Discussão e Conclusões
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- Débora Festas
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1 5. Discussão e Conclusões Neste capítulo são discutidos os resultados obtidos por meio do estudo da influência da resolução espacial e temporal no mapeamento óptico da atividade elétrica cardíaca. Também são apresentadas as conclusões, e as perspectivas e trabalhos futuros gerados por meio deste estudo. Este capítulo foi dividido em três partes: Influência da resolução espacial e temporal em mapeamentos ópticos da atividade cardíaca; Conclusões; e Perspectivas e Trabalhos Futuros. 5.1 Influência da Resolução Espacial e Temporal em mapeamentos ópticos da atividade cardíaca Neste trabalho, por meio de estudos experimentais e simulados, é feita a análise da influência da resolução espacial e temporal na morfologia de potenciais de ação ópticos (OAP) e na identificação de padrões da propagação da atividade elétrica cardíaca em mapas ópticos. A visualização da propagação da atividade elétrica em mapeamentos ópticos realizados em corações isolados procura identificar os padrões normais e patológicos da condução do estímulo elétrico no tecido cardíaco. No entanto, essa identificação pode ser prejudicada pela resolução espacial utilizada durante a medição do sinal de fluorescência emitido pelas células cardíacas. Em tecidos cardíacos, um padrão de excitação circular e reentrante é associado a frentes de onda interagindo com bloqueios ou obstáculos estruturais. Ambas as interações envolvem dispersão da corrente local em frente de ondas convexas, com a diminuição da velocidade de condução local, e uma mudança na ativação de correntes de despolarização localizadas [19,74-76]. Portanto, a curvatura da frente de onda é um fator importante para a determinação de diminuição da velocidade de condução, bloqueios na condução e arritmias reentrantes. Na maioria dos casos, a diminuição da velocidade ou bloqueio da
2 90 condução ocorre de forma localizada no tecido, enquanto a condução da atividade elétrica se mantém em outros locais. Essa heterogeneidade da condução é um fator importante para a iniciação de excitações circulares e a possibilidade de ocorrência de arritmias reentrantes. As análises qualitativas realizadas neste trabalho por meio da visualização de mapas da ativação elétrica do coração e da morfologia do potencial de ação (apresentados na seção 4.4.1) mostraram que a maior resolução espacial dos mapas permite uma melhor visualização da curvatura da frente de onda da propagação da atividade elétrica. Da mesma forma, baixas resoluções espaciais prejudicam a visualização da curvatura da frente de onda e a identificação e localização de bloqueios, além de distorcer os registros de potenciais de ação locais dificultando a análise do comportamento eletrofisiológico do tecido, pois altera parâmetros eletrofisiológicos. Correlações entre parâmetros eletrofisiológicos da morfologia do upstroke e a orientação da frente de onda da propagação da atividade elétrica determinam uma relação linear entre V F * e o parâmetro da frente de onda que está se propagando. Segundo Zemlin et al. [14], valores do parâmetro V F * ~ 0,4 indicam frentes de onda movendo-se paralelas a superfície do coração, valores de V F * ~ 0,2 indicam frentes de onda que se afastam da superfície do coração e valores de V F * ~ 0,6 indicam frentes de onda que se aproximam da superfície cardíaca. As análises quantitativas realizadas neste trabalho para estimar a influência da resolução espacial em parâmetros do upstroke dos potenciais de ação simulados (T S(max), V S(max) e V S *) e experimentais (T F(max), V F(max) e V F *), apresentadas na seção 4.4, mostraram que a redução da resolução espacial deforma o sinal, modificando os valores dos parâmetros morfológicos calculados. A integração espacial da atividade elétrica por meio da simulação de um grupo de 125 células (AP avg ) apresentou diferenças nos valores dos parâmetros do upstroke em relação à célula única (Tabela 1). A Tabela 5 mostra os parâmetros do upstroke (T S(max), V S(max) e V S *) dos potenciais de ação simulados para uma célula (AP cell ) e para o grupo de 125 células (AP avg ) com resolução temporal de 0,1ms.
