Diagnose e manejo de viroses em Cucurbitácea

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1 Diagnose e manejo de viroses em Cucurbitácea Mirtes Freitas Lima Embrapa Hortaliças. BR 060, Km 09, C.P. 218 Brasília DF; 2 Universidade de Brasília Campus Universitário Darcy Ribeiro, Brasília - DF, mirtes.lima@embrapa.br; Introdução As doenças de origem viral constituem um dos principais desafios à produção de cucurbitáceas em todo o mundo, ocorrendo frequentemente em áreas produtoras cultivadas com essas espécies de plantas. São doenças complexas para as quais não há medidas de controle curativo e as estratégias de manejo disponíveis baseiam-se no emprego de medidas preventivas. Em nível mundial, mais de trinta espécies de vírus já foram registradas infectando naturalmente as cucurbitáceas. No Brasil, onde cerca de pelo menos dez vírus já foram identificados causando doenças nessas espécies de plantas, os maiores problemas têm como principais agentes os potyvírus Papaya ringspot virus type watermelon (PRSV-W; Lima et al., 1996), Watermelon mosaic virus-ii (WMV-II; Sá & Kitajima, 1991) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV; Lima et al., 1996). Entretanto, merecem destaque também o comovírus Squash mosaic virus (SqMV; Lima & Amaral, 1985), o cucumovírus Cucumber mosaic virus (CMV; Cupertino et al., 1988), o tospovírus Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV; Pozzer et al., 1996) e o carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV; Nagata et al., 2003) que também podem reduzir a produção e resultar perdas significativas. Entre as culturas mais afetadas destacam-se as consideradas economicamente mais importantes como melão, pepino e maxixe (gênero Cucumis), melancia (gênero Citrullus), abóbora, abobrinha e moranga (gênero Cucurbita) e chuchu (gênero Sechium). Plantas de cultivares suscetíveis quando infectadas podem apresentar sintomas caracterizados por mosaico, mosqueado, deformação e redução do limbo foliar, redução no crescimento da planta, além de alterações nos frutos. Diagnose. A diagnose da doença com a correta identificação do patógeno constitui o primeiro passo na definição das medidas de manejo a serem adotadas no seu controle, visando reduzir os danos resultantes da infecção ou evitar a sua ocorrência. Dessa forma, a utilização de métodos diagnósticos para detecção de vírus que sejam rápidos, acurados e pouco onerosos é altamente desejável e de importância crucial na tomada de decisão quanto às estratégias de manejo a serem empregadas. Na detecção de vírus em cucurbitáceas são utilizados testes laboratoriais (sorológicos; moleculares) e testes conduzidos sob condições controladas (biológicos), em casa de vegetação. Os métodos sorológicos e os métodos moleculares possibilitam a identificação de vírus de forma precisa, além de serem extremamente sensíveis. Entretanto, os métodos biológicos (sintomatologia;

