UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA FILOGENIA MOLECULAR DE LEIOTHRIX RUHLAND (ERIOCAULACEAE) E IMPLICAÇÕES TAXONÔMICAS, MORFOLÓGICAS E BIOGEOGRÁFICAS DANIELE MENDES DA SILVA FEIRA DE SANTANA

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA FILOGENIA MOLECULAR DE LEIOTHRIX RUHLAND (ERIOCAULACEAE) E IMPLICAÇÕES TAXONÔMICAS, MORFOLÓGICAS E BIOGEOGRÁFICAS DANIELE MENDES DA SILVA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Botânica da Universidade Estadual de Feira de Santana como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Botânica. ORIENTADORA: PROFª DRª ANA MARIA GIULIETTI CO-ORIENTADOR: PROFº DR. CÁSSIO VAN DEN BERG FEIRA DE SANTANA 2014

3 BANCA EXAMINADORA Prof. Dra. Livia Echternacht Andrade (Universidade Federal de Uberlândia/UFU) Prof. Dr. Luciano Paganucci de Queiroz (Universidade Estadual de Feira de Santana/UEFS) Prof. Dra. Ana Maria Giulietti Harley (Universidade Estadual de Feira de Santana/UEFS) Orientadora e Presidente da Banca Feira de Santana 2014

4 Dedico este trabalho à minha família por todo carinho direcionado a mim, e à Lamartin pelo amor e companheirismo.

5 AGRADECIMENTOS Nesses dois anos e meio de mestrado muitas instituições e muitas pessoas contribuíram para o andamento das minhas atividades, e espero ser justa em meus agradecimentos sem deixar de mencionar ninguém. Agradeço à UEFS pela oportunidade, ao Programa de Pós-graduação em Botânica pela qualidade e excelência. Agradeço à CAPES pela bolsa que recebi nos primeiro 10 meses de mestrado. Ainda agradeço ao LAMOL pela infraestrutura onde realizei todas as atividades laboratoriais. Sou muito grata à professora Ana Maria Giulietti, por tudo que me ofereceu nesse período. Seus ensinamentos com credibilidade de décadas de estudo na área, com a empolgação de uma criança que está descobrindo um brinquedo novo, é contagiante! Além disso, o carinho e dedicação que me ofereceu foram fundamentais para que eu conseguisse chegar ao final. Agradeço também pela paciência que teve comigo, pois reconheço o trabalho que dei. Enfim, trabalhar com ela significa uma descoberta nova a cada dia, sempre com muita empolgação e muito amor no que se está fazendo. Ao Cássio van den Berg (co-orientador), sou grata pelo apoio nas atividades do LAMOL e pelas instruções e esclarecimentos no processamento dos dados. Agradeço à Lia (Maria José) por ter me orientado nos primeiros passos, me apresentando a biologia molecular e me ensinado toda a base, sem a qual não teria conseguido se quer iniciar as atividades para o mestrado. Também agradeço por ter feito a ponte em mim e Ana Maria. Muito obrigada à Paty Luz, que me deu muitas instruções e total suporte nas análises de biogeografia e datação, com muita competência e dedicação. Às meninas do PPGBOT (Adriana e Gardênia), que sempre resolvem tudo com muita competência, em especial a Adriana, que além de tudo se tornou uma verdadeira amiga. No LAMOL, onde fiz minha iniciação científica e as atividades do mestrado, tenho muito a agradecer aos colegas de laboratório, que compartilhavam comigo as aflições e a

6 felicidade de quando as coisas davam certo, em especial a Cris que sempre estava à disposição para auxiliar no manuseio dos equipamentos e reagentes, à Catharina que foi muito prestativa e me auxiliou nas primeiras análises, à Jú (Pernambuco), com quem compartilhava a angustia das coisas não darem certo e sempre tinha um braço amigo para me apoiar. Meu agradecimento especial aos meninos (funcionários) Ricardo, Sinho e Evandro pela colaboração constante, mantendo a ordem no laboratório, permitindo que as atividades fossem realizadas dentro da mais perfeita ordem, principalmente Rick, de quem eu abusei bastante e sempre me auxiliou sem nunca reclamar, pelo contrário, sempre nos atende com um sorrido que nos conforta. Agradeço a Isys, que além de todo cuidado e dedicação como amiga, ainda me ajudou na parte gráfica, melhorando as imagens. Aos funcionários do LABIO, que sempre torceram muito por mim e acompanharam todos esses anos de muito trabalho: Luciana e Liu, que não estão mais lá, Juci que me ofereceu colo em momentos difíceis, Lu que sempre foi muito carinhosa, e Rose que chegou por último, e mesmo assim sempre torceu muito por mim. Também sou grata aos vigilantes da noite pela companhia e cuidado durante as várias noites que virei trabalhando no LAMOL. À minha turma de mestrado, meu obrigado cheio de saudosismo, pois sei que muitos seguirão outros caminhos, e inevitavelmente ficaremos mais distantes. Essa turma que entrou numa seleção especial foi realmente muito especial, formada por pessoas maravilhosas, muitos que se tornaram meus verdadeiros amigos e que foram fundamentais também para que eu conseguisse prosseguir no mestrado, me apoiando nos momentos de dificuldades e compartilhando suas alegrias comigo. Também sou grata aos amigos que fiz no PPGBOT (que não são da minha turma): Danilo, Luís, Evelyne, Marla, Tutti e Cássia. Também sou muito grata às minhas amigas da graduação (Sil, Lara, Milla, Piscila e Paty) que permaneceram comigo, mesmo cada uma fazendo uma coisa diferente. Meninas, muito obrigada pelo companheirismo e pela torcida sempre! Quanto ao pessoal do LabFlora, nem tenho o que falar. O carinho de vocês me permitiu conciliar o trabalho com o mestrado sem sentir o peso de tanta responsabilidade. Lá recebi atenção, respeito e muito amor, fiz bons amigos, que quero ter ao meu lado para o resto

7 da vida, muitos que eu considero como irmãos. Na oportunidade agradeço aos professores Abel, Lia e Ligia, pela compreensão, pelas instruções e conselhos. Sou muito grata à minha família pelo apoio e compreensão, em especial à minha irmã Thaynara que dividiu minhas aflições, meu cansaço, minha angústia pela prorrogação e a felicidade de ter conseguido terminar. E, por fim, ao meu marido, que há seis anos compartilha todos esses momentos comigo, e soube ter paciência e ser compreensivo, desde a monografia e em especial agora no final do mestrado que coincidiu com nosso casamento. Muito obrigada amor por você existir em minha vida, sem você nada disso seria possível, pois foi seu apoio e dedicação que me fez ir até o fim.

8 Ama-se mais o que se conquista com esforço. Benjamin Disraeli

9 SUMÁRIO DA DISSERTAÇÃO RESUMO...02 LISTA DE TABELAS...03 LISTA DE FIGURAS...03 LISTA DE APÊNDICES...06 INTRODUÇÃO GERAL A família Eriocaulaceae Martinov O gênero Leiothrix Ruhland Bibliografia citada...13 CAPÍTULO I: Leiothrix raymondii uma nova espécie, enviado para Phytotaxa...17 CAPÍTULO II: Filogenia, Biogeografia e Diversificação de Leiothrix Ruhland (Eriocaulaceae) Resumo Abstract Introdução Material e Métodos Resultados Discussão Conclusão Referências Apêndices

10 RESUMO Eriocaulaceae é uma família monofilética de Monocotiledônea. Com distribuição pantropical, inclui dez gêneros e cerca de espécies, em duas subfamílias: Eriocauloideae, com os gêneros Eriocaulon e Mesanthemum, e Paepalanthoideae com os demais gêneros e com centro de diversidade no Brasil, nos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço. Nessa região, a família se destaca pela riqueza específica e elevado número de táxons endêmicos. Para o desenvolvimento dessa dissertação foi escolhido o gênero Leiothrix considerado monofilético e muito bem sustentado por análises morfológicas e moleculares. A presente dissertação inclui além de uma Introdução Geral, dois capítulos distintos. O Capítulo 1 é a descrição da nova espécie Leiothrix raymondii, trabalho encaminhado para publicação na revista Phytotaxa. O Capítulo 2 é o estudo filogenético com base em dados moleculares de Leiothrix, baseado em 30 espécies, que tem como objetivo comprovar o monofiletismo do gênero e avaliar as relações internas do mesmo, de acordo com os subgêneros propostos por Ruhland em Foram usadas as regiões ITS e ETS do genoma nuclear e os marcadores plastidiais trnl-trnf, psba-trnh e rpl32-trnl, através de análise de Máximas Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana. O monofiletismo de Leiothrix foi confirmado, no entanto, apenas L. subg. Stephanophyllum emergiu como monofilético. Para o gênero foram obtidos dois clados, sendo um formado pelas espécies da Bahia, ao qual se agrupam também as populações dessas espécies com ocoos estados e as espécies da restinga, e um clado com as espécies de Minas Gerais, ao qual se agregou as espécies do Maciço do Itatiaia. Para complementar os resultados da filogenia do gênero, foram realizadas análises de biogeografia histórica e de evolução dos caracteres ancestrais. Na reconstrução dos caracteres ancestrais foram detectadas sinapomorfias para o Clado A e para o Clado B, no entanto, o Clado A apresentou maior retenção de estados plesiomófico que o Clado A. Uma datação molecular foi realizada para a família a fim de se obter uma idade estimada para o gênero Leiothrix, e nesta datação foi recuperada a idade para a divergência de Eriocaulaceae de Xyridaceae em 93 milhões de anos, iniciando sua diversificação em 69 milhões de anos. A biogeografia histórica mostra que o ancestral de Leiothrix teria surgido no sudoeste da Chapada Diamantina e no norte do Espinhaço Mineiro, há cerca de 23 Ma, onde sofreu um processo de vicariância que resultou em duas populações isoladas, uma na Chapada Diamantina e outra na Serra do Cipó, com a linhagem de Minas Gerais iniciando primeiro o processo de diversificação e a maioria das espécies atuais surgindo no Pleistoceno. 2

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Relação de primers e os respectivos programas utilizados para amplificação do DNA neste trabalho...34 Tabela 2. Características das matrizes e árvores mais parcimoniosas encontradas nas análises de Máxima Parcimônia individuais e combinadas...42 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Diversidade morfológica e de hábito em Leiothrix. A. Leiothrix curvifolia (Bong.) Ruhland. B. Leiothrix prolifera (Bong.) Ruhland, touceira constituída por clones (pseudoviviparidade) de um mesmo indivíduo que se mantém conectados. C. Leiothrix fluitans (Mart.) Ruhland, única espécies aquática do gênero. D. Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland. Fotos: D. Zappi (A e D), RM. Harley (B), ACO. Neves (C)...11 Capítulo 1: Figura 1. Leiothrix raymondii (drawn from Giulietti & Scatena 1360, by Carla Lima). A. Habit; B. Spathe and scape; C. Detail of spathe apex; D. Detail of leaf base; E-F. External and median involucral bracts, dorsal surface; G-H. Internal involucral bracts, dorsal and ventral surfaces; I-J. Floral bract, dorsal and ventral surfaces; K-P. Staminate flower, K. Complete flower and floral bract, L.M. Complete flower, N. Infundibuliform corolla, O. Open corolla showing stamens and pistillodes, P. Stamen with basifixed anthers; Q-T. Pistillate flower, Q. Complete flower and floral bract, R. Sepal, S. Flower with one sepal removed; T. Gynoecium Capítulo 2: Figura 1. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região nuclear ITS. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Destacado em cinza o Clado A, formado pelas espécies de Minas Gerais. Destacado em vermelho o clado C, constituído por espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum, e em azul destacado o Clado D, constituído por espécie de Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland (ambos os clados se repetem nas demais análises). A seta indica clado que se repete em outras análises, mas que ficou com suporte abaixo do corte (PP = 92)

12 Figura 2. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região nuclear ETS. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Em cinza destacado o Clado A formado pelas espécies de Minas Gerais; destacado em vermelho o Clado C, constituído pelas espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum. Em laranja destacado Clado E (que se repete em outras análises) constituídas por espécies de Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland de ocorrência na Bahia...46 Figura 3. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região plastidial rpl32-trnl. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Em cinza destacado o Clado A constituído por espécies de Minas Gerais. Em vermelho o clado C, constituído por espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum, e em azul destacado o Clado D, constituído por espécie de Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland (ambos os clados se repetem nas demais análises)...47 Figura 4. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região plastidial trnl-trnf. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Em cinza destacado o Clado A constituído por espécies de Minas Gerais. Em vermelho o clado C, constituído por espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum, e em azul destacado o Clado D, constituído por espécie de Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland (ambos os clados se repetem nas demais análises)...48 Figura 5. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região plastidial psba-trnh. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Destacado em cinza o Clado A, formado pelas espécies de Minas Gerais. Destacado em vermelho o clado C, constituído por espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum. A seta indica clado que se repete em outras análises, mas que ficou com suporte abaixo do corte (PP = 92)...49 Figura 6. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana da Análise Combinada de Plastídios. Acima dos ramos estão os valores de Probabilidade Posterior e abaixo dos ramos estão os valores de bootstrap da Máxima Verossimilhança (ML) e da 4

13 Máxima Parcimônia (MP), respectivamente. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95 e bootstrap 75. A seta indica clado que se repete em outras análises, mas que ficou com suporte abaixo do corte. As cores representam os subgêneros propostos por Ruhland (1903)...52 Figura 7. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da Combinada de Plastídios + Nucleares. Acima dos ramos estão os valores de Probabilidade Posterior e abaixo dos ramos estão os valores de bootstrap da Máxima Verossimilhança (ML) e da Máxima Parcimônia (MP), respectivamente. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95 e bootstrap 75. As cores representam os subgêneros propostos por Ruhland (1903)...53 Figura 8. Cladograma da reconstrução ancestral de caracteres morfológicos. Caráter 11 (2) Ápice da bráctea involucral, acuminado; Caráter 12 (1) Pseudoviviparidade, 1x sempre; Caráter 12 (2) Pseudoviviparidade, 2 5x sempre; Caráter 14 (1) Ápice da bráctea floral, acuminado...56 Figura 9. Cladograma da reconstrução ancestral de caracteres morfológicos. Caráter 1 (1) Filotaxia, dística; Caráter 5 (1) Células apicais dos tricomas, globosas; Caráter 6 (2) Ápice da espata, truncado; Caráter 13 (1) Proporção flores estaminadas X flores pistiladas, < flores pistiladas; Caráter 15 (1) Simetria das flores estaminadas, zigomorfas; Caráter 21 (1) Simetria das flores pistiladas, zigomorfas...57 Figura 10. Cladograma resultante de datação secundária de Eriocaulaceae baseada no consenso de maioria da Inferência Bayesiana utilizando a região plastidial trnl-trnf. A datação foi calibrada na idade da divergência de Eriocaulaceae e Xyridaceae (105 m.a.), segundo Janssen & Bremer (2004)...60 Figura 11. Datação e análise biogeográfica de Leiothrix. Cronograma consensual resultante da datação do gênero. Seta indica nó de calibração; Asteriscos indicam nós com sustentação > 95% na Inferência Bayesiana; Barras cinzas indicam intervalos com 95% de credibilidade para as idades; Pizzas representam a distribuição ancestral inferiida; Elipses indicam as áreas de distribuição atual; Círculo vermelho = vicariância; Círculo azul = dispersão. Achurado na escala geológica = Holoceno. Mapa delimita a distribuição das espécies atuais

14 LISTA DE APÊNDICES Apêndice 1. Espécies de Leiothrix utilizadas no estudo filogenético e seus respectivos materiais testemunho, e inclusão nos subgêneros proposto por Ruhland (1903)...86 Apêndice 2. Informações dos vouchers das sequências de DNA utilizadas no estudo filogenético. As informações estão organizadas das seguintes formas: Espécie, autor, país, estado, coletor e número de coleta (voucher do herbário), número de acesso Genbank para ITS, ETS, trnl-trnf, psba-trnh e rpl32-trnl, respectivamente. Asterisco (*) indica sequencias geradas neste estudo...90 Apêndice 3. Lista de caracteres morfológicos com seus respectivos estados de caráter...92 Apêndice 4. Matriz dos caracteres morfológicos de Leiothrix e das espécies utilizadas como grupo externo para reconstrução dos caracteres ancestrais...94 Apêndice 5. Cladogramas individuais selecionados da reconstrução ancestral, para os caracteres morfológicos informativos. A Ápice da bráctea involucral interna do capítulo (Caráter 1); B Pseudoviviparidade (Caráter 12); C Ápice da bráctea floral (Caráter 14); D Fusão das pétalas das flores estaminadas (Caráter 19); E Simetria das flores pistiladas (Caráter 21); F - Simetria das flores estaminadas (Caráter 15); G Filotaxia (Caráter 1); H Proporção flores estaminadas X flores pistiladas (Caráter 13); I Ápice da espata (Caráter 6); J Células apicais dos tricomas glandulares (Caráter 5)...96 Apêndice 6. Cladograma do consenso estrito de Leiothrix apresentado por Giulietti et al. (1995), derivado dos dois cladograma mais parcimoniosos. representa uma apomorfia; = representa um paralelismo; x representa uma reversão; - representa um estado de caráter provavelmente plesiomórficos de Leiothrix, mas com diferentes estados nas três espécies de Syngonanthus usadas como grupo externo e codificado como? na matriz. Letras maiúsculas representam os nós

15 INTRODUÇÃO GERAL I. A família Eriocaulaceae Martinov Eriocaulaceae pertence ao grupo das monocotiledôneas, podendo ser caracterizada por apresentar caule curto com folhas em roseta, flores unissexuadas e pequenas, reunidas em inflorescência capituliforme e grãos de pólen do tipo espiroaperturado (Giulietti et al. 1995, 2000). Atualmente a família possui cerca de espécies distribuídas em dez gêneros, reunidos em duas subfamílias: Paepalanthoideae - Actinocephalus (Wikstr.) Sano, Comanthera L.B.Sm emend. L.R. Parra & Giul., Lachnocaulon Kunth, Leiothrix Ruhland, Paepalanthus Mart., Rondonanthus Herzog, Syngonanthus Ruhland e Tonina Aubl., e Eriocauloideae - Eriocaulon L. e Mesanthemum Körn. (Ruhland 1903, Sano 2004, Giulietti et al. 2009, 2012a, Andrade et al. 2010, 2011, Parra et al. 2010). Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae é caracterizada por apresentar flores isostêmones, com dois ou três estames, sem glândulas nas pétalas, enquanto Eriocaulaceae subf. Eriocauloideae apresenta flores diplostêmones, com quatro ou seis estames, e pétalas com glândulas (Rosa & Scatena 2007). Para o Brasil são referidas 629 espécies, que ocorrem nos seis Domínios Vegetacionais do país. (Giulietti et al. 2010). Os principais centros de diversidade da família estão relacionados aos seguintes Domínios: No Cerrado ocorrem cerca de 440 espécies, incluídas especialmente na Cadeia do Espinhaço o principal centro de diversidade de Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae, especialmente nos campos rupestres de Minas Gerais e da Bahia, e nas Serras de Goiás. Na Amazônia ocorrem as espécies de Eriocaulaceae associadas ao Planalto das Guianas. Na Mata Atlântica, ocorrem nas restingas litorâneas, de Norte a Sul e, nas Serras do Leste brasileiro. Grande parte das espécies de Eriocaulaceae tem distribuição microendêmica, porém, várias espécies têm distribuição disjunta na Cadeia do Espinhaço e Planalto das Guianas ou na Cadeia do Espinhaço e nas restingas litorâneas (Echternacht et al. 2011a, 2011b, Giulietti & Pirani 1988, Giulietti & Hensold 1990, Giulietti et al. 2010). As Eriocaulaceae ocupam geralmente hábitats abertos, em solos arenosos, de ph ácido, especialmente em substratos de quartzitos e arenitos (Echternacht et al. 2011a). São geralmente plantas terrestres, mas várias espécies podem ser aquáticas ou anfíbias, especialmente as do gênero Eriocaulon (Scatena et al. 2005, Giulietti et al. 2012a). 7