3 91 Tabela 5: Parâmetros T S(max), V S(max) e V S * do upstroke dos potenciais de ação simulados para uma célula (AP cell ) e para o grupo de 125 células (AP avg ), com resolução temporal de 0,1ms. Resolução Espacial Parâmetros T S(max) (ms) V S(max) (mv) V S * Célula Única 2,7 (Ref.) 5,37 (Ref.) 0,72 (Ref.) Média de 125 células 3,3 22,22% -39,17 842,70% 0,25 65,40% (Ref.) = Valor de referência O valor de V S * para AP avg possui uma diferença de 65,40% em relação à AP cell. A integração espacial de 125 células modifica o valor de V S *, prejudicando a interpretação do direcionamento das frentes de onda. O parâmetro V S * para AP cell de 0,7168 é o valor de referência e indica que as frentes de onda se aproximam da superfície do coração, por outro lado, V S * para AP avg é de 0,2480, conduzindo à interpretação de que as frentes de onda se afastam da superfície do coração. Portanto, a redução da resolução espacial em potenciais de ação simulados causou alterações em valores de parâmetros morfológicos levando a resultados que possuem interpretações eletrofisiológicas opostas. O ruído contido no sinal experimental é mais uma fonte de distorção na morfologia do potencial de ação óptico. Desta forma, o estudo da distorção causada pelo ruído por meio de sinais simulados ajuda a quantificar essa distorção e analisar efeitos causados por processamentos digitais utilizados para melhorar a qualidade do sinal. A Tabela 6 apresenta sequencialmente os efeitos causados nos potenciais de ação simulados: AP cell, com resolução temporal de 0,1ms; AP avg, com resoluções temporais de 0,1ms e 2,0ms; AP avg com resolução de 2,0ms e adição de ruído; e AP avg com resolução de 2,0ms, adição de ruído e aplicação do processamento digital (filtragem por Butterworth e interpolação por Spline Fit). Os efeitos são avaliados por meio dos parâmetros T S(max), V S(max) e V S * do upstroke do potencial de ação simulado.
4 92 Tabela 6: Parâmetros T S(max), V S(max) e V S * do upstroke dos potenciais de ação simulados de AP cell com resolução temporal de 0,1ms; AP avg com resolução temporal de 0,1ms e 2,0ms; AP avg com resolução temporal de 2,0ms com adição de ruído; e AP avg com resolução temporal de 2,0ms e aplicação de processamento digital (filtragem por Butterworth e interpolação por Spline Fit). Resolução Parâmetros Eletrofisiológicos Temporal T S(max) (ms) V S(max) (mv) V S * Célula Única 0,1 ms 2,7 (Ref.) 5,27 (Ref.) 0,72 (Ref.) Média de 125 células 22,22% 0,1 ms 3,3-39,17 842,70% 0,25 65,40% 2,0 ms 4,0 2,0ms 6,0 48,15% -24,95 573,08% 0,40 44,52% Média de 125 células com adição de ruído* 122,22% 04,99 5,38% 0,61 14,94% Média de 125 células com adição de ruído e após aplicação de Butterworth e Spline Fit** 2,0ms 3,7 37,04% -19,66 472,77% 0,51 29,03% * Ruído branco gaussiano **Butterworth (or.4 Fc 88Hz) e Spline Fit aplicados no potencial de ação médio do grupo de 125 célula com ruído e com resolução temporal de 2,0ms (Ref.) = Valor de referência Os valores dos parâmetros T S(max), V S(max) e V S * do AP cell foram usados como referência para análise dos efeitos da integração espacial, da redução da resolução temporal, da adição de ruído e do processamento digital. O sinal integrado espacialmente com adição de ruído apresentou menor variação do parâmetro V S * em relação à referência (AP cell ), sendo que este fato se deve à alteração extrema que o mesmo apresentou no parâmetro T S(max) (122,22%), resultando em V S(max) mais elevado e, coincidentemente, mais próximo ao valor 5,27 mv de referência. Para o parâmetro T S(max), o processamento digital aplicado no AP avg com resolução temporal de 2,0ms e adição de ruído não só atenuou a distorção causada pelo ruído, resultou em valores dos parâmetros que não só retornam para o sinal original sem ruído (AP avg com resolução temporal de 2,0ms), mas também se aproximam dos resultados gerados com melhor resolução temporal, já que a distorção dos parâmetros V S(max) e V S * para AP cell com 2,0ms de resolução são
5 93 bem maiores do que os resultados obtidos após processamento do sinal com integração espacial (AP avg ), baixa resolução temporal (2,0 ms) e adicionado de ruído. As variações nos valores dos parâmetros T S(max), V S(max) e V S * ao reduzirse a resolução temporal (Tabela 5, Tabela 6 e Tabela 8) ou espacial (Tabela 7) são menores para os sinais com integração espacial (AP avg e OAP experimental), que apresentam maior inclinação do upstroke, do que as variações observadas para os sinais do AP cell, com maior velocidade de despolarização. Hyatt et al. [17] determinaram que em mapeamentos ópticos em tecidos cardíacos possuindo várias camadas (como é o caso de medições em corações isolados) a duração do upstroke de potenciais de ação ópticos é aproximadamente uma ordem de magnitude maior que a duração do upstroke de potenciais de ação medidos por meio de microeletrodos no mesmo local, como mostra a Figura 29.
