto e Kjeldahl. Os resultados médios obtidos através dos métodos de Lowry, Kjeldahl e Micro-biureto, para as amostras estudadas, são apresentados na TABELA 3 e os resultados da DQO equivalente na TABELA 4. TABELA 3: Resumo dos resultados médios obtidos para a análise pelos métodos de Lowry, Kjeldahl e Micro-biureto (N=12) Método de análise Esgoto Bruto Efluente do reator anaeróbio Efluente do Filtro Biológico Lowry (mg.l -1 ) 12 ± 9 69 ± ± 1,7 Kjeldahl (mg.l -1 ) 93 ± ± 3 69 ± 4 Micro-biureto (mg.l -1 ) 222 ± ± ± 35 TABELA 4: Resumo dos resultados médios obtidos para a DQO equivalente calculada pelos métodos de Lowry, Kjeldahl e Micro-biureto (N=12) Método de análise Esgoto Bruto Efluente do reator anaeróbio Efluente do Filtro Biológico DQO Filtrada (mg.l -1 ) 256 ± 4 15 ± ± 21 DQOeqL (1) (mg.l -1 ) 232 ± ± ± 2 DQOeqB (2) (mg.l -1 ) 411± ± ± 84 DQOeqK (3) (mg.l -1 ) 189 ± ± ± 9 (1) DQOeqL: DQO equivalente calculada a partir da análise de proteínas pelo método de Lowry (2) DQOeqB: DQO equivalente calculada a partir da análise de proteínas pelo método do Micro-biureto (3) DQOeqK: DQO equivalente calculada a partir da análise de proteínas pelo método Kjeldahl A partir dos resultados obtidos, realizou-se uma análise comparativa entre os métodos, para cada tipo de amostra. Para a amostra de esgoto bruto (EB), a comparação entre os métodos de análise é apresentada na Figura 3, enquanto a comparação entre a DQO filtrada do esgoto bruto (DQOF EB) e a DQO equivalente determinada a partir dos métodos de Lowry (DQOeqL), do Micro-biureto (DQOeqB) e Kjeldahl (DQOeqK) é apresentada na Figura 4. 4

5 Conc(mg/L) Biureto Lowry Kjeldahl DQOF EB DQOeqB DQOeqL DQOeqK Figura 3: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a análise de esgoto bruto Figura 4: Comparação entre os valores de DQO e DQO equivalente. para a análise de proteínas pelos métodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl, em esgoto bruto O método com resultados mais próximos do método Kjeldahl foi o método de Lowry (Figura 3). A DQO equivalente calculada para o esgoto bruto pelo método de Lowry foi um pouco inferior ao valor de DQO filtrada obtida pelas análises, enquanto que o valor obtido pelo método do Micro-biureto foi acima do valor de DQO obtido na prática. O método do Micro-biureto pareceu apresentar uma tendência em superestimar o teor de proteínas nas amostras. A comparação entre os métodos de Lowry, do Micro-biureto e Kjeldahl, para os efluentes anaeróbio e aeróbio, é apresentada nas Figuras 5 e 7, sendo a comparação do cálculo da DQO equivalente., para esses efluentes, com o valor da DQO filtrada (DQOefl. UASB e DQO FB) apresentada nas Figuras 6 e Biureto Lowry Kjeldahl Figura 5: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a análise de efluente anaeróbio DQOefl.UASB DQOeqB DQOeqL DQOeqK Figura 6: Comparação entre os valores de DQO e DQO equivalente. para a análise de proteínas pelos métodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl, em efluente anaeróbio 5