16 Conhecidas genericamente como sempre-vivas, as Eriocaulaceae têm grande importância econômica, sendo os escapos e capítulos utilizados para decoração de interiores e produção de artesanato. A atividade extrativista realizada pelas populações da Cadeia do Espinhaço e a sua comercialização é de grande importância econômica para alguns municípios de Minas Gerais e da Bahia (Giulietti et al. 1988). O nome sempre-viva, ou verlasting plants em inglês, deriva da capacidade que tem os escapos e capítulos das plantas de, mesmo depois de retirados da natureza, permanecerem com a cor e forma originais. Em função disso, elas alcançam alto valor comercial, com dezenas de toneladas exportadas todos os anos para Europa e Estados Unidos (Giulietti et al. 1996). Mais recentemente, as comunidades da região do Jalapão em Tocantins, tem utilizado os escapos do capim-dourado [Syngonanthus nitens (Körn.) Ruhland] na fabricação de peças artesanais e bijuterias. O extrativismo e manejo do capim-dourado tem permitido a manutenção da utilização da espécie e os produtos ali fabricados podem ser comprados em várias cidades do Brasil e do exterior. A família Eriocaulaceae foi considerada como um grupo distinto por Martynov (1820). Martius (1835) realizou a primeira revisão da família, reconhecendo três gêneros, sendo dois anteriormente descritos, Eriocaulon e Tonina, e um novo proposto por ele, Philodice. Como parte de Eriocaulon reconheceu E. subg. Paepalanthus Mart., distinto por apresentar dois ou três estames e pétalas sem glândulas e não quatro ou seis estames e pétalas com glândulas como em E. subg. Eriocaulon. Kunth (1841) descreveu o gênero Lachnocaulon e reconheceu Paepalanthus no nível genérico, incluindo nele as espécies descritas por Martius (1835) em Eriocaulon subg. Paepalanthus, e realizou a combinação de várias espécies de Eriocaulon em Paepalanthus. Körnicke (1863), na Flora Brasiliensis, reconheceu os seguintes gêneros para o Brasil: Mesanthemum (hoje considerado como restrito à África), Eriocaulon, Paepalanthus, Philodice e Tonina. Ruhland (1903) apresentou o último tratamento taxonômico geral para Eriocaulaceae. O autor reconheceu duas subfamílias, Eriocauloideae e Paepalanthoideae, e nove gêneros, dos quais três propostos por ele: Blastocaulon Ruhland, Leiothrix e Syngonanthus. Esses gêneros foram formados a partir de espécies segregadas do gênero Paepalanthus, sendo geralmente parte de subgêneros já reconhecidos por Körnicke (1863). Posteriormente, foram descritos os gêneros Rondonanthus por Herzog (1931), Comanthera por Smith (1937), Carptotepala por Moldenke (1951) e Actinocephalus por Sano (2004). 8

17 O trabalho de Ruhland (1903) constitui até o presente, a base taxonômica da família. Contudo, estudos morfológicos, taxonômicos e filogenéticos tem ajudado em um melhor conhecimento taxonômico dos agrupamentos na família, e na delimitação de gêneros baseados em grupos monofilético (Andrade 2007; Andrade et al. 2010; Borges et al. 2009; Echternacht et al. 2011b, 2012; Giulietti 1984; Giulietti et al. 1995, 2000, 2012a; Hensold 1988; Sano 2004; Scatena 1990, 2005; Stützel 1987; Tissot-Squalii 1997; Trovó et al. 2013; Unwin 2004). Embasados nesses estudos foi possível propor a revalidação de Comanthera (Parra et al. 2010), a sinonimização de Blastocaulon em Paepalanthus (Andrade et al. 2011) e a sinonimização de Philodice em Syngonanthus (Giulietti et al. 2012b). Os estudos visando um melhor entendimento dos gêneros e espécies de Eriocaulaceae continuam em andamento por diferentes grupos do Brasil e do exterior. Eles incluem estudos taxonômicos, morfológicos, filogenéticos, biogeográficos e populacionais e certamente trarão grande contribuição à taxonomia da família. Nesse sentido, este trabalho é mais uma contribuição ao estudo de Eriocaulaceae. II. O gênero Leiothrix Ruhland Leiothrix inclui as espécies de Eriocaulaceae com flores trímeras, flores estaminadas com corola gamopétala ou dialipétala, anteras basifixas, flores pistiladas com o gineceu portando estiletes unidos em uma coluna até o terço superior, com ramos estigmático e nectarífero liberando-se em alturas diferentes e sementes estriadas (Giulietti 1984, Giulietti et al. 2000). Leiothrix foi descrito por Ruhland (1903), e a palavra deriva do grego que significa tricoma liso, devido às paredes lisas dos tricomas do perianto. Tal característica une esse gênero a Syngonanthus e os diferenciam de Paepalanthus que geralmente apresenta tricomas com as paredes ornamentadas. Ruhland (1903) incluiu 27 espécies no gênero, que foi formado a partir de espécies descritas anteriormente em Eriocaulon e Paepalanthus. Foram acrescidas espécies novas descritas pelo autor (Giulietti 1984). Para Moldenke (1971) o gênero incluiria 69 espécies, mas segundo Giulietti et al. (2010) o gênero é formado por 49 espécies e 18 táxons infraespecíficos, sendo 46 espécies endêmicas do Brasil. Apenas Leiothrix celie não ocorre no Brasil, e Leiothrix flavescens ocorre também nos tepuis da Venezuela, Peru e planalto da Guianas (Giulietti & Hensold 1991). Giulietti et al. (2009) consideraram 13 espécies como raras no gênero Leiothrix. 9

18 Leiothrix tem distribuição restrita à América do Sul, sendo que mais de 80% de suas espécies ocorre apenas na Cadeia do Espinhaço, no leste do Brasil, o principal centro de diversidade do gênero. Tais espécies são geralmente endêmicas dos estados de Minas Gerais ou da Bahia (Giulietti 1984). Leiothrix flavescens ocupa toda a área de distribuição geográfica do gênero, ocorrendo no Brasil, da região Amazônica, passando para a Cadeia do Espinhaço da Bahia e Minas Gerais, restingas da Bahia, montanhas da mata atlântica de São Paulo e Paraná e atingindo as restingas do Rio Grande do Sul. Leiothrix hirsuta (Wikstr.) Ruhland e L. rufula (St-Hil.) Ruhland ocorrem disjuntamente na Chapada Diamantina e nas restingas litorâneas. Duas espécies são endêmicas do Pico do Itatiaia: Leiothrix argyroderma Ruhland e L. beckii (Szyszylowicz) Ruhland. As espécies de Leiothrix são encontradas preferencialmente nas montanhas acima de m de altitude (exceto as de restinga), ocorrendo em diversos domínios fitogeográficos: Amazônia, Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica (Giulietti 1984, Giulietti & Hensold 1990, Giulietti & Pirani 1988, Giulietti et al. 2010). Harley (1984) atribui ocorrência de espécies de Leiothrix tanto em campos rupestres quanto em restingas litorâneas, ao fato dos solos, em ambos os tipos de vegetação, apresentarem características físicas semelhantes, além de baixo nível de nutrientes. Em todas as análises cladísticas apresentadas tanto morfológicas (Giulietti et al. 1995, 2000) como moleculares (Andrade 2007, Andrade et al. 2010, Giulietti et al., 2012a, Trovó et al. 2013), Leiothrix sempre se apresentou como um grupo monofilético bem sustentado. Porém, suas relações infragenéricas ainda não foram avaliadas com base em dados moleculares. Ruhland (1903) reconheceu cinco subgêneros: Leiothrix subg. Rheocaulon Ruhland, apenas com L. fluitans (Mart.) Ruhland, a única espécie aquática do gênero, e com corola dialipétala na flor estaminada; L. subg. Eleutherandra Ruhland com três espécies terrestres, com corola dialipétala na flor estaminada; L. subg. Stephanophyllum (Guill.) Ruhland com oito espécies, com corola gamopétala na flor estaminada e pseudoviviparidade (denominação apresentada por Coelho et al. 2006, 2008); L. subg. Calycocephalus Ruhland com 15 espécies em duas secções, com corola gamopétala na flor estaminada e sem pseudoviviparidade; e, L. subg. Psilanthus Ruhland, que incluiu apenas L. arechavaletae Ruhland do Uruguai e com flores sem brácteas. Ruhland (1903) utilizou os seguintes caracteres para distinguir os subgêneros: hábito, fusão ou não das pétalas das flores estaminadas, presença ou não de brácteas florais e presença ou não de brotamentos 10

19 vegetativos no capítulo (pseudoviviparidade). Parte da diversidade morfológica e de hábitodas espécies do gênero pode ser vista na Figura 1. Figura 1. Diversidade morfológica e de hábito em Leiothrix. A. Leiothrix curvifolia (Bong.) Ruhland. B. Leiothrix prolifera (Bong.) Ruhland, touceira constituída por clones (pseudoviviparidade) de um mesmo indivíduo que se mantém conectados. C. Leiothrix fluitans (Mart.) Ruhland, única espécies aquática do gênero. D. Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland. Fotos: D. Zappi (A e D), RM. Harley (B), ACO. Neves (C). 11

20 Giulietti et al. (1995) realizaram o primeiro estudo filogenético em Eriocaulaceae, apresentando uma análise cladística baseada em 29 caracteres morfológicos de 11 táxons representantes de oito gêneros com o objetivo de avaliar o relacionamento de Leiothrix com os outros gêneros da família. Leiothrix se mostrou monofilético, com alto suporte de bootstrap, tendo Syngonanthus como grupo irmão. Contudo a classificação infragenérica proposta por Ruhland (1903) não foi sustentada e apenas Leiothrix subg. Stephanophyllum mostrou-se monofilético, sendo que os demais subgêneros apresentaram-se como merofiléticos. Na segunda análise morfológica o conjunto de dados foi ampliado para 49 caracteres morfo-anatômicos e 25 táxons representando vários gêneros e táxons infragenéricos (Giulietti et al. 2000). Em relação a Leiothrix, os resultados foram semelhantes ao estudo anterior, e apenas L. subg. Stephanophyllum apareceu monofilético. Nos estudos filogenéticos baseados em sequências de DNA em Eriocaulaceae - Unwin (2004), Andrade (2007), Andrade et al. (2010), Giulietti et al. (2012) e Trovó et al. (2013), o gênero Leiothrix mostrou-se sempre monofilético. Em todos esses trabalhos, Leiothrix foi representado por um número pequeno de espécies de alguns de seus subgêneros, já que o objetivo era avaliar apenas o monofiletismo do gênero e não suas relações internas. Giulietti (em preparação) apresenta uma sinopse do gênero, baseada, em parte, na sua tese de livre-docência não publicada (Giulietti 1984). Nesse trabalho, reconhece 38 espécies válidas como incluídas em Leiothrix. Porém, o posicionamento dos subgêneros ainda não foi definido, o que só será possível após a conclusão deste trabalho. O presente trabalho está dividido em três partes, sendo a primeira uma Introdução Geral para situar os estudos já realizados em Eriocaulaceae e especialmente em Leiothrix, incluindo a bibliografia citada, e mais dois capítulos, sendo o primeiro a descrição da nova espécie Leiothrix raymondii D.M. Silva & Giul., enviado para publicação na revista Phytotaxa (Capítulo 1), e o segundo com os estudos filogenéticos e biogeográficos de Leiothrix (Capítulo 2), onde foram utilizadas praticamente todas as espécies reconhecidas por Giulietti (em preparação), e utilizados os marcadores plastidiais e nucleares visando (1) confirmar o monofiletismo de Leiothrix; (2) examinar os relacionamentos filogenéticos dentro do gênero para testar os subgêneros propostos por Ruhland (1903) e (3) apresentar uma hipótese de evolução biogeográfica e morfológica para o gênero. 12

21 BIBLIOGRAFIA CITADA Andrade, M.J.G Filogenia e Taxonomia em Eriocaulaceae Neotropicais. Tese de Doutorado, Programa de Pós-Graduação em Botânica Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana. Andrade, M.J.G.; Giulietti, A.M.; Rapini, A.; Queiroz, L.P.; Conceição, A.S.; Almeida, P.R.M. & Van Den Berg, C A comphreensive phylogenetic analysis of Eriocaulaceae: evidence from nuclear (ITS) and plastid (psba-trnh and trnl-trnf) DNA sequences. Taxon 59 (2): Andrade, M.J.G.; Giulietti, A.M.; Harley, R.M. & Van Den Berg, C Blastocaulon (Eriocaulaceae), a synonym of Paepalanthus: morphological and molecular evidence. Taxon 60(1): Borges, R.; Giulietti, A.M. & Santos, F.A.R Comparative pollen morphology and taxonomic considerations in Eriocaulaceae. Review of Palaeobotany and Palynology.154: Coelho, F.F; Capelo, C.; Neves, A.C.O.; Martins, R.P.; Figueira, J.E Seasonal Timing of Pseudoviviparous Reproduction ofleiothrix (Eriocaulaceae) Rupestrian Species in South-eastern Brazil. Annals of Botany, 98: Coelho, F.F; Capelo, C.; Neves, A.C.O.; Martins, R.P.; Figueira, J.E Reproductive Modes in Leiothrix (Eriocaulaceae) in South-eastern Brazil: The Role of Microenvironmental Heterogeneity. Annals of Botany, 101: Echternacht, L Sistemática de Comanthera e Syngonanthus (Eriocaulaceae). Tese de Doutorado, Instituto de Biociências, Departamento de Botânica - Universidade de São Paulo, São Paulo. Echternacht, L.; Trovó, M.; Oliveira, C.T. & Pirani, J.R. 2011a. Areas of endemism in the Espinhaço Range in Minas Gerais, Brazil. Flora 206: Echternacht, L.; Sano, P. T.; Trovó, M. & Dubuisson, J.Y. 2011b. Phylogenetic analysis of the Brazilian microendemic Paepalanthus subgenus Xeractis (Eriocaulaceae) inferred from morphology. Botanical Journal Linnean Society. 167:

22 Giulietti, A.M Estudos taxonômicos no gênero Leiothrix Ruhland (Eriocaulaceae). Tese de Livre-Docência, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo. Giulietti, A.M. & Pirani, J.R Patterns of geographic distribution of some plant species from the Espinhaço Range, Minas Gerais and Bahia, Brazil. In: Vanzolini, P.E. & Heyer, W.R. (eds.), Proceedings of a workshop on Neotropical distribution patterns. Academia Brasileira de Ciências, Rio de Janeiro. p Giulietti, A.M. & Hensold, N Padrões de distribuição geográfica dos gêneros de Eriocaulaceae. Acta Botanica Brasilica 4 (1): Giulietti, A.M. & Hensold, N Nomenclatural changes and range extension in Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhl. (Eriocaulaceae). Novon 1 (1): Giulietti, A.M.; AmaraL, M.C.E. & Bittrich, V Phylogenetic analysis of inter and infrageneric relationships of Leiothrix Ruhland (Eriocaulaceae). Kew Bulletin 50: Giulietti, A.M.; Wanderley, M.G.L.; Longhi-Wagner, H.M.; Pirani, J.R. & Parra; L.R Estudos em sempre-vivas : taxonomia com ênfase nas espécies de Minas Gerais. Acta Bot. Bras. 10: Giulietti, A.M.; Scatena, V.L.; Sano, P.T.; Parra, L.R.; Queiroz, L.P.; Harley, R.M.; Menezes, N.L.; Benko-Yseppon, A.M.; Salatino, A.; Salatino, M.L.; Vilegas, W.; Santos, L.C.; Ricci, C.V.; Bonfim, M.C.P. & Miranda, E.B Multidisciplinary studies on Neotropical Eriocaulaceae. In: Wilson, K.L.; Morrison, D.A. (eds.), Monocots II: Systematic and Evolution. CSIRO, Melbourne. p Giulietti, A.M.; Andrade, M.J.G.; Parra, L.R.; Van Den Berg, C. & Harley, R.M Proposal to conserve the name Syngonanthus against Philodice (Eriocaulaceae). Taxon 58: Giulietti, A.M.; Andrade, M.J.G.; Trovó, M. & Sano, P.T Catálogo de plantas raras do Brasil: Eriocaulaceae In: Giulietti et al. (eds). Plantas raras do Brasil.1 ed., Conservação Internacional/UEFS, Belo Horizonte, p

23 Giulietti, A.M.; Sano, P.T.; Costa, F.N.; Parra, L.R.; Echternacht, L.; Tissot-Squalii, M.L.; Trovó, M.; Watanabe, M.T.C.; Freitas, M.P.; Hensold, N Eriocaulaceae. In: Forzza, R.C. et al.(orgs.). Catálogo de plantas e fungos do Brasil. 2: Giulietti, A.M.; Andrade, M.J.G.; Scatena, V.L.; Trovó, M.; Coan, A.I.; Sano, P.T.; Santos, F.A.R. & Borges, R.L.B.; Van Den Berg, C. 2012a. Molecular phylogeny, morphology and their implications for the taxonomy of Eriocaulaceae. Rodriguésia 63(1): Giulietti, A.M.; Hensold, N.; Parra, L.R.; Andrade, M.J.G.; Van Den Berg, C. & Harley, R.M. 2012b. The synonymization of Philodice with Syngonanthus (Eriocaulaceae). Phytotaxa 60: Giulietti, N.; Giulietti, A. M; Pirani, J. R. & Menezes, N. L Estudos em sempre vivas: importância econômica do extrativismo em Minas Gerais. Acta Botanica Brasilica 1: Hensold, N.C Morphology and systematics of Paepalanthus subgenus Xeractis (Eriocaulaceae). Systematic Botany Monographs 23: Herzog, T Neuer und weniger bekannte Eriocaulaceae aus Nord Brailien und em angrenzenden Venezuela. In: Fedde (ed.) Repertorium specierum novarum regni vegetabilis 25: Körnicke, Fr Eriocaulaceae. In: Martius, C. F. P. von; Eichler, A. G.; Urban, N. I. (eds.), Flora Brasiliensis. Typographi Regia, 5 (3): Kunth, C.S Eriocaulaceae. In: Cottae, J.G. (ed.) Enumeratio Plantarum, v.3. Stuttgard. Martius, C.F.P Die Eriocauleae als selbstandige Pflanzenfamilie, aufgestellt and erlautert. Nova Acta Academy Nature Cur. 17: Moldenke, H.N Eriocaulaceae. In: Steyermark, J. (ed). Botanical exploration in Venezuela. Fieldiana Botany 28: Moldenke, H.N Additional notes on the Eriocaulaceae XXXVI. Phytologia 21(4):

24 Parra, L.R.; Giulietti, A.M.; Andrade, M.J.G. & Van Den Berg, C Reestablishment and new circumscription of Comanthera (Eriocaulaceae). Taxon 59 (4): Ruhland, W Eriocaulaceae. In: Engler, A. (ed.), Das Pflanzenreich Regni vegetabilis conspectus. Engelmann, Leipzig. 239p. Sano, P.T Actinocephalus (Körn.) Sano (Paepalanthus sect. Actinocephalus), a new genus of Eriocaulaceae, and other taxonomic and nomenclatural changes involving Paepalanthus Mart. Taxon (53): Scatena, V.L Morfoanatomia de espécies de Syngonanthus Ruhl. (Eriocaulaceae) dos campos rupestres do Brasil. Tese de Doutorado. Instituto de Biociências, Departamento de Botânica, Universidade de São Paulo, São Paulo. Scatena, V. L.; Giulietti, A.M.; Borba, E.L. & Van Den Berg, C Anatomy of Brazilian Eriocaulaceae: correlation with taxonomy and habitat using multivariate analyses. Plant Systematic Evolution 253: Smith, L.B A new genus of Eriocaulaceae. Contr. Gray Herb. 117: 38. Stützel, T On the morphological and systematic position of the genus Moldenkeanthus (Eriocaulaceae). Plant Systematic Evolution 156: Tissot-Squalii, M. L Monographische Bearbeitung von Paepalanthus subgenus Platycaulon. PhD Thesis. Ruhr Universität Bochum, Ruhr. Trovó, M.; Andrade, M.J.G.; Sano, P.T.; Ribeiro, P.L. & Van Den Berg, C Molecular phylogenetics and biogeography of Neotropical Paepalanthoideae with emphasis on Brazilian Paepalanthus (Eriocaulaceae). Botanical Journal Linnean Society. 171: Unwin, M. M Molecular systematics of the Eriocaulaceae Martinov. Dissertation of the Department of Botany. Miami University. Oxford, Ohio. 16