2 transmissão) são também importantes e complementam a investigação da doença. Dessa forma, o emprego de pelo menos dois desses métodos na investigação do agente causal de uma doença é recomendado para obtenção de uma diagnose confiável. Os métodos sorológicos baseiam-se na capacidade de reconhecimento de certas proteínas por anticorpos específicos. O teste mais comum para detecção de vírus que infectam cucurbitáceas é o Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), pela sensibilidade, rapidez na obtenção dos resultados (24 h-48 h) e por ser pouco oneroso. O ELISA foi adaptado para detecção de vírus em plantas na segunda metade da década de 1970, sendo o método mais recomendado para avaliação de amostras em larga escala. O extrato da planta teste é preparado em tampão de extração e aplicado em superfície solida (placa de poliestireno; placa de microtitulação) e os resultados são obtidos pelo produto da reação enzimática do conjugado (enzima fosfatase alcalina conjugada ao anticorpo) com substrato específico. A reação é monitorada pela mudança de coloração, como resultado da digestão do substrato pela enzima. O ELISA é um teste quantitativo, com leitura obtida por meio de espectrofotometria em leitora de placas e filtro de 405 nm. Amostras consideradas positivas devem exibir valores de absorbância pelo menos 2-3 vezes maior que valores de absorbância da planta sadia. O dot-blot, dot-elisa ou NCM-ELISA também é muito utilizado na identificação de vírus em cucurbitáceas. Utiliza-se membrana de nitrocelulose como suporte para a aplicação do extrato vegetal preparado em tampão PBS-Tween. Após o bloqueio da membrana em solução contendo leite desnatado e aplicação do anticorpo específico, a membrana é imersa em conjugado universal (anticorpo secundário contra IgG de coelho produzido em cabra conjugado à enzima fosfatase alcalina). Nesse caso, a revelação da membrana é realizada com o emprego de BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) e NBT (Nitro blue tetrazolium). O NCM-ELISA é um teste qualitativo e, dessa forma, a avaliação dos resultados é visual. As amostras quando positivas apresentam coloração arroxeada como resultado da formação de precipitado pela ação da enzima fosfatase alcalina sobre os substratos BCIP e NBT (cromogênica). O Western blot é uma técnica imunoeletroforética que propicia a detecção de proteínas do vírus pela exposição da membrana em solução contendo anticorpos produzidos contra a proteína do vírus a ser detectado. Entretanto, é pouco utilizada em diagnose, sendo mais indicada para caracterização de proteínas virais. A limitação na utilização dos testes sorológicos está associada a não existência de antissoros produzidos para identificação de alguns dos vírus que infectam essas culturas, o que inviabiliza a utilização do método. Nesses casos, outras técnicas devem ser empregadas na diagnose da doença e identificação do vírus. Ambos os testes, ELISA e NCM-ELISA, tem propiciado a identificação de PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV, ZLCV e MYaV em plantas infectadas (Yuki et al., 2000; Oliveira et al., 2000; Moura et al., 2001; Halfeld-Vieira et al., 2004; Lima et al., 2009; Lima & Nagata, 2008; Ali et al., 2012). Os métodos moleculares propiciam a detecção do ácido nucleico e nesse caso, a transcrição reversa (RT) associada à reação em cadeia da polimerase (PCR) é a técnica mais empregada na identificação de vírus em cucurbitáceas. A RT-PCR possibilita a amplificação de fragmentos do material genético do vírus

3 utilizando-se um par de oligonucleotídeos que são complementares às regiões que flanqueiam a sequência a ser amplificada e as enzimas Transcriptase reversa (apenas para vírus de RNA) e Taq DNA Polimerase (vírus de RNA e vírus de DNA), esta última, tesmoestável. A reação ocorre por meio da incubação em termocilador, no qual é submetida, geralmente, a ciclos sucessivos de desnaturação, anelamento e extensão que resultam na amplificação exponencial (2 n, onde n=número de cópias) do fragmento do DNA. A alta sensibilidade é a principal vantagem da técnica que torna-se muito útil na detecção de vírus para os quais não há disponibilidade de antissoros, entretanto, nesse caso é necessário o conhecimento da sequência parcial do genoma do vírus para o desenho dos oligonucleotídeos. Os fragmentos de DNA amplificados são visualizados em gel de agarose corado com brometo de etídeo. Diversos trabalhos relatam o emprego da RT- PCR para diagnose de viroses em cucurbitáceas (Thompson et al., 1995; Giampan, 2007; Jadão et al., 2010; Ali et al., 2012). Outros métodos que também sensíveis são as hibridizações Northern blot (dtecção de RNA) e Southern blot (detecção de DNA). Nessas duas técnicas, a detecção do ácido nucleico do vírus imobilizado em membrana de nylon ocorre por meio da utilização de sondas moleculares. Os métodos biológicos consistem na observação da sintomatologia exibida pelas plantas infectadas no campo e também na transmissão do vírus para plantas herbáceas indicadoras. Os sintomas exibidos por plantas de cucurbitáceas naturalmente infectadas em campo, possuem reduzido valor diagnóstico, considerando a grande similaridade dos sintomas induzidos pela maioria das espécies virais que infectam cucurbitáceas e também, pela possibilidade de ocorrência de infecção múltipla, quando a planta é infectada por mais de um agente viral, dificultando a identificação dos sintomas de cada patógeno isoladamente. A infecção pode ser latente e nesse caso, a planta, apesar de infectada, não exibe sintomas ou ainda, ser o resultado da ação de fatores abióticos sobre a planta. Com relação à transmissão do vírus, essa pode ser mecânica, pela fricção do extrato da planta infectada em folhas de plantas sadias, previamente pulverizadas com agentes abrasivos (carborundo; celite), por meio de enxertia ou pela utilização de insetos vetores. A avaliação é feita pela observação de sintomas e realização de testes de detecção para confirmação da presença ou ausência do vírus nas plantas inoculadas. A observação de partículas virais ao microscópio eletrônico também pode ser utilizada como método auxiliar na diagnose de doenças origem viral, pois possibilita a determinação das características morfológicas dos vírus. Controle. Não há medidas curativas para infecção causada por vírus em plantas, o que torna o seu controle bastante complexo. Entretanto, o manejo dessas doenças deve ser feito segundo um conjunto de estratégias a ser adotado de maneira preventiva, com o objetivo de minimizar a ocorrência de perdas na produção e na qualidade dos frutos. Algumas das estratégias que visam a prevenção da infecção por vírus nas lavouras incluem erradicação da fonte do vírus e do vetor, para evitar que possam atingir a cultura. Dessa forma são importantes as medidas de sanitização com a eliminação de restos de cultura logo após a colheita, assim como também, a eliminação de plantas hospedeiras alternativas que podem atuar como reservatório do vírus e do inseto vetor. Outra medida é a redução da disseminação do vírus por meio do