6 Conc(mg/L) 15 Conc(mg/L) 3 5 Biureto Lowry Kjeldahl Figura 7: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a análise de efluente de filtro biológico percolador DQOFB DQOeqB DQOeqL DQOeqK Figura 8: Comparação entre os valores de DQO e DQO equivalente. para a análise de proteínas pelos métodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl, em efluente de filtro biológico percolador Pela análise das Figuras 4, 6 e 8, pode-se observar que, para as amostras analisadas, os métodos Kjeldahl e de Lowry são os métodos que permitem uma melhor estimativa do valor da DQO filtrada. Os resultados obtidos pelo método de Lowry foram melhores para o esgoto bruto e para o efluente do filtro biológico percolador, obtendo-se teores de proteínas mais próximos do método Kjeldahl e uma melhor estimativa da DQO equivalente. No efluente do reator anaeróbio, o método superestimou um pouco tanto a DQO quanto o teor de proteínas. A comparação dos métodos de Lowry, Kjeldahl e Bradford e o cálculo da DQO equivalente indicou que o método de Lowry foi o mais adequado para as amostras analisadas. Os resultados obtidos mostraram que o método de Bradford apresentou uma tendência em subestimar o teor de proteínas nas amostras, enquanto que o método do Micro-biureto apresentou um tendência em superestimar esses valores. Na presente pesquisa, o método de Lowry foi o que apresentou resultados mais próximos do esperado. Esses resultados são semelhantes aos de Sapan et al. (1999), que apresentaram métodos para a análise de proteínas em diferentes tipos de amostras. Em seu estudo, Sapan et al. (1999) apresentaram a comparação do teor de proteínas obtidos pelos métodos de Lowry, do Biureto e de Bradford com o teor de proteínas obtido por análise quantitativa de aminoácidos que foi considerado o método padrão, e também observaram a tendência do método do Biureto em superestimar o teor de proteínas enquanto o método de Bradford subestimava esse valor. Os resultados obtidos indicaram, ainda, que as proteínas, em relação aos demais compostos orgânicos específicos, foram os principais compostos responsáveis pela DQO do esgoto bruto e dos efluentes tratados. Em esgotos brutos, a DQO equivalente das proteínas correspondeu, em média, a aproximadamente 65% da DQO equivalente total das amostras analisadas, enquanto para os efluentes do reator anaeróbio e do filtro biológico a DQO equivalente média correspondeu a 82 e 81% da DQO equivalente total, respectivamente. Todos os métodos de análise indicaram essa mesma tendência. Observou-se, portanto, um aumento na proporção de proteínas nas amostras de efluentes tratados em relação ao esgoto bruto, que pode ser explicado pelas menores eficiências de remoção de proteínas no sistema de tratamento estudado, em relação a lipídios e carboidratos. 6

7 CONCLUSÕES Dentre os métodos testados, o método de Lowry parece ser o mais indicado para a determinação de proteínas em esgotos sanitários e em efluentes tratados, pois seus resultados foram os mais próximos do Método Kjeldahl, que é considerado o método padrão para essa análise. Observou-se, entretanto, uma tendência do método em superestimar o teor de proteínas e a DQO equivalente. no efluente do reator anaeróbio. O método do Micro-biureto apresentou uma tendência em superestimar o teor de proteínas e a DQO das amostras estudadas, enquanto o Método de Bradford apresentou uma tendência em subestimar esses valores. Para o esgoto bruto e para os efluentes tratados, a estimativa da DQO pelos métodos Kjeldahl e de Lowry permitiu obter resultados bem próximos daqueles obtidos na prática. Agradecimentos: Os autores agradecem ao CNPq, pelas bolsas concedidas, e à FAPEMIG e à FINEP, através do PROSAB, pelo financiamento da pesquisa. Agradecem, ainda, à bolsista de apoio técnico Lucilaine Santos, pelo auxílio nas análises de matéria orgânica específica. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AWWA/APHA/WEF (1998) Standard methods for the examination of water and wastewater. 2 th edition. Washington. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry, 72, Dubois, M., Gilles, K.A, Hamilton, J. K, Rebers, P.A, Smith, F. (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry, 28, Blundi, C E, Gadelha, R. F. (1) Metodologia para determinação de matéria orgânica específica em águas residuárias. In: Chernicharo, CAL. Pós-tratamento de efluentes de reatores anaeróbios: aspectos metodológicos, PROSAB, Belo Horizonte. Itzhaki, R., F.; Gill, D., M. (1964) A micro-buret method for estimating proteins. Anal. Bioqem.Chem., 9, Lowry, O H., Rosebrough, N.J., Farr, A L., Randall, R. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem, 193, Miron, Y., Zeeman, G., Van Lier, J. B., Lettinga, G. () The role of sludge retention time in the hydrolysis and acidification of lipids, carbohydrates and proteins during digestion of primary sludge in CSTR systems, Water Research, 34, Peterson, G.L. (1981) Determination of total protein. Methods in Enzymology, 95, Porto, M. T. R., Pontes, P. P., Chernicharo, C. A L., Bejar, D. O. (1) Avaliação do sistema reator UASB e Filtro Biológico Percolador operando sob diferentes condições hidráulicas. PROSAB, Edital 3, Tema 4, Relatório Final. Postma, T.; Stroes, J.A.P. (1968) Lipid screening in clinical. Clin. Chim. Acta, 22, Raunjaer, K., Jacobsen, T.H., Nielsen, P.H. (1994) Measurement of pools of protein, carbohydrate and lipid in domestic wastewater. Water Research, 28, 2, Sapan, C.V., Lundblad, R.L., Price, N.C. (1999) Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem., 29,