25 CAPÍTULO I A new species of Leiothrix (Eriocaulaceae) from the Espinhaço Range, Bahia, Brazil. Artigo submetido à revista Phytotaxa 17

26 A new species of Leiothrix (Eriocaulaceae) from the Espinhaço Range, Bahia, Brazil DANIELE MENDES DA SILVA 1 & ANA MARIA GIULIETTI 1,2 1 Programa de Pós-Graduação em Botânica, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina s.n., Novo Horizonte, , Feira de Santana, Bahia, Brazil 2 Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond, Surrey, TW9 3AB, UK. address: anagiulietti@hotmail.com Abstract A new species of Leiothrix (Eriocaulaceae) from Brazil is described and illustrated. Leiothrix raymondii is an endemic plant, living in the shadow of rocks, in the large rocky outcrops, occurring in the southern part of the Espinhaço range in Bahia state, Brazil. The species is here assessed as endangered. Keywords: Campos rupestres, Leiothrix raymondii, savanna, taxonomy. Resumo Uma nova espécie de Leiothrix (Eriocaulaceae) do Brasil é descrita e ilustrada. Leiothrix raymondii é uma espécie endêmica, que vive na sombra de grandes rochas, nas partes mais altas da porção Sul da Cadeia do Espinhaço no estado da Bahia, Brasil e está sendo considerada como em Perigo de Extinção. Palavras chave: Cadeia do Espinhaço, campos rupestres, Leiothrix raymondii, taxonomia. Introduction The highland region known as the Chapada Diamantina occupies a central position in the state of Bahia and is a centre of diversity for Neotropical Eriocaulaceae. Ruhland (1903) cites 31 species for the state of Bahia, Brazil, based mainly on Blanchet's collections which were made mostly around the town of Jacobina. Recent studies have shown that the species 18

27 richness is much greater, including especially Paepalanthus Martius (1835:28) nom. cons., Comanthera Smith (1937: 38) emend. Parra & Giul. in Parra et al. (2010: 1136) and Leiothrix Ruhland (1903: 225) species. Moldenke (1980) listed 55 taxa from Bahia based on the collections of R. M. Harley and co-workers, 15 of them described as new taxa. Giulietti (1996) refers seven species of Leiothrix for the state of Bahia: L. angustifolia (Körnicke 1863: 424) Ruhland (1903: 231), L. distichoclada Herzog (1924: 88), L. flavescens (Bongard 1831: 628) Ruhland (1903: 231), L. hirsuta (Wikström 1820: 745) Ruhland (1903: 229), L. pilulifera (Körnicke 1863: 425) Ruhland (1903: 231), L. rufula (Saint-Hilaire 1833: 391) Ruhland (1903: 230) and L. schlechtendalii (Körnicke 1863: 425) Ruhland (1903: 231). All occur in the Chapada Diamantina, except L. pilulifera occurring in the Atlantic coastal restingas. Apart from these general treatments, some areas of the Chapada Diamantina have been surveyed. Giulietti (1986) published a treatment for the Florula of Mucugê, including six Leiothrix species. Giulietti & Parra (1995) refer the same species for the Flora of Pico das Almas, except L. hirsuta. Miranda & Giulietti (2001) refer Leiothrix angustifolia and L. flavescens for the Serra do Pai Inácio (Municipality of Palmeiras) and Serra da Chapadinha (Municipality of Lençóis). Leiothrix is a Neotropical genus with about 49 species, occurring in Brazil, especially in the Espinhaço Range in Minas Gerais and Bahia (Giulietti & Hensold 1990, Giulietti et al. 2010). It is a monophyletic clade in the Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae, based on morphological and molecular data (Giulietti et al. 1995, Andrade et al. 2010, Giulietti et al. 2012). During the on-going revision of Leiothrix for the Flora Neotropica, a new analysis of the specimens from Pico das Almas and Catolés was made and mixed with L. sclechtendalii a new species was recognized and is described in this paper. Leiothrix raymondii Giul. sp. nov. (Fig. 1A-T). Leiothrix raymondii is similar to L. schlechtendalii and also to L. fulgida Ruhland (1903: 233) due to the spathe with apex 3-dentate, leaves and spathe with filamentous and capitate trichomes together, zygomorphic staminate and pistillate flowers, and a pilose annulus between corolla and gynoecium. Leiothrix raymondii differs from both, especially, by the longer leaves ( ) cm versus short leaves, (1.7 ) ( 11.0) cm; the scapes are short (10.5) cm versus ( ) cm, and few per plant versus many per plant. L. raymondii also differs from L. schlechtendalii 19

28 by the flat leaves, pubescent on both surfaces, scape 3-costate, and pistillate flowers with sepals the same size as the ciliate petals versus conduplicate leaves, pubescent on adaxial face and glabrous on the adaxial face, scape 6-costate, and pistillate flowers with sepals 2 the size of the glabrous petals. L. raymondii also differs from L. fulgida by the involucral bracts elliptic-lanceolate and apex acute, and staminate flowers with short pistillodes versus involucral bracts obovate to ovate and apex round and staminate flowers with pistillodes up ½ size of the filaments. Also L. fulgida is endemic to the Diamantina Plateau in Minas Gerais, in humid sandy soil. Type: BRAZIL. Bahia: Rio de Contas, Pico das Almas, ca. 1800m, 14 December 1984, Giulietti, Harley, Stannard, Longhi-Wagner, Lewis & Arraes in CFCR* 6927 (*Coleção da flora dos campos rupestres) (holotype SPF!, isotype K!, HUEFS!). Perennial, caespitose herb cm tall. Rhizome short, light-brown roots. Leaves rosulate, flat, ( ) cm, linear-lanceolate, membranous, delicate, multinerved, in vivo erect to bent, glaucous-green when young, changing to light brown, apex acute to acuminate, sheath slightly wider mm, pubescent in both surface, more densely on the adaxial surface. Trichomes on the leaves, spathes and scapes of two different types always together: filamentous, multicellular, delicate, white, long (ca. 0.5 mm) in greater number; or capitate, multicellular, apical cell globose, glandular. Spathe cm, external face pubescent, with capitate and filamentous trichomes, the last ones bigger in size and number, internal face with rare filamentous trichomes, operculum with apex oblique, 3- lacerate, teeth acuminate and involute. Scapes few per plant, delicate (10.5) cm long, slightly larger than the leaves, 3-costate, ribs slightly evident, pubescent, filamentous trichomes larger and with larger basal cell than the capitate trichomes. The scape, from the base to the middle, with filamentous trichomes much more abundant than capitate trichomes, from the middle to the lower 2/3 of the upper part, the trichome types occur in equal frequency, while the apical 1/3 of the upper half of the scape bears many more capitate than filamentous trichomes. Capitulum elliptic-globose, cm. Receptacle flat, scarcely hairy. Involucral bracts in 4 ranks, all of them elliptic-lanceolate with acute apex, the external ones ca. 1.2 mm long and the internal ones c mm long, ciliate from the middle to apex, dorsal surface with few filamentous and capitate trichomes, shorter than the 20

29 cilia, ventral surface glabrous. Floral bracts hyaline, ca. 2.5 mm long, same size as the flowers, oblong-spathulate, apex obtuse, ciliate along the upper 1/3, dorsal surface with rare filamentous and capitate trichomes, ventral surface glabrous. Flowers trimerous, staminate and pistillate flowers mixed on the capitulum. In one capitulum of the collection Giulietti 1360 there were 46 staminate flowers and 36 pistillate flowers. Staminate flower zygomorphic, ca. 2.5 mm long, with pedicel ca. 0.9 mm; sepals 3, ca.1.6 mm long, united at base, the two posterior-lateral sepals carinate and the anterior sepal flat, apex obtuse, involute, ciliate, dorsal surface with rare trichomes on apical portion; corolla funnel-shaped, 3-lobed, lobes triangular obtuse, erect, slight larger than the calyx; short anthophore at the base of the corolla; stamens 3, anthers basifixed, filaments flattened, free from the corolla, pistillodes 3, free, filiform. Pistillate flower zygomorphic ca. 2.5 mm long, pedicel ca. 0.6 mm; sepals 3, ca. 2.0 mm long., free, the two posterior-lateral carinate with apex acute, ciliate at apex, the anterior sepal concave, apex acute, slight ciliate at apex, dorsal surface with few trichomes, ventral surface glabrous, petals free, linear-ovate, flattened, ca.1.8 mm long, slight ciliate at apex, annulus between corolla and gynoecium pilose; gynoecium ca. 2.0 mm long, ovary ca. 0.4 mm long, stylar column up to nectiferous branches ca. 0.9 mm long, the nectiferous branches ca. 3.0 mm long, filiform-cylindrical, the column up to the stigmatic branches ca. 3.0 mm long, cylindrical, stigmatic branches ca. 0.3 mm long, exserted. Loculicidal capsule, in general producing 3 seeds per fruit; seeds ca. 0.5 mm, with striate testa. Distribution and habitat: So far only known in the southern part of the Chapada Diamantina in Bahia in altitudes above to 1300 m, usually m in the Campo Rupestre vegetation, and in the shade of large quartzitic boulders. This is the only species of Leiothrix living in this habitat, which is a preferential habitat for small plants of Paepalanthus, previous included in the genus Blastocaulon (Ruhland 1903: 223) Andrade et al. (2011). The species was collected between the Pico das Almas, in Rio de Contas Municipiality to Serra da Tromba in Catolés, Abaíra Municipality. Ule 7299 is referred to Serra do Sincorá without a precise locality. Etymology: The specific epithet is named in honour of Dr Raymond Mervyn Harley, Honorary Research Fellow at the Royal Botanic Gardens, Kew and Visiting Professor of the Post Graduate programme in Botany, at the State University of Feira de Santana, for his great contribution to our knowledge of the Flora of Bahia and Brazilian Lamiaceae. 21

30 Conservation status: This species is so far only known from a small area on the top of the hills in Pico das Almas and Catolés. The total area of occupancy is less than 500 km². Therefore, the species is here considered as Endangered A3c; B2ab(iii) (IUCN 2001). Additional specimens examined (paratypes): BRAZIL. Rio de Contas, Pico das Almas, 30 October 1988, Harley et al (SPF!, K!); 27 March 1998, Giulietti & Scatena 1360 (HUEFS!, K!); S W, m, trail to Pico das Almas, Juchum et al. 99, 19 January 2000 (HUEFS!,2 exs.); between the Campo do Queiroz to the top of the hill, 13º 31`S 41º59`W, 17 April 2001, Harley et al (HUEFS!, K!); S W, between Campo do Queiroz and the top of the hill, campo rupestre, 1794 m, Giulietti et al. 2102, 22 May 2002 (HUEFS!); 13º 31`S 41º57`W, 1523 m, Andrade et al. 449, 4 August 2003 (HUEFS!, K!); S W, 1807 m, Araújo 95, 10 April 2004; S W, 1807 m, Araújo 89, 10 June 2004; S W, 1745 m, Araújo & Cruz 119, 16 December 2004 (HUEFS!); S W, 1460 m, Harley et al , 20 August 2007 (HUEFS!, K!). Rio de Contas, on the way from Boa Vista to Mutuca Corisco, near to Bicota, 1325m, S W, campo rupestre, Ganev 2196, 2 September Rio de Contas, Kaiambola, Serra da Mesa, S W, campo rupestre, Giulietti et al. 2406, 19 April 2003 (HUEFS!). Abaíra: Catolés, Pico do Barbado, m, Giulietti et al. 1432, 15 August 1998 (HUEFS!). Serra da Tromba, nascente do Rio de Contas, 13º 16`S 41º 47`W, 18 December 1992, 1500 m, Ganev 1690 (HUEFS!, K!, SPF!). Serra do Sincorá. In Felsenschluchten Serra Sincorá, 1300 m, Ule 7299, November 1906 (HBG!, K!). Leiothrix raymondii occur sympatrically with L. angustifolia, L. schlechtendalii, L. distichoclada and L. flavescens (Pico das Almas and Catolés), but the others beside L. raymondii occur at much lower altitude (to 1500 m) over open sandy humid soils. Also those species have a wider distribution from Rio de Contas and Catolés up to the Sincorá Mountain in Mucugê, Andaraí, and Lençóis. Leiothrix angustifolia and L. schlechtendalii go up to Morro do Chapéu and Jacobina, from where the type materials of these species were collected: L. angustifolia between Jacobina and Vila Nova, Blanchet 3820 (holotype Herb. Martius BR!; isotypes B!, BM!, BR!, F!, G![3exs.], M!, P![2exs.]); L. schlechtendalii Near Jacobina, Blanchet 3818, holotype B!, isotypes BM!, BR!, G[3 exs.], NY!, P![2 exs.]) 22

31 Giulietti & Parra (1995) in the Flora of the Pico das Almas, refer the specimens CFCR 6927 and Harley as L. schlechtendalii but a new analysis confirmed both as L. raymondii. According the light cream color of the capitulum L. raymondii is similar to some species of Syngonanthus as the capitulum in Leiothrix is usually light to dark brown. ACKNOWLEDGMENTS We would like to thank to the keepers of the Herbarium HUEFS, Dr. Luciano Paganucci de Queiroz, and of the Herbarium K, Dr. David Simpson who facilitated study of the collections. To Dr Raymond Harley for the revision of the English. To Carla Lima for the drawn of the species. To the Brazilian Research Council (CNPq) for a productivity grant to A.M.Giulietti. To CNPq and FAPESB for funding through the following projects: Flora of Bahia (FAPESB APR 162/2007; CNPq Proc / and /2012), POALES (proc. processo nº /2008-8) and REFLORA (Proc /2010-5). This work is part of the first author s MSc dissertation in the Botany Graduate Program (PPGBot-UEFS). REFERENCES Andrade, M.J.G., Giulietti, A.M., Rapini, A., Queiroz, L.P., Conceição, A.S., Almeida, P.R.M. & van den Berg. C. (2010) Comprehensive phylogenetic analysis of Eriocaulaceae: Evidence from nuclear (ITS) and plastid (psba-trnh and trnl-f) DNA sequences. Taxon 59: Andrade, M.J.G., Giulietti, A.M., Harley, R.M. & van den Berg. C. (2011) Blastocaulon (Eriocaulaceae), a synonym of Paepalanthus: Morphological and molecular evidence. Taxon 60: Bongard, A.G.H. (1831) Essai monographique sur les espèces d Eriocaulon du Brésil. Mémoires de l'académie Imperiale des Sciences de St.-Pétersbourg. Sixième Série. Sciences Mathématiques, Physiques et Naturelles 1: Giulietti, A. M Eriocaulaceae. In: Harley, R. M. & Simmons, N. A. (ed.) Florula of Mucugê, Chapada Diamantina, Bahia, Brazil. Royal Botanic Gardens, Kew, pp

32 Giulietti, A.M Leiothrix da Bahia, Brasil. Sitientibus.15: Giulietti, A.M. & Hensold, N. (1990) Padrões de distribuição geográfica dos gêneros de Eriocaulaceae. Acta Botanica Brasilica 4: Giulietti, A. M. & Parra, L. R Eriocaulaceae. In. Stannard, B. L. (ed.). Flora of the Pico das Almas, Chapada Diamantina, Bahia, Brazil. Royal Botanic Gardens, Kew. pp Giulietti, A.M., Amaral, M.C. & Bittrich, V. (1995) Phylogenetic analysis of inter and infrageneric relationship of Leiothrix Ruhland (Eriocaulaceae). Kew Bulletin 52: Giulietti, A.M., Sano, P.T., Costa, F.N., Parra, L.R., Echternacht, L., Tissot-Squalli, M.L., Trovó, M., Watanabe, M. T. C., Freitas, M. P. & Hensold, N. (2010) Eriocaulaceae In: Forzza, R. et al. (eds). Catálogo de Plantas e Fungos do Brasil. Jardim Botanico do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro v.2: pp Giulietti, A.M., Andrade, M.J.G., Scatena, V. L., Trovó, M., Coan, A.I., Sano, P.T., Santos, F.A.R., Borges, R.L.B. & van den Berg, C. (2012) Molecular phylogeny, morphology and their implications for the taxonomy of Eriocaulaceae. Rodriguesia 63:1-19. Herzog, Th. (1924) Neue südamerikanische Eriocaulonaceae. Fedde Repertorium Species Novarum 20: IUCN. (2001) IUCN Red List Categories and Criteria: Version 3.1. IUCN Species Survival Commission. IUCN, Gland, Switzerland & Cambridge, UK, 70 pp. Körnicke, F. (1863) Eriocaulaceae. In: Martius, C.F.P. von, Flora Brasiliensis. Volume 3(1/2). R. Oldenbourg, Munich and Leipzig, pp Martius, K.F.P. (1834) Les Eriocaulées considérées comme une famille distincte. Annales des Sciences Naturelles; Botanique, sér. 2, 2:

33 Miranda, E. B. & Giulietti, A. M. (2001). Eriocaulaceae no Morro do Pai Inácio (Palmeiras) e Serra da Chapadinha (Lençóis), Chapada Diamantina, Bahia, Brasil. Sitientibus Série Ciências Biológicas 1: Moldenke, H. W. (1980) Eriocaulaceae. In Harley, R. M. & Mayo, S. (eds.). Towards a checklist of the Flora da Bahia. Royal Botanic Gardens, Kew. 250 p. Parra, L.R., Giulietti, A.M., Andrade, M.J.G. & van den Berg, C. (2010) Reestablishment and new circumscription of Comanthera (Eriocaulaceae). Taxon 59(4): Ruhland, W. (1903) Eriocaulaceae. In: Engler, A. (ed.), Das Pflanzenreich IV. 30 (Heft 13). Wilhelm Engelmann, Leipzig, 294 pp. Saint-Hilaire, A. (1833) Voyage dans le District des Diamants et sur le littoral du Brésil. 2 vol. Librairie Gide, Paris, 456 pp. Smith, L. (1937) A new genus of Eriocaulaceae. Contributions from the Gray Herbarium of Harvard University.117:36. Wikström, J.E. (1820) Trenne nya Arter af Örtslägtet Eriocaulon. Kongl Vetenskaps Akademiens Handlingar 1:

34 FIGURE 1. Leiothrix raymondii (drawn from Giulietti & Scatena 1360, by Carla Lima). A. Habit; B. Spathe and scape; C. Detail of spathe apex; D. Detail of leaf base; E-F. External and median involucral bracts, dorsal surface; G-H. Internal involucral bracts, dorsal and ventral surfaces; I-J. Floral bract, dorsal and ventral surfaces; K-P. Staminate flower, K. Complete flower and floral bract, L.M. Complete flower, N. Infundibuliform corolla, O. Open corolla showing stamens and pistillodes, P. Stamen with basifixed anthers; Q- T. Pistillate flower, Q. Complete flower and floral bract, R. Sepal, S. Flower with one sepal removed; T. Gynoecium. 26