4 controle do vetor, entretanto, nesse caso, o controle químico pode não ser efetivo para os afídeos vetores de vírus, considerando-se que devido à rapidez com que efetuam a transmissão ( picada de prova ) do vírus, esse já pode ter sido transmitido antes que o inseticida possa ter algum efeito sobre o inseto. A utilização de material livre de vírus (mudas e/ou sementes) também é de importância crucial no estabelecimento de novos plantios, pois diminui o risco de introdução de vírus na lavoura. Como última medida, a resistência genética, que constitui a estratégia mais eficiente e econômica no controle de viroses. Dessa forma, a identificação de fontes de resistência a determinados vírus e incorporação em cultivares que possuem características agronomicamente desejáveis é a medida mais eficiente para o controle dessas doenças. Referências ALI, A; MOHAMMAD, O; KHATTAB, A Distribution of viruses infecting cucurbit crops and isolation of potential new virus-like sequences from weeds in Oklahoma. Plant Disease, 96: AVILA, AC de; INOUE-NAGATA, AK; NEVES, FM; MATOS, LG; DIAS, R de CS; RANGEL, M; NAGATA, T Produção de anti-soro e detecção por DAS-ELISA do Melon yellowing-associated virus em melão. Tropical Plant Pathology, 33: CANDRESSE, T; HAMMOND, RW; HADIDI, A Detection and identification of plant viruses and viroids using polymerase chain reaction (PCR). In: A Hadidi, RK Khetarpal, K Koganezawa (eds.) Control of plant virus diseases, APS Press, ISBN , St. Paul, MN, USA CLARK, MF; ADAMS, AN Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34: CUPERTINO, FP; KITAJIMA, EW; FONSECA, MEN; MEYER, MC Viroses em olerícolas no Estado de Goiás. Fitopatologia Brasileira, 13:101. GIAMPAN, JS Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV): detecção, avaliação de danos em abobrinha de moita e reação de espécies de cucurbitáceas Tese (Doutorado em Fitopatologia) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, Disponível em: < Acesso em: HALFELD-VIEIRA, BA; RAMOS, NF; RABELO FILHO, FAC; GONÇALVES, MFB; NECHET, KL; PEREIRA, PRVS; LIMA, JAA Identificação sorológica de espécies de potyvírus em melancia, no estado de Roraima. Fitopatologia Brasileira, 29:

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