6 94 Figura 29: Duração do upstroke de potenciais de ação, medidos por meio de mapeamento óptico (linhas sólidas) e por meio de microeletrodos (linha tracejada), como função da velocidade de condução da frente de onde plana. A variação da velocidade se deve à variação do acoplamento elétrico das células na direção de propagação. A duração do upstroke do potencial de ação óptico para uma onda plana se afastando (linha preta, circulo sólido) e perpendicular (linha cinza, quadrado sólido) à superfície do tecido, e dos potenciais de ação medido eletricamente (linha tracejada), que foram iguais para os dois casos(onda plana se afastando e perpendicular a superfície). Figura adaptada da referência 17. Como apresentado na seção 4.1.2, a integração espacial contribui para a menor inclinação do upstroke do potencial de ação óptico em relação a potenciais de ação medidos por meio de microeletrodos. O potencial de ação simulado para uma integração espacial de um grupo de 125 células apresentou uma velocidade de despolarização aproximadamente 20 vezes inferior (28 mv/ms) à do upstroke do potencial de ação para uma célula; e duração do potencial de ação 5% maior do que a do potencial de ação para uma célula. Utilizando uma aproximação linear do upstroke, o ângulo de inclinação obtido para o potencial de ação gerado pela integração espacial em relação ao ângulo de inclinação para uma célula foi reduzido em aproximadamente 4% (Figura 15 e Figura 16).
7 95 As variações nos valores dos parâmetros V F * (experimentais) foram menores que as variações encontradas nos parâmetros V S * (simulados), apresentados na seção 4.4, provavelmente devido à menor inclinação do upstroke dos potenciais de ação ópticos quando comparados aos sinais simulados. As variações observadas nos valores dos parâmetros T F(max) de OAP experimentais para os pixels e, com diferentes resoluções espaciais, são um pouco mais elevadas que as variações nos valores dos parâmetros V F * de OAP para os pixels e não apresentam uma variação sistemática com a redução da resolução espacial. Ao comparar as diferenças entre cada um dos parâmetros T F(max), V F(max) e V F * dos pixels e para as resoluções espaciais de 0,4mm, 0,8mm, 1,2mm, 1,6mm e 3,2mm obtêm-se variações que ultrapassam 300%, como mostra a Tabela 7. Tabela 7: Diferença entre Parâmetros T F(max), V F(max) e V F * calculados para os potenciais de ação ópticos entre os pixels e, processados por Butterworth e Spline Fit obtendo resolução temporal de 0,1ms para resoluções espaciais de Resolução Espacial 0,4mm, 0,8mm, 1,2mm, 1,6mm e 3,2mm. Parâmetros T F(max) (ms) V F(max) (mv) V F * Diferença entre os parâmetros dos pixels e 0,4 mm 1,0 (Ref.) -1,17 (Ref.) -0,02 (Ref.) 0,8 mm 3,3 230,00% 0,92 178,31% 0,02 176,23% 1,2 mm 2,0 100,00% 1,13 196,33% 0,02 198,77% 1,6 mm 1,6 60,00% 1,71 246,20% 0,07 378,69% 3,2 mm 0,7 30,00% -0,41 64,73% -0,06 133,20% (Ref.) = Valor de referência Os valores das diferenças entre cada um dos parâmetros T F(max), V F(max) e V F * dos OAPs dos pixels e para as resoluções espaciais de 0,4mm, 0,8mm, 1,2mm, 1,6mm e 3,2mm não apresentam comportamento sistemático ao reduzir a resolução espacial. Desta forma, parâmetros eletrofisiológicos que dependem de dois pixels do mapa óptico da atividade elétrica cardíaca, como a velocidade de condução, também têm seus valores alterados. Ao comparar as diferenças entre cada um dos parâmetros T F(max), V F(max) e V F * dos OAPs dos pixels e para as resoluções temporais 0,1ms, 0,2ms,
8 96 0,3ms, 0,4ms, 0,5ms e 1,0ms obtidas por meio de processamento digital do sinal com resolução temporal de 2,0ms, as diferenças foram mais distorcidas com a menor interpolação do processamento, e mais intensa para o parâmetro V F * (201,23%), como mostra a Tabela 8. Tabela 8: Diferença entre Parâmetros T F(max), V F(max) e V F * calculados para os potenciais de ação ópticos entre os pixels e com resolução espacial de 0,4mm e processados por Butterworth e Spline Fit obtendo resoluções temporais Resolução Temporal* de 0,1ms, 0,2ms, 0,3ms, 0,4ms, 0,5ms e 1,0ms. Parâmetros T F(max) (ms) V F(max) (mv) V F * Diferença entre os parâmetros dos pixels e 0,1 ms 1,0 (Ref.) -1,17 (Ref.) -0,02 (Ref.) 0,2 ms 1,0 0,00% -1,17 0,00% -0,02 2,87% 0,3 ms 1,1 10,00% -0,80 31,34% -0,01 45,49% 0,4 ms 1,0 0,00% -1,17 0,00% -0,01 