35 CAPÍTULO II FILOGENIA, BIOGEOGRAFIA E DIVERSIFICAÇÃO DE LEIOTHRIX RUHLAND (ERIOCAULACEAE) 27

36 Resumo. Leiothrix é um gênero de Eriocaulaceae com a maior diversidade concentrada nos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço no Brasil, onde Eriocaulaceae é uma das famílias mais diversas. A maioria das espécies são microendêmicas e grande parte considerada em perigo de extinção devido a perda de hábitat. Estudos filogenéticos morfológicos e moleculares de Eriocaulaceae tem indicado Leiothrix como um gênero monofilético, muito bem sustentado, tendo, na maioria das análises, Syngonanthus como grupo irmão. É apresentado o estudo filogenético de Leiothrix, utilizando uma amostragem significativa do mesmo, visando testar o monofiletismo do gênero e de seus prováveis subgêneros. As análises moleculares foram conduzidas para 31 espécies do gênero e baseadas em marcadores nucleares (ITS e ETS) e plastidiais (trnl-trnf, psba-trnh e rpl32-trnl), usando parcimônia e inferência Bayesiana. Leiothrix foi confirmado como uma linhagem monofilética, suportada por sinapomorfias moleculares e morfológicas. Dentro de Leiothrix apenas L. subg. Stephanophyllum sensu Ruhland emergiu como monofilético. Dois clados aparecem como irmãos, um restrito a Cadeia do Espinhaço da Bahia, ao qual se agrupam também as populações dessas espécies de outras localidades, e o outro com as espécies de Minas Gerais, ao qual se agregou as espécies do Maciço do Itatiaia. Em análise de reconstrução dos caracteres ancestrais o Clado A e o Clado B apresentaram estados de caráter apomóficos não exclusivos, sendo que o Clado A concentra um número maior de estados plesiomóficos que o Clado B. Uma datação molecular foi realizada para Eriocaulaceae, onde foi recuperada a idade de 69 milhões de anos (m.a.) para o início da diversificação da família. Uma segunda datação foi realizada, específica para Leiothrix e associada à análise de distribuição das áreas ancestrais. Esta análise mostrou que o ancestral de Leiothrix teria surgido no sudoeste da Chapada Diamantina e no norte do Espinhaço Mineiro, há cerca de 23 m.a., onde sofreu um processo de vicariacia que resultou em duas populações isoladas, uma na Chapada Diamantina e outra na Serra do Cipó, com a linhagem de Minas Gerais iniciando primeiro o processo diversificação e a maioria das espécies atuais surgiram no Pleistoceno. Palavras chave: Cadeia do Espinhaço; campo rupestre; Comanthera; diversificação; Syngonanthus. Abstract. Leiothrix is a genus of Eriocaulaceae with the diversity concentrated in the savannas in the Espinhaço Range in Brazil, where Eriocaulaceae is one of the most diverse families. The majority of the species are microendemics, and are threatened with extinction due to habitat loss. Previous morphological and molecular phylogenies of Eriocaulaceae have indicated Leiothrix as a monophyletic, well supported genus with Syngonanthus as a sister group. Thus the present study, using a broad and comprehensive sampling, aimed to test the monophyly of the genus and their putative subgenera. Molecular analyses were based on plastid (trnl-trnf, psba-trnh e rpl32-trnl) and nuclear (ITS an ETS) markers using parsimony and Bayesian inference were conducted on 31species belonging to the ingroup. Leiothrix was confirmed as a monophyletic lineage supported by strong molecular and morphological synapomorphies. Within Leiothrix only L. subg. Stephanophyllum sensu Ruhland emerge as monophyletic. Two clades appeared to be sisters, one restricted to the Espinhaço Range in Bahia state, with the association of the populations of these species outside of Bahia, and the other to the Espinhaço Range in Minas Gerais state and the species of the Itatiaia Macif. The reconstruction analysis of ancestral characters highlight the Clade A and Clade B and both presented non exclusive apomorphic character states. Clade A concentrate a great number of plesiomorphic states than Clade B, according to existence of these character states in outgroup. A first molecular dating for Eriocaulaceae have been done. It indicated 69 Mya for the beginning of the family diversification. A second dating, now for Leiothrix, related to distribution analysis of ancestral areas, pointed out the genus ancestral have raised up at c. 23 Mya in both south-west of Chapada Diamantina and North of Espinhaço Range where it has suffered a vicariant process that originated two isolated populations: (I) at Chapada Diamantina and (II) at Serra do Cipó. The lineage at Minas Gerais initiated firstly the diversification process and the most of current species raised up in Pleistocene. Keywords: Comanthera; diversification; Espinhaço Range; Syngonanthus; savanna. 28

37 INTRODUÇÃO Eriocaulaceae é uma família de plantas monocotiledôneas facilmente reconhecidas por suas inflorescencias capituliformes. A família é sub- a pantropical, com o gênero Eriocaulon L. ocorrendo nos cinco continentes, enquanto Mesanthemum Korn., o outro gênero de Eriocauloideae, é restrito ao continente africano. Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae tem Paepalanthus Mart. e Syngonanthus Ruhland ocorrendo disjuntamente nas Américas e África. Lachnocaulon Kunth é restrito à América do Norte. Actinocephalus (Wikstr.) Sano, Comanthera L.B.Sm. emend. L.R.Parra & Giul., Leiothrix Ruhland, Rondonanthus Herzog e Tonina Aubl. são endêmicos da América do Sul. O principal centro de diversidade da família está no Brasil, nos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço, nos estados de Minas Gerais e Bahia, com cerca de 500 espécies (Giulietti et al, 2010). Ruhland (1903) ao propor Leiothrix, incluiu 27 espécies, sendo formado por espécies antes colocadas em Paepalanthus Mart. e classificadas por Körnicke (1863) em quatro subgêneros: Paepalanthus subg. Lophophyllum Körn. (uma espécie), P. subg. Psilocalyx Körn. (3), P. subg. Trichocalyx Körn. (12) e P. subg. Stephanophyllum Guill. (5), e descreveu seis novas espécies. Ruhland (1903) caracterizou o gênero Leiothrix como tendo hábito terrestre ou raramente aquático, flores estaminadas com corola gamopétala ou raramente dialipétala, tricomas do perianto liso e de ápice agudo, e flores pistiladas com o gineceu com uma coluna formada pelo três estiletes de forma crasso-triangular a 3-alado, e ramos do estilete (nectarífero e estigmático) separando em diferentes níveis. O autor separou as espécies de Leiothrix em cinco subgêneros: 1. Leiothrix subg. Rheocaulon Ruhland com uma espécie: L. fluitans (Mart.) Ruhland, a única espécie aquática do gênero, e com corola dialipétala em ambos os tipos de flores. A espécie foi removida de Paepalanthus subg. Lophophyllum Körn. A única outra espécie incluída nesse subgenero foi Paepalanthus capillaceus Klotzsch [=Rondonanthus capillaceus (Klotzsch) Hensold & Giulietti (1991)], também uma planta aquática, com corola dialipétala em ambos os tipos de flores. 29

38 2. Leiothrix subg. Eleutherandra Ruhland foi proposto incluindo três espécies terrestres, com corola dialipétala em ambos os tipos de flores, sendo o hábito, a única característica que o difere de L. subg. Rheocaulon. 3. Leiothrix subg. Calycocephalus Ruhland incluiu 15 espécies, com corola gamopétala na flor estaminada e corola dialipétala na flor pistilada, e sem proliferação a partir do capítulo. Esse subgênero foi formado a partir de espécies de Paepalanthus subg. Psilocalyx Körn., incluindo três espécies e caracterizado por Körnicke (1863) pelo capítulo glabro ou levemente piloso, e flores estaminadas com o tubo da corola unido até o meio e lobos involutos, e P. subg. Trichocalyx Körn. incluindo 12 espécies e distinto do subgênero anterior por suas espécies apresentarem capítulo com brácteas involucrais pilosas externamente. Ruhland (1903) reconheceu em L. subg. Calycocephalus duas seções: Leiothrix sect. Glabrae Ruhland (Psilocalyx pr.p.) e L. sect.. Piliferae Ruhland (Trichocalyx pr.p.). 4. Leiothrix subg. Stephanophyllum (Guill.) Ruhland foi proposto para incluir oito espécies, com flores estaminadas com corola gamopétala, e com proliferação a partir do capítulo (pseudoviviparidade, de acordo com Coelho et al. 2006, 2008). 5. Leiothrix subg. Psilanthus Ruhland foi proposto para incluir apenas Leiothrix arechavaletae Ruhland do Uruguay, com capítulo sem bráctea floral. Essa espécie foi transferida para Syngonanthus chrysanthus (Bong.) Ruhland (Giulietti em prep.). Em revisão para o gênero Giulietti (em prep.) reconhece apenas 38 espécies sulamericanas, com maior diversidade na Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais e na Bahia. Para este trabalho foi considerada esta circunscrição do gênero Giulietti et al. (1995) apresentou a primeira análise cladística de Eriocaulaceae, baseada na análise de 29 caracteres morfológicos para oito gêneros. Leiothrix foi recuperado como monofilético, com alto suporte, tendo Syngonanthus como seu grupo irmão, com as seguintes sinapomorfias: presença de flavonas em vez de flavonois, tricomas florais sem parede esculpida e apêndices nectaríferos com papilas insignificantes no ápice. No mesmo estudo foi apresentada análise cladística de Leiothrix, baseada em 33 espécies e utilizando 47 caracters morfológicos. A classificação infragenérica proposta por Ruhland (1903) não foi recuperada na topologia obtida e apenas Leiothrix subg. Stephanophyllum apareceu como monofilético, pela presença obrigatória de brotamentos vegetativos. No cladograma 30

39 apresentado é visível a posição das espécies da Chapada Diamantina formam um clado, exceto por L. flavescens e L. distichoclada (Apêndice 6). Andrade (2007), Andrade et al. (2010); Giulietti et al. (2012a) e Trovó et al. (2013) apresentaram analises filogenéticas no nível genérico baseadas em dados moleculares. Em todos os trabalhos é evidente o monofiletismo de Leiothrix dentro de Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae, apesar de poucas espécies do gênero terem sido utilizadas nessas análises. O único subgênero sustentado como monofilético no estudo de Andrade et al. (2010) foi L. subg. Stephanophyllum e as espécies de Leiothrix se organizam em um clado de Minas Gerais e outro da Bahia. No presente estudo tendo como amostragem a maioria das espécies de Leiothrix, foram utilizados marcadores plastidiais e nucleares para atender aos seguintes objetivos: (1) Testar o monofiletismo de Leiothrix; (2) Examinar as relações filogenéticas dentro de Leiothrix para testar os subgêneros propostos por Ruhland (1903); (3) Inferir a biogeografia histórica de Leiothrix na América do Sul, especialmente na Cadeia do Espinhaço, no Brasil. 31

40 MATERIAIS E MÉTODOS Amostragem Para o estudo filogenético de Leiothrix foram utilizadas 30 espécies, algumas delas com mais de um terminal, visando uma boa representatividade geográfica e intraespecífica, e mais três espécies dos gêneros Comanthera, Rondonanthus e Syngonanthus constituindo o grupo externo, totalizando 37 terminais na análise. As espécies utilizadas para o grupo externo foram selecionadas tomando como base a filogenia realizada para a família em Andrade et al. (2010). No Apêndice 1 pode-se consultar as espécies utilizadas com seus respectivos materiais testemunho. Extração, Amplificação e Sequenciamento de DNA O DNA foi extraído a partir de folhas e escapos desidratados em sílica-gel ou de material herborizado, utilizando o protocolo 2x CTAB (brometo de cetilmetil amônio) de Doyle & Doyle (1987) modificado para microtubos, com purificação com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Para amostras de difícil extração foi utilizado o kit DNeasy Plant Mini (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. A concentração do DNA extraído foi estimada no gel de agarose a 1%, a partir do padrão de banda do marcador Lambda Hind III, usando o programa Kodak 1D 3.6. Em estudos filogenéticos com dados moleculares podem ser usados dados do genoma plastidial (herança uniparental) e do genoma nuclear (herança biparental). No genoma de plastídios as regiões não codificantes são geralmente mais variáveis e, por isso, são mais indicadas para inferências filogenéticas em grupos de níveis taxonômicos menos inclusivos (Shaw et al., 2005, 2007). Do genoma nuclear, são utilizados mais comumente os espaçadores transcritos interno e externo (ITS e ETS) por apresentarem rápidas taxas de evolução se comparado ao genoma plastidial, refletindo-se diretamente em seu elevado nível de variabilidade (Calonje et al. 2009). Em busca de marcadores que fossem adequadamente variáveis para as espécies de Leiothrix, todos estes fatores foram considerados, e foram escolhidos os marcadores plastidiais trnl-trnf (Taberlet et al. 1991) e psba_trnh (Sang et al. 1997) e o marcador nuclear ITS (Sun et al. 1994), que mostraram-se bastante informativos em trabalhos anteriores (Andrade et al. 2010, 2011; Trovó et al. 2013). Além destes marcadores, 32

41 foram utilizados também ETS (ETS-Orchid, Monteiro 2007; 18S-IGS, Baldwin & Markos 1998) e rpl32-trnl (Shaw et al. 2007), nuclear e plastidial, respectivamente. Outras três regiões- trnd-t, trns-g e rps16-trnk- apontados por Shaw (2005, 2007) como potencialmente informativas foram testadas. No entanto, não foi possível incluí-las nas análises em função da dificuldade de amplificação ou sequenciamento. O DNA obtido foi amplificado através de reação em cadeia da DNA polimerase (PCR). Para o marcador rpl32-trnl a PCR foi realizada com 1x tampão (100 mm Tris-HCl), 0.2 mm dntp, 2,5 mm MgCl, 10 ng BSA, 2 unidades de Taq polimerase de DNA (Phoneutria), 0,75 unidades de primer (iniciador) e 1 a 2 µl de DNA (1:10), o volume da reação foi completado com água ultrapura para 20 µl. Para os demais marcadores foi utilizado o Kit de amplificação TopTaq (Quiagen), acrescentado de TBT-PAR (trehalose-based additive) (Samarakoon et al. 2013), além de 2% de BSA nas reações com marcadores de genoma nuclear. Na Tabela 1 constam os parâmetros utilizados nas PCR s que foram realizadas em termociclador GeneAmp System 9700 (Applied Biosystems). Os produtos da PCR foram quantificados através de eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio (5μg/mL) e visualizado em um transluminador de luz ultravioleta (UV), posteriormente foram purificados com PEG (Polietileno Glicol) e ressuspendidos com água ultrapura em volume de % da PCR, dependendo da concentração dos produtos da PCR. As amostras foram sequenciadas nas duas direções, com reações realizadas num volume final de 10µl, utilizando o Kit Big Dye terminator versão 3.1 (Applied Biosystems) e os mesmos primers da reação de amplificação, em sequenciador automático 3130XL DNA Analyzer (Applied Biosystems). Algumas sequências foram obtidas no GenBank acessado em todas elas geradas no trabalho de Andrade et al. (2010). 33

42 Tabela1. Relação de primers e os respectivos programas utilizados para amplificação do DNA neste trabalho. Primers Desnaturação Amplificação Nº ciclos na Amplificação Extensão Final ITS 1 17SE forward (ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG) 26SE Reverse (TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC) 94º (2 min) 94º (1 min) + 54º-58º (1 min) + 72º (1 min) 35 72º (5 min) 92 forward (AAGGTTTCCGTAGGTGAAC) 4 reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) ETS 2 ETS-Orchid forward (CATATGAGTTGTTGCGGACCWT) 18S-IGG reverse (AGACAAGCATATGACTACTGGCAGG) 94º (2 min) 94º (35 seg) + 52º (45 seg) + 72º (1:20 min) 35 72º (4 min) psba-trnh 3 PsbA forward (GTTATGCATGAACGTAATGCTC) TrnH reverse (CGCGAATGGTGGATTCACAAATC) 94º (1 min) 94º (30 seg) + 53º-54º (40 seg) + 72º (40 seg) 40 72º (5 min) trnl-trnf 4 C forward (CGAAATCGGTAGACGCTACG) F reverse (ATTTGAACTGGTGACACGAG) 94º (3 min) 94º (30 seg) + 55º (30 seg) + 72º (1 min) 30 72º (2 min) rpl32-trnl 5 F forward (CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC) (UAG) reverse (CTGCTTCCTAAGAGCGT) 80º (5 min) 91º (1 min) + 50º (1 min) + 65º (4 min) 30 65º (5 min) 1 Sun et al. 1994; 2-Beardsley & Olmstead 2002, Baldwin & Markos 1998; 3- Sang et al. 1997, Shaw et al. 2005; 4- Taberlet et al. 1991; 5-Shaw et al. 2007; 34

43 Edição das sequências e alinhamento das matrizes Os eletroferogramas foram editados no programa Staden Pacage (Staden et al. 1998) e as sequências obtidas foram submetidas ao BLASTn do NCBI (National Center for Biotechnology Information) ( Depois de editadas as sequencias foram alinhadas automaticamente no programa Muscle versão 3.6 (Edgar 2004) e posteriormente revisado manualmente no programa Mesquite2 (Maddison & Maddison 2007) seguindo as diretrizes de Kelchner (2000), as regiões ambíguas foram excluídas da análise. Análises filogenéticas Inicialmente cada conjunto de dados (região de DNA) foi analisado individualmente através do critério de Máxima Parcimônia (MP) no PAUP* (Phylogenetic analysis using parsimony) versão 4.0b10a (Swofford 2002). Também foi realizada uma análise com as regiões plastidiais combinadas. Nestas análises foram realizadas buscas heurísticas com replicações iniciadas com adições aleatórias de terminais, com rearranjos do tipo TBR (treebisection and reconnection) na árvore inicial, salvando até 15 árvores por replicação, evitando buscas extensivas em ilhas subótimas, e estabelecendo um limite de árvores. Os caracteres foram considerados não ordenados e com pesos iguais para todas as mudanças (Fitch 1971). O consenso estrito das árvores foi calculado e a sustentação dos clados avaliada através de bootstrap não paramétrico (Felsenstein 1985) com pseudo-replicações a partir de adição simples de terminais e rearranjos TBR, retendo 15 árvores por replicação. Testes de homogeneidade de partição (Incongruence-lenght difference test ILD) (Farris & al. 1994), para verificar a congruência entre os dados, foram realizados no PAUP através de buscas heurísticas a partir de 500 replicações e 10 adições randômicas de sequências. Foi testada a congruência entre as duas regiões nucleares e entre as três regiões plastidiais par a par. O teste de congruência também foi realizado entre os conjuntos de dados dos dois genomas, sendo realizados testes tanto com a matriz completa, quanto utilizando apenas os caracteres variáveis. Não foram detectadas incongruências em nenhuma das possibilidades testadas para o conjunto de dados utilizado. Modelos evolutivos para cada partição foram estimados no programa JModelTest (Darriba et al. 2012) utilizando o Critério de Informação de Akaike (AIC). Os modelos evolutivos que se adequaram melhor às regiões nucleares foram TPM2uf+G para a região 35

44 ETS, GTR+I para o espaçador ITS1, TIM3+G para o espaçador ITS2, TrNef+I para o gene 5.8S. Para as regiões plastidiais os modelos evolutivos selecionados foram TPM1uf+I+G para o PsbA-trnH, para o trnl-trnf foi TPM1uf+G tanto para o espaçador quanto para o gene, e o modelo TVM+G mostrou-se mais adequado para o marcador rlp32-trnl. As análises de Máxima Verossimilhança foram realizadas no programa PhyML 3.0 (Guidon et al. 2010) para cada região individualmente e para as regiões combinadas, utilizando o modelo gerado pelo JModeltest (Darriba et al. 2012) para cada matriz e o algoritmo SPR. A Inferência Bayesiana foi realizada no programa MrBayes (Ronquist & Huelsenbeck 2003) com de gerações, salvando uma árvore a cada gerações para as regiões plastidiais e análises combinadas e de gerações salvando uma árvore a cada gerações para as regiões nucleares, em duas corridas simultâneas, com quatro cadeias cada, três quentes e uma fria. As árvores precedentes à convergência entre as corridas (desvio padrão das frequências entre as corridas < 0,01) foram descartadas (burn-in). As árvores restantes foram utilizadas para construir o consenso de maioria das duas corridas, com Probabilidade Posterior (PP) de cada clado indicada pela frequência dele no conjunto de árvores. A otimização dos comprimentos de ramos foi do tipo ACCTRAN (Accelerated transformation). Foram considerados clados bem sustentados apenas os que apresentaram valores de PP igual ou superior a 95%, correspondendo a valores de bootstrap em torno de 70% na parcimônia (Alfaro et al. 2003), visto que, os valores de PP geralmente são inflados como mostrado por Simmons et al. (2004). Foram realizadas análises para cada região individualmente, combinada de plastídios e combinada de plastídios e nucleares, sendo que nesta última análise foram incluídas todas as espécies que apresentavam sequências para, pelo menos, uma região nuclear e duas regiões plastidiais. Nas análises combinadas, os dados de cada região foram particionados e para cada um deles aplicado o modelo evolutivo mais adequado. Eles foram analisados em conjunto, mas desligados entre si, de modo que os parâmetros foram estabelecidos individualmente para cada uma das regiões (Ronquist & Huelsenbeck 2003). 36

45 Reconstrução de estados ancestrais de caracteres Para a análise de reconstrução dos caracteres ancestrais, foram selecionados 28 caracteres morfológicos a partir de dados incluídos em Giulietti (1984) e complementados pela análise de materiais herborizados, levantados para os 30 táxons de Leiothrix utilizados na filogenia molecular e para as espécies componentes do grupo externo (Apêndice 3), gerando uma matriz de dados morfológicos (Apêndice 4). A evolução dos caracteres morfológicos foi examinada no programa Mesquite (Madisson & Maddison 2007) utilizando o critério de máxima parcimônia segundo a optimização ACCTRAN, utilizando como base a árvore de consenso dos dados plastidiais obtida na Inferência Bayesiana. Na análise de reconstrução dos estados de caracteres ancestrais, os dados obtidos foram relacionados com a classificação de Leiothrix por Ruhland (1903). Datação de Eriocaulaceae e do gênero Leiothrix Em função da escassez de fósseis em monocotiledôneas, especialmente em Poales, foi utilizada para datação de Eriocaulaceae a idade proposta por Janssen & Bremer (2004) para a família, obtida através de sequências da região plastidial rbcl. Para os autores, Eriocaulaceae teria divergido de Xyridaceae há cerca de 105 m.a., e a diversificação de Eriocaulaceae foi estimada em 58 m.a. A partir dos dados propostos por Janssen & Bremer (2004), foi realizada uma datação secundária para Eriocaulaceae a partir de uma matriz de sequências de trnl-trnf (que foi utilizada em Giulietti et al. 2012ª, cedida pelos autores) com 74 táxons, incluindo representantes de todos os gêneros de Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae, Actinocephalus (AC), Comanthera (CM), Lachnocaulon (LC), Leiothrix (LT), Paepalanthus (PP), Rondonanthus (RO), Syngonanthus (SY) e Tonina (TO), e Eriocaulon (ER) representando Eriocaulaceae subf. Eriocauloideae. Apenas Mesanthemum não foi utilizado na análise. A essa matriz foram adicionados táxons de Xyridaceae e Bromeliaceae, como grupo externo. Todas as sequencias de Xyridaceae e Bromeliaceae foram obtidas através do GenBank. Xyridaceae: Xyris sp. (DQ189009), Xyris sp. (DQ ); e Bromeliaceae: Tillandsia viridiflora (AY614188), Tillandsia espinosae (HQ88276), Tillandsia dodsonii (HQ882758) e Quesnelia quesneliana (HQ882755). A análise foi realizada no programa BEAST v (Drummond & Rambaut 2007), usando o modelo de substituição nucleotídica GTR, com distribuição gamma e sítios 37

46 invariantes (GTR + I + G), o modelo de relógio molecular relaxado lognormal não correlacionado e, uma árvore anterior com modelo de especiação de Yule. Para calibrar a árvore foi utilizada a idade do grupo Eriocaulaceae + Xyridaceae (crown group), estimado por Janssen & Bremer (2004) em 105 milhões de anos. As corridas foram realizadas para 15 milhões de gerações, com uma hipótese salva a cada 1000 gerações. O aplicativo TRACER (Drummound & Rambaut 2007) foi utilizado para visualizar os arquivos de saída da corrida. O resultado da corrida foi sumarizado em uma árvore de máxima probabilidade posterior dos clados, no módulo Tree Annotator do BEAST, e o cladograma foi visualizado e editado no FigTree v (Rambaut 2009). Para Leiothrix foi realizada uma análise no BEAST v (Drummond & Rambaut 2007) usando o modelo de substituição nucleotídica GTR, com distribuição gamma e sítios invariantes (GTR + I + G), o modelo de relógio molecular relaxado lognormal não correlacionado e, uma árvore anterior com modelo de especiação de Yule. A análise foi calibrada com a idade obtida neste trabalho para o nó Comanthera + Leiothrix, com a realização de corridas para 20 milhões de gerações, salvando uma hipótese para cada 1000 gerações. Foi utilizado o aplicativo TRACER (Drummound & Rambaut 2007) para visualizar os arquivos de saída da corrida. Os resultados foram sumarizados em uma árvore de máxima probabilidade posterior dos clados, no módulo Tree Annotator do BEAST, o cladograma foi visualizado e editado no FigTree v (Rambaut 2009). Para esta análise foram utilizadas as regiões de DNA plastidial trnl-trnf e psba-trnh e de DNA nuclear ITS, numa matriz reduzida com 22 táxons já utilizados na filogenia de Leiothrix (ver filogenia, Figura 7), e mais três espécies de Comanthera, com sequências obtidas no Genbank para cada região, respectivamente trnl-trnf, psba-trnh e ITS: C. vernonioides (EU924499, EU924423, EU924343), C. hatschbachii (EU924493, EU924416, EU924341) e C. aciphylla (EU924491, EU924414, EU924339). Biogeografia histórica Para a análise de Biogeografia histórica, foram pré-estabelecidas oito áreas biogeográficas para Leiothrix, com base nos padrões de distribuição e no endemismo: Área A (Montanhas amazônicas e tepuis da Venezuela); 38

47 Área B (Costa atlântica)- distribuída do estado da Paraíba até o Rio Grande do Sul, relacionada com a vegetação do tipo restinga; Área C (Nordeste da Chapada Diamantina)- com os limites desde os municípios de Jacobina e Morro do Chapéu até o vale do Rio de Contas; Área D (Sudoeste da Chapada Diamantina)- com os limites incluindo as serras dos municípios de Piatã e Abaíra até Rio de Contas; Área E (Norte do Espinhaço mineiro)- com os limites incluindo desde os arredores de Grão Mogol até o Planalto de Diamantina em Minas Gerais; Área F (Espinhaço meridional)- incluindo a Serra do Cipó e serras dos arredores; Área G (Serras do sul do Espinhaço mineiro e do sul de Minas Gerais)- tendo como limites a Serra do Caraça até o sul de Minas Gerais próximo à divisa com o Rio de Janeiro; Área H (Montanhas do Sudeste e Sul)- tendo como limites o Maciço do Itatiaia (nos limites entre Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro) até as Serras do Mar e Geral em São Paulo, Paraná e Santa Catarina. A reconstrução biogeográfica foi realizada a partir de análise estatística de dispersãovicariância usando o Programa S-DIVA-RASP (Yu et al. 2010, 2011), onde foi estabelecido o máximo de quatro áreas ancestrais e calculada a incerteza das hipóteses de ancestralidade a partir do conjunto de árvores geradas após a convergência das duas corridas na Inferência Bayesiana na análise de datação de Leiothrix, que foi calibrada na idade do nó Leiothrix + Comanthera, 41 m.a. (desvio de 16 m.a.), obtida na datação de Eriocaulaceae. Para essa análise foi utilizada uma matriz reduzida para 25 terminais, com sequências para três regiões de DNA (trnl-trnf, psba-trnh e ITS). A opção por essa análise foi a amostragem para mais regiões de DNA, e especialmente porque as espécies incluídas na análise são representativas para toda a variabilidade do gênero, tanto em relação à morfologia como em relação à distribuição geográfica. As frequências ancestrais reconstruídas foram descritas em cada nó da árvore. 39

48 RESULTADOS Foram obtidos materiais genéticos de 30 das 38 espécies de Leiothrix. Para algumas espécies foi extraído DNA de mais de uma amostra (Apêndices 1 e 2). A utilização dos terminais duplicados po espécie teve como objetivo abranger as categorias infragenéricas do gênero, as categorias infraespecíficas e a distribuição geográfica das espécies. As espécies Leiothrix argentea Silveira de Diamantina (MG), L. beckii (Szyszylowicz) Ruhland do Pico de Itatiaia (RJ, MG, SP) e L. spiralis (Körn.) Ruhland e L. subulata Silveira, ambas da Serra do Cipó (MG), tiveram o DNA extraído, porém o mesmo não teve a qualidade necessária, mesmo depois de ter passado por vários processos de purificação. As espécies L. celiae Moldenke da Venezuela, L. glauca Silveira da Serra do Cipó, L. itacambirensis Silveira de Itacambira (MG) e L. tinguensis Herzog da Serra do Tinguá (BA) são espécies raras e conhecidas apenas do material tipo, e não foram recoletadas. Para a realização deste trabalho foram utilizadas 133 sequências, sendo três sequências de Leiothrix gomesii Silveira, cedidas por Dr. Lívia Echternacht, 26 sequências obtidas do GenBank, e geradas no trabalho de Andrade et al. (2010), e 104 sequências inéditas obtidas para este trabalho. Das cinco regiões de DNA utilizadas, as regiões do genoma nuclear mostraram-se mais difíceis para a obtenção de sequências. A região ITS apresentou amplificação extremamente difícil, e a região ETS foi de fácil amplificação, porém apresentou problemas durante o sequenciamento. As três regiões escolhidas do genoma plastidial (psbatrnh, TrnL_TrnF, rpl32-trnl) não apresentaram grandes dificuldades para amplificar, no entanto, foram mais difíceis de sequenciar, sobretudo, a região rpl32-trnl (Apêndice 2). Análises Filogenéticas Além das análises individuais de cada região (Figuras 1-5), foram realizadas duas análises combinadas: uma apenas com as regiões plastidiais, contendo todos os terminais, inclusive aqueles que têm ausência de sequências para alguma região (Figura 6); e a análise combinada com as regiões plastidiais mais as regiões nucleares, incluindo os terminais que apresentavam sequências para, pelo menos, duas regiões plastidiais e uma região nuclear (Figura 7). 40

49 Nas análises individuais, as regiões nucleares apresentaram proporcionalmente maior quantidade de caracteres variáveis e informativos para a parcimônia (Tabela 2). Em relação às regiões plastidiais, psba-trnh foi a que apresentou o número menor de caracteres variáveis e informativos para a parcimônia. Para quatro marcadores os indels foram considerados substituições nucleotídicas, sendo codificados apenas para a região rpl32-trnl. A Tabela 2 também mostra que as cinco regiões apresentaram baixos Índices de Homoplasia, e altos Índices de Retenção e Consistência, além de informações do número de caracteres obtidos, número de caracteres variáveis, número de caracteres informativos, quantidade de árvores retidas e comprimento das árvores. 41

50 Tabela 2. Características das matrizes e árvores mais parcimoniosas encontradas nas análises de Máxima Parcimônia individuais e combinadas. ITS ETS PsbA_TrnH TrnL_TrnF Rpl32_TrnL Combinada Plastidiais Combinada Plastidiais + Nucleares Nº de táxons Nº de caracteres Nº de caracteres variáveis Nº de caracteres informativos Nº de árvores obtidas Comprimento da árvore (L) Índice de consistência (CI) Índice de retenção (RI) 410 (45%) 190 (30%) 111 (16%) 229 (24%) 148 (20%) 475 (20%) (26%) 216 (25%) 105 (17%) 48 (7%) 98 (10%) 89 (11%) 224 (9,5%) 524 (14%)

51 Em todas as análises de DNA, individuais e combinadas, Leiothrix emerge como um grupo monofilético e bem sustentado. De modo geral, os resultados das análises individuais de Máxima Parcimônia com marcadores nucleares ITS e ETS apresentaram topologias melhor resolvidas e clados com suportes maiores, em relação às regiões plastidiais (Figuras 1 e 2). As análises com marcadores plastidiais geraram árvores pouco resolvidas e com baixo suporte para a maioria dos clados (Figuras 3, 4 e 5). Mesmo assim, em todas as análises é possível observar a presença de um clado bem sustentado formado pelas espécies de Minas Gerais, enquanto as demais espécies aparecem em uma politomia basal, emergindo como clado bem estruturado apenas na análise individual de ITS (Figura 1). Na análise de Inferência Bayesiana do ITS (Figura 1) é evidente a ocorrência de dois grandes clados com alto valor de suporte. O Clado A é formado pelas espécies endêmicas da porção mineira da Cadeia do Espinhaço e o Clado B é formado pelas espécies endêmicas da Chapada Diamantina na Bahia (Leiothrix angustifolia, L. distichoclada, L. raymondii, L. schlechtendalii), além de espécies de distribuição mais ampla, incluindo L. rufula, L. hirsuta e L. flavescens, analisados a partir dos espécimes coletados na Bahia, todas fazendo parte de Leiothrix subg. Calycocephalus (sensu Ruhland). No Clado A é possível observar dois outros clados bem sustentados: o Clado C formado apenas pelas espécies incluídas em Leiothrix subg. Stephanophyllum e o Clado D formado pelo restante das espécies incluídas em Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland. Para a região nuclear ETS (Figura 2) emerge o Clado A, onde Leiothrix fluitans (única espécie de L. subg. Rheocaulon sensu Ruhland) aparece como irmã do Clado C, formado apenas por espécies incluídas em Leiothrix subg. Stephanophyllum. Nas análises individuais das regiões plastidiais: rpl32-trnl (Figura 3), trnl-trnf (Figura 4) e psba-trnh (Figura 5), emerge apenas o Clado A com boa sustentação para as regiões rpl32- trnl e trnl-trnf, porém com baixo suporte na análise da região psba-trnh. O Clado B colapsa em todas as analises. Na análise de rpl32-trnl (Figura 3), aparecem incluídos no Clado A, os Clados C e D. O Clado C inclui apenas as espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum, enquanto o Clado D inclui espécies de L. subg. Calycocephalus sensu Ruhland de Minas Gerais, além de L. sclerophylla (L. subg. Eleutherandra). O Clado F inclui 43

52 os indivíduos de L. flavescens var. flavescens coletados na Bahia e em Santa Catarina, além de L. flavescens var. distichophylla coletada em Minas Gerais. Esse último táxon aparece associado a L. distichoclada da Bahia e ambos apresentam folhas dísticas. Na análise de trnl-trnf (Figura 4), aparecem novamente os Clados C e D. O Clado C tem a mesma configuração apresentada na análise anterior, mas o Clado D tem maior sustentação interna e L. sclerophylla não faz parte do clado. Na análise de psba-trnh (Figura 5), emerge apenas o Clado C com as espécies de L. subg. Stephanophyllum. 44

53 Figura 1. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região nuclear ITS. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Destacado em cinza o Clado A, formado pelas espécies de Minas Gerais. Destacado em vermelho o clado C, constituído por espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum, e em azul destacado o Clado D, constituído por espécie de Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland (ambos os clados se repetem nas demais análises). A seta indica clado que se repete em outras análises, mas que ficou com suporte abaixo do corte (PP = 92). 45

54 Figura 2. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região nuclear ETS. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Em cinza destacado o Clado A formado pelas espécies de Minas Gerais; destacado em vermelho o Clado C, constituído pelas espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum. Em laranja destacado Clado E (que se repete em outras análises) constituídas por espécies de Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland de ocorrência na Bahia. 46

55 Figura 3. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região plastidial rpl32-trnl. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Em cinza destacado o Clado A constituído por espécies de Minas Gerais. Em vermelho o clado C, constituído por espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum, e em azul destacado o Clado D, constituído por espécie de Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland (ambos os clados se repetem nas demais análises). 47

56 Figura 4. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região plastidial trnl-trnf. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Em cinza destacado o Clado A constituído por espécies de Minas Gerais. Em vermelho o clado C, constituído por espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum, e em azul destacado o Clado D, constituído por espécie de Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland (ambos os clados se repetem nas demais análises). 48

57 Figura 5. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da análise da região plastidial psba-trnh. Os valores acima dos ramos representam o suporte da IB. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95. Destacado em cinza o Clado A, formado pelas espécies de Minas Gerais. Destacado em vermelho o clado C, constituído por espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum. A seta indica clado que se repete em outras análises, mas que ficou com suporte abaixo do corte (PP = 92). 49

58 Na análise Combinada de Plastídios (Figura 6) os dois grandes Clados A e B emergem novamente, no entanto, apenas o Clado A apresenta valor de bootstrap 78% na Máxima Parcimônia (MP), acima do corte considerado que é bootstrap 75%, enquanto o Clado B apresenta baixo suporte. O Clado A é formado pelas espécies endêmicas da porção mineira da Cadeia do Espinhaço e L. argyroderma (com distribuição no Maciço de Itatiaia, no Bioma Mata Atlântica, na fronteira entre os estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo). Internamente, o Clado C é formado apenas pelas espécies de L. subg. Stephanophyllum. O Clado B é formado pelas espécies endêmicas da Chapada Diamantina na Bahia (Leiothrix angustifolia, L. distichoclada, L. raymondii, L. schlechtendalii), associadas às espécies de distribuição mais ampla, incluindo L. rufula coletada na Bahia, L. hirsuta coletada na Bahia e no litoral do Espírito Santo e L. flavescens coletada na Chapada Diamantina da Bahia, na Serra do Espinhaço em Minas Gerais e na Mata Atlântica em Santa Catarina e também, às espécies endêmicas das restingas do Nordeste (L. pilulifera e L. restingensis). Todas essas espécies estão incluídas em Leiothrix subg. Calycocephalus sensu Ruhland. Na análise de Máxima Verossimilhança (ML) os dois clados se mantém com suportes parecidos, no entanto, internamente os clados menores apresentam baixos suportes. A análise de Inferência Bayesiana (IB) gerou árvores, e a convergência entre as duas corridas foi atingida a partir da geração de um total de de gerações, sendo excluídas (burn-in) 1090 árvores de cada corrida. A árvore da Inferência Bayesiana tem topologia semelhante a da Máxima Verossimilhança, com o Clado A emergindo com suporte de 100 na probabilidade posterior (PP) e o Clado C também aparece bem sustentado (PP = 100). O Clado B, como nas análises individuais das regiões plastidiais, emerge com baixo suporte (PP = 54), tendo L. rufula como irmã das outras espécies. A análise combinada das regiões de DNA plastidial com as regiões de DNA nuclear (Figura 7), mesmo contendo um número menor de terminais, apresentou topologia bastante semelhante à análise de plastídios, no entanto, os dois grandes clados emergiram com alto suporte (100 para PP, ML e MP). O Clado A inclui apenas as espécies endêmicas do Espinhaço Mineiro (L. argyroderma não foi incluída na análise). O Clado C inclui apenas as espécies de L. subg. Stephanophyllum. As outras espécies mineiras aparecem distribuídas em três clados menores, porém bem sustentados. L. crassifolia (L. subg. Calycocephalus) aparece como irmã do grupo formado por L. gomesii e L. sclerophylla únicas espécies de L. subg. Eleutherandra. L. echinocephala (L. subg. Leiothrix) aparece novamente associada com L. 50

59 fluitans, única espécie de L. subg. Rheocaulon. L. curvifolia, L. longipes e L. plantago todas incluídas em L. subg. Calycocephalus formam um grupo bem sustentado. O Clado B inclui novamente as espécies de ocorrência na Chapada Diamantina da Bahia e as endêmicas da restinga do Nordeste. Internamente dois clados são evidentes e bem sustentados. Leiothrix flavescens de Minas Gerais e da Bahia se mantém no mesmo clado que L. distichophylla, repetindo resultado obtido na análise combinada de plastídeos. L. pilulifera se associa com L. schlechtendalii e com L. hirsuta coletadas na Bahia e no Espírito Santo. Dos subgêneros propostos por Ruhland (1903), apenas L. subg. Stephanophyllum se mantém, correspondendo exatamente com a análise Combinada de Plastídios. Na Inferência Bayesiana a estabilidade entre as duas corridas foi atingida a partir da geração de um total de , com a exclusão de 900 árvores (burn-in) somando as duas corridas e gerando árvores. 51