52,87% 0,5 ms 0,9 10,00% -1,49 27,41% -0,04 61,89% 1,0 ms 1,4 40,00% 0,26 122,12% 0,02 201,23% *Butterworth (or.4 Fc 88Hz) e Spline Fit aplicados no potencial de ação óptico com resolução temporal de 2,0ms. (Ref.) = Valor de referência No caso das diferentes resoluções temporais, os valores das diferenças entre cada um dos parâmetros T F(max), V F(max) e V F * dos pixels e, mostrados na Tabela 8, também apresentam variações ao reduzir-se a resolução temporal. De forma similar, parâmetros eletrofisiológicos que dependem de dois pixels do mapa óptico da atividade elétrica cardíaca, como a velocidade de condução, também tem seus valores alterados. A Tabela 9 resume o comportamento das alterações que ocorreram nos parâmetros eletrofisiológicos de tempo e voltagem do upstroke, para os sinais simulados (T S(max), V S(max) e V S *) e experimentais (T F(max), V F(max) e V F ) em função das variações de resolução espacial ou temporal.
9 97 Tabela 9: Variação dos parâmetros eletrofisiológicos para os resultados simulados (A) e experimentais (B), em função da resolução espacial ou temporal. A seta indica diminuição do valor e a seta, aumento do valor. A Simulação AP cell Simulação AP avg Simulação AP avg com resolução temporal de 2,0ms, adição de ruído e processamento digital Simulação AP avg AP cell Variação da Resolução temporal temporal temporal por interpolação espacial (125 células para uma célula) T S(max) V S(max) V S* até resol. temp. de 0,3ms e para resoluções de 0,4 a 2,0ms até resol. temp. de 0,5ms e para resoluções de 1,0 e 2,0ms B 3,2mm 0,4mm* OAP do Pixel + 3,2mm 0,4mm* OAP do Pixel O OAP do Pixel + 0,4mm OAP do Pixel O 0,4mm Variação da Resolução espacial (experimental) espacial (experimental) temporal por interpolação (experimental) temporal por interpolação (experimental) T F(max) V F(max) V F* *Butterworth (or.4 Fc 88Hz) e Spline Fit aplicados no potencial de ação óptico obtendo resolução temporal final de 0,1ms Nos resultados simulados (Tabela 9A), o aumento da resolução temporal (2,0ms para 0,1 ms) para o potencial de uma célula (AP cell ) resultou em elevação dos valores dos parâmetros do upstroke (T S(max),V S(max) e V S *), mas o oposto foi observado ao se integrar espacialmente o sinal (AP avg ). O aumento da resolução espacial do sinal simulado, por meio da avaliação dos parâmetros AP avg e AP cell para as mesmas resoluções temporais, resultou em redução sistemática do valor do
10 98 parâmetro T S(max), mas os parâmetros V S(max) e V S * para resoluções temporais mais altas, cresceram com o aumento a resolução espacial, e, contrariamente, reduziram para as resoluções temporais menores. Nos resultados experimentais (Tabela 9B), a variação dos parâmetros eletrofisiológicos do upstroke (T F(max), V F(max) e V F *) foi positiva para o aumento da resolução temporal e espacial, porém, não apresenta um comportamento gradual sistemático ao longo das resoluções intermediárias (Tabela 3 e Tabela 4). Portanto, as resoluções temporais e espaciais influenciam nos resultados das medições de mapeamento óptico da atividade elétrica de corações isolados, podendo introduzir distorções na morfologia do potencial de ação óptico e nos parâmetros eletrofisiológicos dos potenciais de ação obtidos e na interpretação da propagação da frente de onda de ativação no tecido cardíaco. 5.2 Conclusões No presente trabalho, o estudo dos efeitos das resoluções temporal e espacial no mapeamento óptico da atividade elétrica em corações isolados de coelho indica que resoluções inadequadas introduzem distorções na morfologia de potenciais de ação ópticos que resultam em variações não-lineares para diferentes parâmetros eletrofisiológicos. Desta forma, é necessário considerar a resolução da instrumentação e o processamento digital aplicado no sinal óptico na elaboração e interpretação dos resultados de um estudo eletrofisiológico. A aplicação de processamento digital pode diminuir as distorções causadas pela influência das resoluções espacial e temporal nos parâmetros eletrofisiológicos do upstroke do potencial de ação. A combinação de Butterworth e Spline Fit mostrou ser confiável para reduzir o ruído enquanto melhora a estimativa de parâmetros do potencial de ação, como a derivada máxima do upstroke. Entretanto, os valores para as características de cada processamento, como ordem e frequência de corte, devem ser adaptados considerando as medições experimentais e sua instrumentação. A integração espacial contribui para a menor inclinação do upstroke do potencial de ação óptico e as variações nos valores dos parâmetros V S *, ao