60 Figura 6. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana da Análise Combinada de Plastídios. Acima dos ramos estão os valores de Probabilidade Posterior e abaixo dos ramos estão os valores de bootstrap da Máxima Verossimilhança (ML) e da Máxima Parcimônia (MP), respectivamente. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95 e bootstrap 75. A seta indica clado que se repete em outras análises, mas que ficou com suporte abaixo do corte. As cores representam os subgêneros propostos por Ruhland (1903). 52

61 Figura 7. Árvore de consenso de maioria (50%) da Inferência Bayesiana (IB) da Combinada de Plastídios + Nucleares. Acima dos ramos estão os valores de Probabilidade Posterior e abaixo dos ramos estão os valores de bootstrap da Máxima Verossimilhança (ML) e da Máxima Parcimônia (MP), respectivamente. Apenas foram mostrados os suportes dos clados que apresentam PP 95 e bootstrap 75. As cores representam os subgêneros propostos por Ruhland (1903). 53

62 Reconstrução de caracteres ancestrais Na árvore da reconstrução ancestral (Figura 8) estão evidenciados dois grandes Clados A e B, e internamente vários pequenos clados, dos quais, serão considerados numa análise os Clados C-F, uma vez que apresentaram caracteres ou estados de caráter sinapomórficos (Apêndice 5). Para o Clado A e para o Clado B, foram detectados os surgimentos de inovações morfológicas, bem como, a retenção de caracteres plesiomórficos. A bráctea involucral interna do capítulo com ápice acuminado [caráter 11(2)] é um estado plesiomórfico que ocorre somente no Clado A, mas não em todas as espécies, sendo compartilhado com as espécies dos gêneros Syngonanthus e Rondonanthus (Apêndice 5A). O Clado C corresponde a Leiothrix subg. Stephanophyllum na classificação de Ruhland (1903) e apresenta uma sinapomorfia que é a ocorrência obrigatória de pseudoviviparidade [caráter 12(1,2)] (Apêndice 5B). Este tipo de propagação vegetativa pode ocorrer em poucas outras espécies de Leiothrix e mesmo em Rondonanthus. Porém, nestes casos os brotamentos ocorrem esporadicamente e, quando ocorrem, é apenas uma vez por capítulo. Diferentemente, os brotamentos da grande maioria das espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum ocorrem sucessivamente no mesmo indivíduo, variando de dois a cinco brotamentos a partir de um capítulo inicial. A ocorrência de bráctea floral com ápice acuminado [caráter 14(1)] é um estado apomórfico que ocorre em todas as espécies de Leiothrix subg. Stephanophyllum (Apêndice 5C), apesar de ocorrer paralelamente também, em outras espécies de Minas Gerais. Leiothrix subg. Rheocaulon segundo Ruhland (1903) inclui apenas L. fluitans, única espécie de hábito aquático no gênero. Morfologicamente, essa espécie compartilha exclusivamente com as espécies de Leiothrix subg. Eleutherandra (L. gomesii, L. argyroderma e L. sclerophylla), as pétalas livres nas flores estaminadas [caráter 19(1)] (Apêndice 5D). Em todas as análises moleculares essas espécies nunca formaram um agrupamento. Espécies de L. subg. Calycocephalus aparecem tanto no Clado A quanto no Clado B. Porém, o Clado B é inteiramente formado por espécies deste subgênero, enquanto no Clado A elas emergem formando um pequeno grupo, bem estruturado (Clado D), com exceção de L. crassifolia, L. echinocephala e L. sinuosa. No Clado D todas as espécies apresentam flores 54

63 pistiladas com simetria zigomorfa [caráter 21(1)] (Apêndice 5E). Esse mesmo estado de caráter aparece na maioria das espécies do Clado B. A maioria das espécies desses dois clados, compartilham também as flores estaminadas zigomorfas [caráter 15(1)] (Apêndice 5F). No Clado B esse conjunto de caracteres pode ser associado com filotaxia dística [caráter 1(1)], com capítulos contendo maior quantidade de flores pistiladas do que de flores estaminadas [caráter 13(1)] e com o ápice da espata truncado [caráter 6(2)], que ocorre apenas em L. fluitans entre as espécies de Minas Gerais, além de L. flavescens (Apêndice 5G-I). Outra característica marcante no Clado B é a presença de tricomas glandulares com células apicais globosas [caráter 5(1)], que ocorre em todas as espécies do clado, exceto em L. restingensis (Apêndice 5J). Porém, esta característica também é compartilhada por outras quatro espécies do Clado A: L. arrecta e L. rupestris incluídas em Leiothrix subg. Stephanophyllum e L. curvifolia e L. fulgida, incluídas em Leiothrix subg. Calycocephalus (Figura 9). 55

64 Figura 8. Cladograma da reconstrução ancestral de caracteres morfológicos. Caráter 11 (2) Ápice da bráctea involucral, acuminado; Caráter 12 (1) Pseudoviviparidade, 1x sempre; Caráter 12 (2) Pseudoviviparidade, 2 5x sempre; Caráter 14 (1) Ápice da bráctea floral, acuminado; Caráter 19 (1) Pétalas das flores estaminadas, livres. 56

65 Figura 9. Cladograma da reconstrução ancestral de caracteres morfológicos. Caráter 1 (1) Filotaxia, dística; Caráter 5 (1) Células apicais dos tricomas, globosas; Caráter 6 (2) Ápice da espata, truncado; Caráter 13 (1) Proporção flores estaminadas X flores pistiladas, < flores pistiladas; Caráter 15 (1) Simetria das flores estaminadas, zigomorfas; Caráter 21 (1) Simetria das flores pistiladas, zigomorfas. 57

66 Datação molecular de Eriocaulaceae Segundo a datação realizada neste trabalho, Eriocaulaceae divergiu de Xyridaceae há cerca de 93 m.a., e iniciou sua diversificação há 69 m.a. Tanto o tempo de divergência quanto o início da diversificação concordam com as idades estimadas por Janssen & Bremer (2004), 105 m.a. para a divergência da família e 58 m.a. para a diversificação, quando considerado o desvio utilizado (15 m.a.). Eriocaulaceae subf. Eriocauloideae e Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae divergiram há cerca de 67 m.a., porém, a maior diversificação genérica ocorreu nos últimos 30 m.a., e nesses gêneros, a nível específico, a diversificação ocorreu principalmente nos últimos 5 m.a. durante os períodos do Neogeno (Plioceno) e Quaternário (Pleistoceno). Em Eriocaulaceae subf. Eriocauloideae, Eriocaulon iniciou sua diversificação há quase 23 milhões de anos. Em Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae, Rondonanthus foi o primeiro gênero a divergir, há cerca de 49 m.a. Paepalanthus começou sua diversificação há cerca de 30 m.a., sendo constituído por duas linhagens, e configurando-se como um gênero polifilético. A primeira linhagem dentro de Paepalanthus surgiu há cerca de 22 m.a., compreendendo espécies atualmente incluídas em Paepalanthus, inclusive espécies anteriormente incluídas em Blastocaulon (Andrade et al. 2011) e em Actinocephalus. A outra linhagem de Paepalanthus começou a se diversificar há cerca de 19 m.a. e inclui espécies de Paepalanthus subg. Paepalanthus Mart. (PP), P. subg. Platycaulon (PL) e P. subg. Xeractis Mart. (PX). O ancestral de Tonina e Lachnocaulon divergiu do ancestral de Paepalanthus há cerca de 24 m.a, iniciando sua diversificação há 14 m.a., dando origem aos gêneros atuais Tonina e Lachnocaulon. Syngonanthus incluindo S. cujabensis (Philodice hoffmanseggii) começou sua diversificação há 27 m.a. A linhagem ancestral de Comanthera e Leiothrix divergiu há 41 m.a., porém, a diversificação dos dois gêneros ocorreu em idades diferentes. Leiothrix iniciou sua 58

67 diversificação há aproximadamente 25 m.a., dando origem a duas linhagens, a linhagem de Minas Gerais com cerca de 16 m.a. e a linhagem da Bahia com 9 m.a. Comanthera diversificou há cerca de 17,5 m.a., e os dois subgêneros tem diversificação com idades diferentes. Comanthera subg. Thysanocephalus Körn é mais antigo do que C. subg. Comanthera. Nesse último subgênero a diversificação das espécies de Minas Gerais, de cerca de 6 m.a., antecede a diversificação da linhagem da Bahia, com cerca de 2,5 m.a. 59

68 Figura 10. Cronograma de máxima credibilidade de clados de Eriocaulaceae baseada na região plastidial trnl-trnf, estimado do BEAST. Setas indicam os pontos de calibração. Asteriscos mostram clados com probabilidade posterior acima de 95% na Inferência Bayesiana. Barras azuis indicam os intervalos com 95% de credibilidade. CT= Cretácio Tardio, PA= Paleoceno, EO= Eoceno, OL= Oligoceno, MI= Mioceno, PI= Plioceno e PE= Pleistoceno. 60

69 Biogeografia histórica de Leiothrix Utilizando como base para Leiothrix as análises de datação do gênero e de reconstrução da distribuição ancestral, é possível inferir que o ancestral de Leiothrix surgiu há cerca de 23 m.a. na Cadeia do Espinhaço, e provavelmente ocupava as áreas das Serras de Rio de Contas, no sudoeste da Chapada Diamantina na Bahia (Área D), e o Espinhaço meridional, especialmente a Serra do Cipó em Minas Gerais (Área F) (Figura 11). A linhagem da Serra do Cipó teria iniciado sua diversificação há cerca de 13,7 m.a., porém não conseguiu se expandir além dos limites do Espinhaço mineiro, tendo alcançado o Planalto de Diamantina (base da Área E), e atingindo a região de Grão Mogol há cerca de 13,7 m.a. Durante a sua diversificação, essa linhagem mais antiga sofreu retrações mais recentes em sua distribuição, proporciando o surgimento de linhagens microendêmicas, nos campos rupestres, representadas atualmente por espécies como Leiothrix echinocephala, L. fulgida, L. rupestris e L. spergula. Essa linhagem inicial também se diversificou para o sul, alcançando os campos rupestres sobre canga, quartizitos, granitos e gnaisses, nas Serras do sul do Espinhaço mineiro e do sul de Minas Gerais (Área G), há cerca de 10 m.a., sendo representada atualmente, por exemplo, por L. gomesii, e atingindo as montanhas da região do Itatiaia (Área H), sendo representada por L. argyroderma. No entanto, a maioria das linhagens formadas manteve-se restritas às áreas da Serra do Cipó e arredores, o que reflete-se atualmente no elevado número de espécies microendêmicas dessa região (Figura 11). A população da linhagem ancestral de Leiothrix que ficou isolada ao bloco baiano da Cadeia do Espinhaço (Chapada Diamantina) começou a se diversificar posteriormente, em relação à linhagem mineira, há cerca de 9 m.a. Logo cedo, sofreu um evento de cladogênese que gerou duas linhagens diferentes, sendo que uma delas originou L. rufula e conseguiu ultrapassar os limites Norte Sul do Espinhaço, e a outra se manteve na Chapada Diamantina por mais tempo. Posteriormente, essa linhagem chegou até o limite norte da Chapada Diamantina que incluí as serras próximas de Jacobina. Cerca de 4 m.a. atrás, ocorreu mais um evento de cladogênese, possibilitando que populações dessas linhagens mais antigas, originassem linhagens que atualmente ou se mantiveram como espécies endêmicas da Chapada Diamantina, como por exemplo L. schlechtendalii e L. distichoclada ou conseguissem ultrapassar os limites dos campos rupestres da Chapada Diamantina, 61

70 distribuindo-se mais amplamente, e alcançando as restingas litorâneas, distribuindo-se para o norte (L. pilulifera) e para o sul (L. hirsuta). Também, possibilitaram uma distribuição ainda mais ampla, incluindo a Cadeia do Espinhaço na Bahia e Minas Gerias, áreas de restinga da Bahia até o Rio Grande do Sul (Área B), as montanhas do sudeste e sul (Área H) e atingindo a região amazônica (Área A). Esse padrão é representado apenas por L. flavescens, que ocupa toda a área de distribuição do gênero Leiothrix (Figura 11). 62

71 Figura 11. Datação e análise biogeográfica de Leiothrix. Cronograma consensual resultante da datação do gênero. Seta indica nó de calibração; Asteriscos indicam nós com sustentação > 95% na Inferência Bayesiana; Barras cinzas indicam intervalos com 95% de credibilidade para as idades; Pizzas representam a distribuição ancestral inferiida; Elipses indicam as áreas de distribuição atual; Círculo vermelho = vicariância; Círculo azul = dispersão. Achurado na escala geológica = Holoceno. Mapa delimita a distribuição das espécies atuais. 63

72 DISCUSSÃO Nos últimos anos alguns trabalhos têm sido publicados na família Eriocaulaceae, utilizando filogenia com base em dados moleculares. Esses estudos têm consistentemente utilizado as regiões plastidiais trnl-trnf e/ou psba-trnh, e a região nuclear ITS (Andrade et al. 2010, 2011; Giulietti et al. 2012a; Trovó et al. 2013). Os estudos de Leiothrix neste trabalho apresentaram duas inovações em relação aos anteriores, uma amostragem bastante representativa de espécies para o gênero e, o uso de duas novas regiões (rpl32-trnl e ETS) até o momento não testadas para a família. Contudo, esses novos marcadores apenas corroboraram os dados obtidos pelos marcadores tradicionalmente utilizados. Em todas as análises apresentadas, Leiothrix se apresenta como uma linhagem bem sustentada. Esse resultado corrobora dados obtidos anteriormente com filogenias moleculares (Andrade et al. 2010, Giulietti et al. 2012a, Trovó et al. 2013) e filogenias com dados morfológicos por Giulietti et al. (1995; 2000). Esses últimos trabalhos referem como principais sinapomorfias morfológicas do gênero, o gineceu com estiletes unidos em uma coluna, geralmente triangular, com os ramos das porções receptiva e nectarífera liberando-se em alturas diferentes, antera basifixa e semente com testa estriada. O gênero Leiothrix tem o centro de diversidade em Minas Gerais (Giulietti & Hensold 1990), onde ocorrem 32 espécies das 38 reconhecidas por Giulietti (em preparação). Essas espécies ocorrem nas montanhas da Cadeia do Espinhaço, associadas aos ecossistemas da vegetação de campos rupestres. A grande maioria das espécies tem distribuição endêmica restrita e várias espécies são raras (Giulietti & Pirani 1988, Giulietti & Hensold 1990, Giulietti et al. 2009). Essa situação está de acordo com outros gêneros de Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae como referido, por exemplo, para Paepalanthus subg. Xeractis (Hensold 1988, Echternacht et al. 2011) e Paepalanthus subg. Platycaulon (Tissot-Squalli 1997). Nesse trabalho, todas as espécies de Leiothrix de ocorrência em Minas Gerais estão incluídas no Clado A. A análise dessas espécies mostra que a maioria inclui plantas perenes, com caules rizomatosos eretos ou horizontais, de acordo com o padrão que ocorre em outros gêneros da família, com espécies terrestres dos campos rupestres, como em Paepalanthus subg. Xeractis e P. subg. Platycaulon (Hensold 1988, Tissot-Squalli 1997). Essa estratégia permite que essas espécies que ocorrem em ambiente de alta sazonalidade atravessem o período mais seco do 64

73 ano, permanecendo ou não as partes aéreas. Em Leiothrix as espécies com caule mais espessado são L. sclerophylla e L. gomesii, tendo sido comprovado para a primeira delas, crescimento secundário em espessura (Giulietti 1984) similar ao que ocorre em Comanthera subg. Comanthera, referida como tendo meristema de desenvolvimento secundário (STM) (Scatena et al citada como Syngonanthus sect. Eulepis). Leiothrix subg. Rheocaulon inclui apenas L. fluitans, que é a única espécie aquática do gênero, e apresenta várias autapomorfias como uma única nervura na folha e dois tipos de raízes, as basais absorventes e as adventícias fixadoras (Coan et al. 2002). As raízes fixadoras permitem que os caules das plantas fiquem presos ao substrato no meio da correnteza dos riachos, de forma muito similar às plantas de Rondonanthus capillaceus (Hensold & Giulietti 1991). Além do tipo de raiz, a presença de flores estaminadas com pétalas livres [Caráter 19(1)] aproxima morfologicamente as duas espécies, sendo esta proximidade o principal motivo da escolha de R. capillaceus para o grupo externo nas análises moleculares. Leiothrix subg. Eleutherandra incluiu segundo Ruhland (1903) apenas L. argyroderma e L. beckii do Maciço de Itatiaia e L. spiralis da Serra do Cipó. Segundo o autor, as características principais do subgênero são o habitat terrestre e a presença de pétalas livres nas flores estaminadas. Silveira (1928) acrescentou as seguintes espécies a Leiothrix subg. Eleutherandra: L. sclerophylla Silveira da Serra do Cipó e L. gomesii Silveira da Serra da Caraça (Minas Gerais). A presença de pétalas livres nas flores estaminadas [Caráter 19(1)] é compartilhada também com Leiothrix fluitans e Rondonanthus capillaceus, sendo essa uma característica rara em Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae (Ruhland 1903, Körnicke 1863, Giulietti et al. 1995). De acordo com Giulietti (1984), o material-tipo de L. spiralis é um espécime jovem, com capítulos apenas com botões estaminados. A autora acompanhou o desenvolvimento de plantas da espécie e verificou que as pétalas das flores estaminadas na antese são unidas em tubo [Caráter 19(0)], e que sempre há propagação vegetativa por pseudoviviparidade, tendo sido a espécie removida desse subgênero. Em todas as análises apresentadas nesse trabalho, as cinco espécies com pétalas livres nas flores estaminadas [Caráter 19(1)], se distribuíram em diferentes linhagens, não sendo justificado a manutenção de Leiothrix subg. Rheocaulon e L. subg. Eleutherandra, dentro do conceito proposto por Rhland (1903). 65

74 Guillemin (1837) descreveu Eriocaulon flagellare e mencionou que a espécie devido a presença de reprodução vegetativa no capítulo, poderia tratar-se de um novo gênero denominado Stephanophyllum. Körnicke (1863) reconheceu Paepalanthus subg. Stephanophyllum e descreveu mais quatro novas espécies no grupo. Ruhland (1903) reconheceu Leiothrix subg. Stephanophyllum e descreveu mais três espécies no grupo. Esse subgênero foi considerado por Körnicke (1863) e Ruhland (1903) como um grupo bastante distinto dentro da família, pelo tipo de reprodução vegetativa. Nesse trabalho sempre aparece incluído no Clado A, em um clado menor (Clado C), bem sustentado tanto na análise Combinada de Plastídio (100_100_--), quanto na análise Combinada de Plastídios e Nucleares (100_100_100). Esta linhagem possui como sinapomorfia a ocorrência obrigatória de pseudoviviparidade, com dois a cinco brotamentos sucessivos a partir de um capítulo inicial [Caráter 12(2)], exceto em L. flagellaris que apresenta apenas uma proliferação no capítulo [Caráter 12(1)], confirmando o que descrito por Giulietti et al. (1995). Outras características bastante marcadas em Leiothrix subg. Stephanophyllum, detectadas nesse trabalho são: 1. Brácteas involucrais internas do capítulo com ápice acuminado [Caráter 11(2)], que também aparece nas espécies não relacionadas: L. gomesii, L. echinocephala, L. graminea e L. plantago (Figura 8, Apêndice 5A). 2. Bráctea floral com ápice acuminado, que aparece também em L. crassifolia, L. echinocephala, L. graminea, L. linearis, L. fluitans e L. gomesii (Figura 8, Apêndice 5C). Portanto, Leiothrix subg. Stephanophyllum é um grupo monofilético sustentado por dados moleculares e morfológicos. Internamente, nas diversas análises, as espécies de L. subg. Stephanophyllum não se distribuem de forma similar. Na análise combinada de plastídio e nuclear, L. luxurians e L. prolifera aparecem relacionadas como irmãs das demais, enquanto na análise combinada de plastídio, aparecem três ramos sendo o primeiro formado por L. luxurians e L. prolifera. De acordo com Ruhland (1903) essas duas espécies são distintas das demais do subgênero por apresentarem os escapos densamente sericeo-pubescentes a alvo-viloso. O segundo ramo é formado por L. propinqua, L. arrecta e L. vivipara todas com mais de duas proliferações do capítulo, diferentemente do último ramo onde L. rupestris e L. spergula também apresentam mais de duas proliferações do capítulo [Caráter 12(2)], enquanto L. flagellaris apenas uma proliferação [Caráter 12(1)]. Na análise combinada de plastídios e nucleares as duas variedades de L. flagellaris aparecem como um pequeno grupo bem sustentado. A ocorrência de pseudoviviparidade obrigatória como definido por Coelho et al. (2006, 2008) para L. 66

75 vivipara e L. spiralis e também detalhado para L. flagellaris (Figueira & Del Sarto 2006) é exclusivo de L. subg. Stephanophyllum. Porém, em outras espécies do Clado A, como L. fluitans, L. longipes, L. plantago, L. sinuosa e L. fulgida pode ocorrer ocasionalmente, uma proliferação vegetativa a partir do capítulo, sendo formado apenas um brotamento por capítulo (Monteiro-Scanavacca & Mazzoni 1976, Giulietti 1978, 1984, 1987). Essa característica ocorre em outros gêneros de Eriocaulaceae, mas em poucas espécies de Eriocaulon e Paepalanthus (Giulietti 1987). Leiothrix subg. Calycocephalus como definido por Ruhland (1903) distingue-se de L. subg. Eleutherandra e L. subg. Rheocaulon por apresentar a flor estaminada com corola gamopétala, como ocorre também em L. subg. Stephanophyllum e destingue-se deste, por não possuir brotamento no capítulo. Esse subgênero foi formado a partir de Paepalanthus subg. Psilocalyx Körnicke (1863), sendo caracterizado por apresentar o capítulo quase glabro, formado apenas por P. crassifolius e P. nubigena e P. spiralis. As suas primeiras espécies foram incluídas por Ruhland (1903) em Leiothrix sect. Glabrae Ruhland e a última em L. subg. Eleutherandra (já discutido anteriormente). Scatena & Giulietti (1996) sinonimizaram L. nubigena em L. crassifolia. Leiothrix sect. Piliferae Ruhland (1903) foi descrita a partir das espécies anteriormente incluídas em Paepalanthus subg. Trichocalix Körnicke (1863), caracterizado por apresentar capítulos pilosos a pubescente. Em Leiothrix sect. Piliferae foram incluídas as 13 espécies restantes de L. subg. Calycocephalus. Leiothrix subg. Calycocephalus não emerge monofilético em qualquer das análises, por suas espécies aparecerem distribuídas tanto no Clado A (espécies de Minas Gerais), quanto no Clado B (espécies da Bahia), e no Clado A estarem associadas a espécies de outros subgêneros. No Clado A, Leiothrix crassifolia aparece relacionada com L. argyroderma na análise combinada de plastídios, e na análise combinada de plastídios mais nucleares, aparece relacionada com L. gomesii e L. sclerophylla, todas as espécies pertencentes a L. subg. Eleutherandra sensu Ruhland. Essas espécies também apresentam perianto glabro a glabrescente. Na análise combinada de plastídios e nucleares Leiothrix echinocephala aparece relacionada à L. fluitans, e na análise Combinada de Plastidios ela emerge associada à Leiothrix sinuosa, tendo L. fluitans como irmã. Essas três espécies compartilham flores pistiladas actinomorfas [Caráter 21(0)], diferente das demais espécies do subgênero inseridas no Clado A (Figura 9 e Apêndice 5E). As demais espécies de Minas Gerais, de Leiothrix subg. Calycocephalus: L. linearis, L. mucronata, L. fulgida, L. curvifolia, L. longipes, L. 67

76 graminea e L. plantago, formam um pequeno clado tendo como sinapomorfia as flores pistiladas zigomorfas [Caráter 21(1)], e a maioria das espécies apresenta flores estaminadas zigomorfas (exceto L. linearis) [Caráter 15(1)]. Esses estados de caráter surgem novamente no Clado B (Figura 9 e Apêndices 5E-F). O Clado B abriga as espécies da Bahia, todas incluídas em Leiothrix subg. Calycocephalus sect. Piliferae sensu Ruhland. As espécies desse clado são anuais e com ciclo de vida que geralmente coincide com o período das chuvas na Chapada Diamantina e no Leste do Brasil. A reprodução é essencialmente sexuada, com a produção de numerosas e pequenas sementes por capítulo, geralmente três sementes por flor (Giulietti 1984, 1996). É possível que essa estratégia reprodutiva e de dispersão seja a responsável pela distribuição dessas espécies que, geralmente, ocupam várias serras ao longo da Chapada Diamantina ou são disjuntas entre elas e as restingas (Giulietti & Pirani 1988; Giulietti & Hensold 1990). O Clado B não apresenta sinapomorfia morfológica exclusiva, porém, alguns caracteres ocorrem em várias espécies do clado, podendo ser considerados como estados de caráter diagnósticos. A filotaxia dística [Caráter 1(1)], por exemplo, teria surgido mais de uma vez neste clado, estando presente nas espécies L. hirsuta, L. distichoclada e L. schlechtendalii. A presença de maior quantidade de flores pistiladas que flores estaminadas por capítulo [Caráter 13(1)] é um estado de caráter apomórfico que surgiu no ancestral do Clado B, e posteriormente ocorreram reversões nos ancestrais de L. restingensis, L. pilulifera, L. schlechtendalii, L. distichoclada e L. raymondii. Células apicais dos tricomas com formato globoso [Caráter 5(1)] também é uma estado apomórfico que surgiu no ancestral do Clado B, sofrendo reversão em L. restingensis, sendo este caráter compartilhado com algumas espécies do clado de Minas Gerais (Clado A) L. arrecta e L. rupestre, pertencentes a L. subg. Stephanophyllum, e em L. curvifolia e L. fulgida, de L. subg. Calycocephalus. Flores estaminadas zigomorfas [Caráter 15(1)] é um sinapomorfia do Clado B. Este estado de caráter surgiu no ancestral do Clado B, porém também surgiu no Clado A, nos ancestrais de L. spergula (L. subg. Stephanophyllum) e nas espécies de Minas Gerais de L. subg. Calycocephalus (Clado D) com reversão em L. linearis. Leiothrix rufula aparece como espécie irmã das demais espécies do Clado B, tanto na análise Combinada de Plastídio quanto na análise Combinada de Plastídios + Nucleares. Essa espécie é a única no gênero em que há crescimento do receptáculo floral, elevando o fruto e as sementes muito acima das brácteas, o que facilita a dispersão, corroborando com uma dispersão mais ampla da espécie (Giulietti 1984). É possível observar que no Clado B as 68

77 espécies se agrupam em dois clados menores, um deles com L. flavescens, L. distichoclada e L. raymondii, e o outro com L. angustifolia, L. hirsuta, L. pilulifera, L. restingensis e L. schlechtendalii, porém, para esses clados, não foram encontradas sinapomorfias morfológicas. Giulietti et al.(1995) referem a ocorrência de células lobadas no clorênquima como sinapomorfia para o pequeno clado formado por L. hirsuta e L. schlechtendalii. Com base nos dados moleculares e morfológicos apresentados, é possível propor uma nova classificação para o gênero Leiothrix: 1- Como até o presente Leiothrix não tem espécie-tipo, designamos como tal Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland. A espécie foi escolhida por apresentar todos os caracteres utilizados na delimitação do gênero por Ruhland (1903) e por possuir a distribuição mais ampla do gênero, ocorrendo na Venezuela, Peru e vários estados do Brasil (Giulietti & Pirani 1988; Giulietti & Hensold 1990; Giulietti et al. 2010). 2- São reconhecidos dois subgêneros de Leiothrix: A) Leiothrix subg. Psilocalyx Körnicke, Flora brasiliensis 3(1): Comb. Nov. D.M.Silva & Giul. Espécie-tipo: Leiothrix flagellaris (Guill.) Ruhland, Das Pflanzenreich 13(IV.30): A espécie foi descrita por Guillemin (1837), que propôs a possibilidade desta ser representante de um novo gênero com o nome de Stephanophyllum. Paepalanthus subg. Lophophyllum Körnicke, Flora brasiliensis 3(1): pr.p. Syn.nov. Paepalanthus subg. Stephanophyllum (Guill.) Körnicke, Flora brasiliensis 3(1): Paepalanthus subg. Trichocalyx Körnicke, Flora brasiliensis 3(1): Leiothrix subg. Stephanophyllum (Guill.) Ruhland, Das Pflanzenreich 13(IV.30): Leiothrix subg. Calycocephalus Ruhland, Das Pflanzenreich 13(IV.30): pr.p. Leiothrix subg. Eleutherandra Ruhland Das Pflanzenreich 13(IV.30): nom. illeg. 69

78 Leiothrix subg. Rheocaulon Ruhland, Das Pflanzenreich 13(IV.30): nom. illeg. - Neste subgênero estão incuídas todas as espécies do clado mineiro que emergiram formando um grupo monofilético na filogenia. B) Leiothrix subg. Leiothrix Leiothrix subg. Calycocephalus Ruhland, Das Pflanzenreich 13(IV.30): pr.p., syn.nov. Espécie-tipo: Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland, Das Pflanzenreich 13(IV.30): Incluindo as espécies do Clado B, todas da Bahia, especialmente L. flavescens. Datação e diversificação de Eriocaulaceae Eriocaulaceae iniciou sua diversificação há cerca de 69 m.a., no Cretáceo Superior, e levou um longo tempo para diversificação dos gêneros atuais. Cerca de 20 m.a., no Eoceno, surgiram os ancestrais das duas subfamílias, Eriocaulaceae subf. Eriocauloideae e Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae. Eriocaulaceae subf. Paepalanthoideae começou a se diversificar no Eoceno, cerca de 49 m.a., com a linhagem ancestral de Rondonanthus se diferenciando da linhagem ancestral dos demais gêneros. Há cerca 45 m.a. esta última linhagem sofreu um evento de duplicação originando duas linhagens, sendo uma ancestral de Comanthera e Leiothrix e a outra ancestral dos gêneros Sygonanthus, Lachnocaulon, Tonina e Paepalanthus. Essa última linhagem começou a se diversificar cerca de 5 m.a. mais tarde originando uma linhagem que deu origem ao gênero Syngonanthus, e a outra que deu origem aos gêneros Lachnocaulon, Tonina e Paepalanthus. O processo de diversificação mais intenso dessas linhagens ocorreu entre o Oligoceno e Mioceno (entre 30 m.a. e 6 m.a.), onde surgiram todos os gêneros atuais de Eriocaulaceae, sendo que a diversificação interna dos mesmos foi recente, datando do Plioceno e Pleistoceno (cerca de 5 m.a.). Hughes et al. (2013) consideram que as altas taxas de diversificação de espécies nos Neotrópicos ocorreu após o Mioceno Médio e Superior, e reflete a conjunção das mudanças climáticas e geológicas com o soerguimento dos Andes no Neógeno. Kress & Specht (2006) 70

79 utilizando metodologia similar a usada neste trabalho para a datação de Eriocaulaceae, consideram que Zingiberales divergiu das outras monocotileôneas há cerca de 124 m.a. com as linhagens em nível de famílias estabelecidas no Cretáceo Superior, e cada família divergindo durante o Terciário Inferior e Médio (entre 64 a 29 m.a.). Richardson et al. (2001) referem que, geralmente a diversidade de plantas da região neotropical é discutida em cima de duas hipóteses extremas: a primeira delas sugere uma diversificação mais antiga, com acúmulo constante de diversidade, em ambientes relativamente estáveis e com baixas taxas de extinção; e a segunda considera uma diversificação mais recente com altas taxas de especiação e de rotatividade de espécies. Os dados obtidos para Eriocaulaceae corroboram as hipóteses propostas por Richardson et al. (2001), onde a primeira hipótese pode ser aplicada para justificar a origem dos gêneros da família. A diversificação mais recente das espécies com altas taxas de especiação daria embasamento para a segunda hipótese. Biogeografia histórica de Leiothrix Segundo análise de dispersão e vicariância realizada no programa S-DIVA, a linhagem ancestral de Leiothrix teria vivido há cerca de 23 m.a. na Cadeia do Espinhaço, com abrangência desde o Sudoeste da Chapada Diamantina, nos arredores do Pico das Almas até a região da Serra do Cipó em Minas Gerais. Tais dados confirmam a hipótese proposta por Giulietti (1984), de que a Cadeia do Espinhaço seria o centro de diversidade do gênero. Os dados obtidos apontam a diversificação de Leiothrix em período mais antigo do que os resultados obtidos em estudos de diversificação para dicotiledôneas de ambientes abertos. Para Minaria (Apocynaceae Asclepiadoideae) a diversificação teria se iniciado há 4 m.a. em áreas de cerrado, passando posteriormente para os campos rupestres associado às fragmentações ocorridas durante o Pleistoceno (Ribeiro 2011). Simon et al. (2009) estudando linhagens de Leguminosae e Melastomataceae do cerrado estimam o início da diversificação para 10 m.a., porém, mais intensificada há 4 m.a., corroborando os dados de Minaria. Por outro lado, os dados de Leiothrix corroboram aqueles obtidos para o gênero Hoffmannseggella (Orchidaceae) apresentados por Antonelli et al. (2010). Para esses autores, Hoffmannseggella teve sua diversificação a partir do Mioceno Inferior com intensificação a partir de 4 m.a. atrás, principalmente após hibridizações causadas por expansões durante o Mioceno, provavelmente devido a uma resposta mais rápida das plantas dos campos rupestres 71

80 que as plantas do cerrado ao resfriamento do clima. Para Wolfe et al (1989) a divergência entre monocotiledôneas e eudicotiledôneas ocorreu há cerca de 200 m.a., enquanto as monocotiledôneas se diversificaram a partir do Cretáceo Inferior (Jansen & Bremer 2004). Um período tão longo decorrido desde a divergência dos dois grupos pode explicar taxas de diversificação diferenciada em diferentes linhagens. Kress & Specht (2006) estudaram gêneros de diferentes famílias de monocotiledôneas e a diversificação de gêneros ocorreu principalmente entre 110 e 80 m.a. Em Leiothrix, durante o Mioceno Inferior, cerca de 23 m.a. ocorreu um evento de isolamento geográfico, que separou as populações da Cadeia do Espinhaço nas áreas de Minas Gerais e da Bahia. As populações da porção mineira ficaram restritas à área da Serra do Cipó, iniciando a partir de cerca de 13,5 m.a. o processo de diversificação. Um evento de duplicação deu origem a duas linhagens independentes. A linhagem ancestral de L. crassifolia, L. gomesii e L. schlerophylla sofreu um evento de duplicação (cerca de 10 m.a.) originando L. crassifolia e uma linhagem que cerca de 3 m.a. depois, sofreu vicariância dando origem a L. gomesii e L. sclerophylla. A outra linhagem foi ancestral das demais espécies do clado de Minas Gerais. Esta linhagem conseguiu se dispersar para o norte, há cerca de 10 m.a., chegando até a área de Grão Mogol. Neste mesmo período, esta linhagem sofreu uma duplicação originando duas novas linhagens, uma delas que deu origem ao ancestral das espécies L. echinocephala e L. fluitans, e a outra que deu origem ao ancestral de Leiothrix subg. Stephanophyllum e ao ancestral das espécies associadas à L. curvifolia. Nesse grupo, é provável que houve evolução por paralelismo em relação às folhas que podem ser semi-cilíndricas ou achatadas. Situação similar é apresentado por Smidt et al. (2013) para espécies de Bulbophyllum sect. Micranthae (Orchidaceae). A linhagem da porção baiana da Cadeia do Espinhaço, iniciou sua diversificação posteriormente, e cerca de 9 m.a. atrás sofreu um evento de duplicação. Foi originado o ancestral de L. rufula e o ancestral de todas as demais espécies da Bahia. No início do Pleistoceno, com taxas mais baixas de diversificação, essa última linhagem evoluiu sem produzir grande número de espécies. A ocorrência de maior número de espécies de Leiothrix na parte mineira da Cadeia do Espinhaço pode estar relacionada com a topografia mais 72

81 contínua do Espinhaço mineiro, e consequentemente com maior extensão dos campos rupestres. Apesar do baixo número de espécies a linhagem da Bahia ocupou uma área geográfica mais ampla do que a linhagem de Minas Gerais, distribuindo-se especialmente nos ambientes de restingas litorâneas, disponíveis principalmente a partir de 2,5 m.a. A ocorrência de um padrão disjunto entre espécies da Chapada Diamantina e das restingas tem sido registrado para várias famílias de angiospermas (Giulietti & Pirani 1988; Harley 1988). Segundo Harley (1995), haveria semelhança entre o ambiente físico dos campos rupestres e das restingas, principalmente nos solos arenosos e com baixo teor de nutrientes, umidade atmosférica relativamente alta, altos níveis de insolação e flutuação diária de temperatura. Para esse autor, a distância de cerca de 250 km que separa a Chapada Diamantina do Oceano Atlântico ocupada com ambiente ecologicamente não propício para as espécies dos campos rupestres, por ser dominado especialmente por caatinga, poderia ser vencida através de sítios intermediários onde essas plantas poderiam encontrar condições favoráveis e vir a se estabelecer, propiciando que a partir do Pleistoceno, migrações entre campo rupestre e restinga poderiam ter sido possíveis. Uma hipótese alternativa para ocorrência de espécies com distribuição disjunta entre a Chapada Diamantina e a restinga é apresentada por Sano (1999), que justifica a ocorrência desse padrão de distribuição em Actinocephalus ramosus por dispersão de diásporos através dos rios que nascem na Chapada Diamantina e desembocam no Oceano Atlântico. As linhagens que alcançaram as restingas sofreram grande impacto devido aos movimentos transgressivos e regressivos do mar, que ocorreram de forma não uniforme ao longo da costa brasileira. Tal situação provavelmente promoveu a fragmentação dessas linhagens possibilitando a expansão de algumas para o norte ou para o sul, bem como a formação de espécies endêmicas da restinga. Em Leiothrix algumas espécies podem ser referidas como exemplo. L. rufula e L. hirsuta ocorrem em toda a extensão da Chapada Diamantina e em áreas de restinga situadas entre a Bahia e o Rio de Janeiro. L. pilulifera é endêmica das restingas do Nordeste e L. restingense é restrita as restingas entre Salvador e Valença. Consideração especial deve ser dada a L. flavescens, que ocupa as oito áreas de distribuição do gênero. Neste trabalho a espécie aparece como a de origem mais recente no clado baiano, havendo um tempo relativamente curto para explicar sua ampla distribuição. Sua migração para a restinga e para outras serras de Minas Gerais até o Paraná pode ser 73