11 99 reduzir-se a resolução temporal ou espacial, são menores para upstrokes de potenciais de ação cuja inclinação é menor, isto é, upstrokes cuja velocidade de despolarização é mais lenta. Maiores resoluções espaciais dos mapas ópticos permitem melhores visualização da curvatura da frente de propagação da atividade elétrica. Enquanto baixas resoluções espaciais prejudicam a visualização da curvatura da frente de onda e a identificação e localização de bloqueios, além de distorcer os registros de potenciais de ação locais dificultando a análise do comportamento eletrofisiológico do tecido. A combinação de estudos da influência do espalhamento de fótons em mapas ópticos da atividade elétrica de um volume de tecido cardíaco, realizados recentemente [15-16], com o estudo apresentado neste trabalho descreve a soma das principais distorções do potencial de ação óptico em relação ao potencial de ação medido por microeletrodos. 5.3 Perspectivas e Trabalhos Futuros Modelagem matemática da propagação da atividade elétrica no tecido cardíaco por meio de autômato celular: Modelagens matemáticas com objetivo de simular mapeamentos ópticos da atividade elétrica no coração podem contribuir para análise dos efeitos das resoluções temporais e espaciais para propagações com diferentes padrões e direções da frente de onda de ativação. Modelos de autômato celular que descrevem a propagação do potencial de ação em uma porção planar do tecido cardíaco, incorporando a anisotropia da condução elétrica do tecido e período refratário da ativação da célula cardíaca, possibilitam a análise de diversos padrões de propagação (normais e anormais). Combinando o estudo dos efeitos da integração espacial nos modelos de autômato celular será possível investigação da influencia da forma e direção da frente de onda nas distorções do registro do potencial causadas pela redução da resolução espacial.
12 100 Caracterização eletrofisiológica evolutiva de células-tronco ao longo da diferenciação direcionada a cardiomiócitos: Estudos clínicos com transplante de células-tronco adultas em órgãos e tecidos vêm sendo realizados e os resultados vêm se apresentando promissores. No Brasil pesquisas têm sido desenvolvidas nesta área e transplantes transendocárdicos de células-tronco adultas para tratamento de insuficiência cardíaca crônica e infarto do miocárdio têm sido realizados com sucesso. Estes tratamentos são realizados através do implante de células-tronco nãodiferenciadas. No entanto, a eficiência do transplante destas células ainda nãodiferenciadas é reduzida, sendo que a eficácia do tratamento pode ser significativamente elevada por meio do implante de células-tronco previamente diferenciadas em direção à linhagem cardiomiogênica e, em um caso ideal, modeladas em um tecido in vitro. Em trabalho futuro pretende-se realizar estudos por meio de técnicas de medição óptica e modelagens matemáticas para avaliação e identificação da evolução eletrofisiológica das células-tronco adultas direcionadas a cardiomiócitos, ao longo dos vários estágios de diferenciação e organização espacial. O esquema da montagem experimental da técnica de medição óptica, que se encontra em estágio final de implementação na PUC-Rio, está apresentado na Figura 30. As células estimuladas eletricamente e coradas com corante potenciométricos serão excitadas por uma fonte de luz e a fluorescência será adquirida por uma fotomultiplicadora acoplada a um microscópio biológico invertido epifluorescente.
13 101 Figura 30: Esquema da montagem experimental da técnica de medição óptica na PUC-Rio. O presente trabalho desenvolvido poderá contribuir para a análise e interpretação dos registros ópticos experimentais da resposta elétrica de célulastronco ao longo de sua evolução eletrofisiológica para cardiomiócitos. Estes estudos têm por objetivo acompanhar a eficácia do processo de diferenciação induzido, e, assim, contribuir para o pré-condicionamento e adequação de células para o implante terapêutico.
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