82 justificada pelos mesmos mecanismos que ocorreram em outras espécies do gênero com distribuição similar. Mais difícil é explicar a disjunção da espécie nas regiões Nordeste e Sudeste do Brasil e nas montanhas da Amazônia, Venezuela, Peru e Guiana. Giulietti & Hensold (1991), reconheceram a grande variação fenotípica de L. flavescens, na qual sinonimizaram nove táxons, sendo quatro de Minas Gerais, um de São Paulo e quatro da Venezula. Reconheceram também quatro variedades, das quais duas endêmicas de Minas Gerais e uma endêmica de Bolívar, na Venezuela. Uma melhor análise dessa espécie não foi possível pela ausência de amostragem da espécie da região norte em associação àquelas da Bahia, Minas Gerais e Santa Catarina (Ver filogenia do gênero). Giulietti et al. (1995) encontraram posições bastante distintas para L. flavescens. No cladograma mais parcimonioso L. flavescens e L. polystemma (=L. flavescens var. polystemma) juntamente com L. gomesii e L. distichoclada aparecem como grupo irmão das outras espécies do gênero. Para os autores, a distribuição geográfica atual de L. flavescens, analisada a partir desse posicionamento, provavelmente refletiria uma distribuição pretérita mais ampla, talvez durante o Pleistoceno, a qual foi fragmentado posteriormente devido às mudanças climáticas. No cladograma um passo mais longo L. polystemma juntamente com L. gomesii e L. distichoclada permanecem como irmão das demais, mas L. flavescens tem posição bastante distinta e aparece associada à L. hirsuta, inseridas num pequeno clado constituído por espécies da Bahia. Esta última posição de L. flavescens, se assemelha ao obtido neste trabalho na filogenia molecular. Segundo Giulietti et al. (1995), como não há mecanismos na espécie que justifique a dispersão à longa distância, uma possibilidade seria a de que a espécie teria migrando gradativamente e não através de eventos de dispersão à longa distância. A compreensão da disjunção na distribuição dessa espécie requer novos estudos que envolvam as populações dos tepuis da Venezuela, associados com outras espécies de Eriocaulaceae e de outras famílias com padrão de distribuição similar. De acordo com Giulietti (em prep.), são reconhecidas 38 espécies de Leiothrix, das quais 25 são endêmicas da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais e quatro são endêmicas da Chapada Diamantina. Segundo Queiroz et al. (2009) a relação entre altas taxas de diversidade e alta taxa de endemismo constata uma diversificação local das espécies, como as da Cadeia do Espinhaço. Para Harley (1988), a fragmentação dos campos rupestres é um fator que está diretamente ligado aos altos índices de endemismo, uma vez que propiciaria uma distribuição insular ao longo das serras da Cadeia do Espinhaço, facilitando a especiação alopátrida devido 74

83 ao isolamento das populações nos topos dessas serras. É provável que processos recentes de isolamento reprodutivo e hibridação também contribuam para a diversidade encontrada nos campos rupestres, propiciando a ocorrência lado a lado de espécies recentes com espécies de origem mais antiga. A topografia e heterogeneidade dos solos, como proposto por Conceição et al. (2005), seriam responsáveis por criar microhabitats, favorecendo a diversificação in situ. Para Bitencourt & Rapini (2013) a principal hipótese para explicar as altas taxas de riqueza e endemismo na Cadeia do Espinhaço está baseada em ciclos sucessivos de expansão e retração dos campos rupestres orientados pelas oscilações climáticas no Pleistoceno. Para Leiothrix, a ocorrência de grande número de espécies endêmicas poderia ser explicada pelas hipóteses emitidas por Harley (1988), Conceição et al. (2005) e Bitencourt & Rapini (2013), e exemplos de espécies mais antigas convivendo simpatricamente com espécies mais recentes podem ser dados através da distribuição de L. rufula, L. crassifolia e L. flagellaris que ocorrem simpatricamente respectivamente com L. restingense, L. sclerophylla e L. vivipara. Alguns mecanismos também poderiam estar contribuíndo para justificar a alta taxa de endemismo no gênero. Andrade (2007), analisando os mecanismos de evolução cariotípica em Eriocaulaceae, detectou a ocorrência tanto de poliploidia quanto de disploidia. Pereira et al. (em prep.), analisando espécies microendêmicas do complexo Comanthera curralensis da Bahia com o uso de isoenzimas, detectaram a ocorrência de hibridização e introgressão entre essas espécies. Esses mesmos mecanismos evolutivos podem estar atuando na evolução das espécies de Leiothrix. 75

84 CONCLUSÕES Neste trabalho, Leiothrix emergiu como monofilético, corroborando análises cladísticas anteriores de dados morfológicos e moleculares. Na filogenia, o gênero divide-se em dois grandes clados com estruturação biogeográfica, um formado por espécie da Bahia associadas às espécies de ampla distribuição, e outro formado por espécies do Espinhaço Mineiro associadas às espécies do Maciço de Itatiaia. Estes clados apresentam sinapomorfias morfológicas, que corroboram com os resultados da filogenia. Dos subgêneros de Leiothrix propostos por Ruhland (1903), apenas Leiothrix subg. Sthephanophyllum é monofilético. Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland foi determinada como espécie-tipo do gênero, por apresentar todos os caracteres utilizados na delimitação do gênero por Ruhland (1903) e por possuir a distribuição mais ampla do gênero. Uma nova classificação infragenérica foi proposta para Leiothrix, reconhecendo dois subgêneros: Leiothrix subg. Leiothrix e Leiothrix subg. Psilocalyx (Koern) D. M. Silva & Giul. emend. Na datação molecular de Eriocaulaceae, foram recuperadas as idades de 93 m.a. para a divergência da família e de 69 m.a. para o início de sua diversificação. Para Leiothrix, a datação molecular recuperou a idade de 23 m.a. para o início de sua diversificação, com a formação de duas linhagens a partir de uma linhagem ancestral que ocorria desde o Sudoeste da Chapada Diamantina até a área da Serra do Cipó. Essas duas linhagens divergiram em idades diferentes, com a linhagem mineira iniciando sua diversificação primeiro, há cerca de 13,5 m.a., com a linhagem da Bahia iniciando a diversificação há 9 m.a. 76

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91 Doutorado. Departamento de Ciências Biológicas Universidade Estadula de Feira de Santan. Feira de Santana. Richardson, J. E; Pennington, R. T.; Pennington, T. D.; Hollingsworth, P. M Rapid diversification of a species-rich genus of neotropical rain forest trees. Science, 293: Ronquist, F.; Huelsenbeck, J.P., MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics, 19: Ruhland, W Eriocaulaceae. In: Engler, A. (ed.), Das Pflanzenreich Regni vegetabilis conspectus. Leipzig: Engelmann, Samarakoon, T.; Wang, S. Y.; Alford, M. H Enhancing PCR amplification of DNA from recalcitrant plant specimens using a trehalose-based additive. Applications in Plant Sciences, 1(1): Sang, T.; Crawford, D.J.; Stuessy, T.F Chloroplast phylogeny, reticulate evolution, and biogeography of Paeonia (Paeoniaceae). American Journal Botany, 84: Sano, P.T Revisão de Acticocephalus (Koern.) Sano Eriocaulaceae. Tese de Doutorado. Departamento de Ciências Biológicas Universidade de São Paulo. Sano, P.T Actinocephalus (Körn.) Sano (Paepalanthus sect. Actinocephalus), a new genus of Eriocaulaceae, and other taxonomic and nomenclatural changes involving Paepalanthus Mart. Taxon, (53): Scatena, V. L.; Giulietti, A. M The taxonomy and Morphological and anatomical differentiation of populations of Leiotrhix crassifolia (Bong.) Ruhland Eriocaulaceae. Plant Systematic and. Evolution, 199: Shaw, J.; Lickey, E.B.; Beck, J.T.; Farmer, S.B.; Liu, W.; Miller, J.; Siripun, K.C.; Winder, C.T.; Schilling, E.; Small, R.L The tortoise and the hare II: relative utility of 21 nonconding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis. American Journal of Botany. 92(1):

92 Shaw, J.; Beck, E.B.; Edward, E.; Schilling, E.; Small, R.L Comparison of whole choloplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III. American Journal of Botany. 94(3): Silveira, A.A. da Floralia Montium. Imprensa Oficial, Belo Horizonte Simon, M.F.; Grether, R.; Queiroz, L.P.; Skema,C.; Pennington, R.T.; Hughes, C.E Recent assembly of the Cerrado, a neotropical plant diversity hotspot, by in situ evolution of adaptations to fire. Proceeding of the National Academy of Science of the United States os America, 106 (48): Simmons, M.P., Specht, C.D., Vergara-Silva, F., Gandolfo, M., A phylogeny of the Monocots, as inferred from rbcl and atpa sequence variation, and a comparison of methods for calculating jackknife and bootstrap values. Systematic Botany, 29: Smidt, E.C.; Gallo, L.W.; Scatena, V.L Leaf anatomical and molecular studies in Bulbophyllum section Micranthae (Orchidaceae) and their implications for systematics. Brazilian Journal of Botany, 36(1): Smith, L.B A new genus of Eriocaulaceae. Contr. Gray Herb. 117: 38. Staden, R.; K. F. Beal; J. K. Bonfiel The Staden Package Methods In Molecular Biology 132: Sun, Y., Skinner, D.Z., Liang, G.H. & Hulbert, S.H Phylogenetic analysis of Sorghumand related taxa using internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Theor. Appl. Genetic, 89: Swofford, D.L PAUP* Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods) v.4 beta 10. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts, EUA Taberlet, P.; Gielly, L.; Pautou, G.; Bouvet, J.; Universal primers for amplification of three no-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology. 17: Tissot-Squalii, H.M.L Monographische Bearbeitung von Paepalanthus subgenus Platycaulon. Berlin, J. Cramer 84

93 Trovó, M.; Andrade, M.J.G.; Sano, P.T.; Ribeiro, P.L.; Berg, C.V.D Molecular phylogenetics and biogeography of Neotropical Paepalanthoideae with emphasis on Brazilian Paepalanthus (Eriocaulaceae). Botanical Journal of the Linnean Society, 171: Unwin, M. M Molecular Systematics of the Eriocaulaceae Martinov Dissertation. Department of Botany. Miami University. Oxford, Ohio. Yu, Y., Harris, A.J. & He, X.J. (2010) S-DIVA (Statistical Dispersal-Vicariance Analysis): A tool for inferring biogeographic histories. Molecular Phylogenetics and Evolution, 56: Yu, Y., Harris, A.J. & He, X.J. (2011) RASP (Reconstruct Ancestral State in Phylogenies, version 1.1. Available at: Wolfe, K.H.; Gouy, M.; Yang, Y.; Sharp, P.M Date of the monocot-dicot divergence estimated from chloroplast DNA sequence data. Proc. Nati. Academy Scince, 86:

94 APÊNDICES Apêndice1. Espécies de Leiothrix utilizadas no estudo filogenético e seus respectivos materiais testemunho, e inclusão nos subgêneros proposto por Ruhland (1903). Táxon Subgênero Voucher Coletor Local de coleta Leiothrix angustifolia (Körn.) Ruhland Calycocephalus HUEFS LP Queiroz Umburanas/BA Leiothix argyroderma Ruhland Eleutherandra HUEFS M Trovó 320 Piquete/SP Leiothrix arrecta Ruhland Stephanophyllum HUEFS AM Giulietti 2495 Santana do Riacho/MG Leiothrix crassifolia (Bong.) Ruhland Calycocephalus HUEFS MJG Andrade 516 Diamantina/MG Leiothrix curvifolia (Bong.) Ruhland var.curvifolia Calycocephalus HUEFS A Rapini 528 Congonhas do Norte/MG Leiothrix curvifolia var. lanuginosa (Bong.) Ruhland Calycocephalus HUEFS MJG Andrade 553 Datas/MG Leiothrix distichoclada Herzog Calycocephalus HUEFS D Mendes 23 Rio de Contas/BA Leiothrix echinocephala Ruhland Calycocephalus HUEFS E Guarçoni 752 Francisco Dumont/MG Leiothrix flagellaris (Ruhland) Giul var. flagellaris Stephanophyllum HUEFS FN Costa et al 1365 Datas/MG 86

95 Leiothrix flagellaris var. pedunculosa (Ruhland) Giul. Stephanophyllum HUEFS MJG Andrade 485 Grão Mogol/MG Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland var. flavescens Calycocephalus HUEFS MJG Andrade 440 Rio de Contas/BA Leiothrix flavescens var. distichophylla (Silveira) Giul. & Calycocephalus HUEFS MJG Andrade 506 Itacambira/MG Hensold Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland var. flavescens Calycocephalus AM Giulietti s/n Joinville/SC Leiothrix fluitans (Mart.) Ruhland Rheocaulon R Moura 66 Santana do Riacho/MG Leiothrix fulgida Ruhland Calycocephalus HUEFS MJG Andrade 512 Diamantina/MG Leiothrix gomesii Silveira Eleutherandra SPF L. Echternacht 1938 MG Leiothrix graminea (Bong.) Ruhland Calycocephalus AM Giulietti s/n Diamantina/MG Leiothrix hirsuta (Wikstr.) Ruhland Calycocephalus HUEFS EB Souza 984 Mucugê/BA Leiothrix hirsuta (Wikstr.) Ruhland Calycocephalus CVRD 9682 M Trovó 253 Linhares/ES Leiothrix linearis Silveira Calycocephalus HUEFS FF Coelho 9 Santana do Riacho/MG 87

96 Leiothrix longipes Silveira Calycocephalus HUEFS AM Giulietti 2505 Santana do Riacho/MG Leiothrix luxurians (Körn.) Ruhland Stephanophyllum FN Costa 1488 Diamantina/MG Leiothrix mucronata (Bong.) Giul. Calycocephalus HUEFS FF Coelho 12 Santana do Riacho/MG Leiothrix pilulifera (Körn.) Ruhland Calycocephalus HUEFS UCS Silva 204 Alagoas/AL Leiothrix plantago (Mart.) Giul. Calycocephalus NY M Trovó 216 Santana do Riacho/MG Leiothrix prolifera (Bong.) Ruhland Stephanophyllum HUEFS MJG Andrade 563 Tiradentes/MG Leiothrix propinqua (Körn.) Ruhland Stephanophyllum HUEFS FF Coelho 5 Serra do Cipó/MG Leiothrix raymondii Mendes & Giul. Calycocephalus HUEFS MJG Andrade 461 Rio de Contas/BA Leiothrix restingensis (Moldenke) Giul. Calycocephalus HUEFS AM Giulietti 2447 Mata de São João/BA Leiothrix rufula (A.St.Hil.) Ruhland Calycocephalus HUEFS AM Giulietti 2156 Morro do Chapéu/BA Leiothrix rupestris Giul. Stephanophyllum HUEFS AM Giulietti s/n Diamantina/MG 88

97 Leiothrix schlechtendalii (Körn.) Ruhland Calycocephalus HUEFS RP Oliveira 2040 Mucugê/BA Leiothrix sclerophylla Silveira Eleutherandra HUEFS M Trovó 200 Santana do Riacho/MG Leiothrix sinuosa Giul. Calycocephalus HUEFS AB Joly (CFSC 4636) Santana do Riacho/MG Leiothrix spergula Ruhland Stephanophyllum HUEFS MM Arbo 4295 Conceição do Mato Dentro/MG Leiothrix vivipara (Bong.) Ruhand Stephanophyllum HUEFS AM Giulietti 2503 Santana do Riacho/MG Comanthera curralensis (Moldenke) L.R. Parra & Giul. HUEFS MJG Andrade 595 Morro do Chapéu/BA Rondonanthus capillaceus (Klotzsch ex Körn.) Hensold & Giul. HUEFS CVD Berg 1792 Canaíma/Venezue la Syngonanthus caulescens (Poir.) Ruhland HUEFS MJG Andrade 452 Rio de Contas/BA 89

98 Apêndice 2. Informações dos vouchers das sequências de DNA utilizadas no estudo filogenético de Leiothrix. As informações estão organizadas das seguintes formas: Espécie, autor, país, estado, coletor e número de coleta (herbário), número de acesso Genbank para ITS, ETS, trnl-trnf, psba-trnh e rpl32-trnl, respectivamente. Asterisco (*) indica sequências geradas neste estudo. Leiothrix angustifolia (Körn.) Ruhland, Brasil, BA, LP Queiroz (HUEFS), EU924290, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothix argyroderma Ruhland, Brasil, SP, M Trovó 320 (HUEFS), *XX000000, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix arrecta Ruhland, Brasil, MG, AM Giulietti 2495 (HUEFS), EU924296, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix crassifolia (Bong.) Ruhland, Brasil, MG, MJG Andrade 516 (HUEFS), EU924292, --, EU924445, EU924366, *XX000000; Leiothrix curvifolia (Bong.) Giul. var. curvifolia, Brasil, MG, A Rapini 528 (HUEFS), --, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix curvifolia var. lanuginosa (Bong.) Ruhland, Brasil, MG, MJG Andrade 553 (HUEFS), EU924293, --, EU924446, EU924367, *XX000000; Leiothrix distichoclada Herzog, Brasil, BA, D Mendes 2, (HUEFS), EU924294, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix echinocephala Ruhland, Brasil, MG, E Guarçoni 752 (HUEFS), *XX000000, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix flagellaris (Giull.) Ruhland var. flagellaris, Brasil, MG, FN Costa et al (HUEFS), --, *XX000000, --, *XX000000, *XX000000; Leiothrix flagellaris var. pedunculosa (Ruhland) Giul., Brasil, MG, MJG Andrade 485 (HUEFS), EU924297, *XX000000, EU924450, EU924371, *XX000000; Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland var. flavescens, Brasil, BA, MJG Andrade 440 (HUEFS), EU924291, --, EU924444, EU924365, *XX000000; Leiothrix flavescens (Bong.) Ruhland var. flavescens, Brasil, SC, AM Giulietti s/n (HUEFS), --, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix flavescens var. distichophylla (Bong.) Ruhland, Brasil, MG, MJG Andrade 506 (HUEFS), --, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix fluitans (Mart.) Ruhland, Brasil, MG, R Moura 66, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix fulgida Ruhland, Brasil, MG, MGJ Andrade 512 (HUEFS), --, --, --, *XX000000, *XX000000; Leiothrix gomesii Silveira, Brasil, MG, L. Echternacht 1938 (SPF), XX (LV177), --, XX (LV177), XX (LV177), --; Leiothrix graminea (Bong.) Ruhland, Brasil, MG, AM Giulietti s/n (HUEFS), --, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix hirsuta (Wikstr.) 90

99 Ruhland, Brasil, BA, EB Souza 984 (HUEFS), *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix hirsuta (Wikstr.) Ruhland, Brasil, ES, M Trovó 253 (CVRD), --, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix linearis Silveira, Brasil, MG, FF Coelho 09 (HUEFS), --, --, *XX000000, *XX000000, --; Leiothrix longipes Silveira, Brasil, MG, AM Giulietti 2505 (HUEFS), *XX000000, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix luxurians (Körn.) Ruhland, Brasil, MG, FN Costa 1488, --, *XX000000, *XX000000, --, *XX000000; Leiothrix mucronata (Bong.) Giul. Brasil, MG, FF Coelho 12 (HUEFS), --, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix pilulifera (Körn.) Ruhland, Brasil, AL, UCS Silva 204 (HUEFS), --, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix plantago (Mart.) Giul., Brasil, MG, M Trovó 216 (NY), *XX000000, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix prolifera (Bong.) Ruhland, Brasil, MG, MJG Andrade 563 (HUEFS), *XX000000, --, *XX000000, --, *XX000000; Leiothrix propinqua (Körn.) Ruhland, Brasil, MG, FF Coelho 05 (HUEFS), --, *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix restingensis (Moldenke) Giul., Brasil, BA, AM Giulietti 2447 (HUEFS), --, --, *XX000000, *XX000000, --; Leiothrix rufula (A.St.Hil.) Ruhland, Brasil, BA, AM Giulietti 2156 (HUEFS), *XX000000, --, *XX000000, --, --; Leiothrix rupestris Giul., Brasil, MG, AM Giulietti s/n (HUEFS), --, --, *XX000000, *XX000000, --; Leiothrix schlechtendalii (Körn.) Ruhland, Brasil, BA, RP Oliveira 2040 (HUEFS), *XX000000, *XX000000, *XX000000, *XX000000, --; Leiothrix sclerophylla Silveira, Brasil, MG, M Trovó 200 (HUEFS), *XX000000, --, *XX000000, *XX000000, *XX000000; Leiothrix sinuosa Giul., Brasil, MG, AB Joly (CFSC) 4636 (HUEFS), --, --, *XX000000, --, *XX000000; Leiothrix spergula Ruhland, Brasil, MG, MM Arbo 4295 (HUEFS), --, --, --, *XX000000, --; Leiothrix raymondii Mendes & Giul., Brasil, BA, MJG Andrade 461 (HUEFS), EU924295, --, EU924448, *XX000000, --; Leiothrix vivipara (Bong.) Ruhand, Brasil, MG, AM Giulietti 2503 (HUEFS), EU924298, *XX000000, EU924451, EU924372, --; Comanthera curralensis (Moldenke) L.R. Parra & Giul., Brasil, BA, MJG Andrade 595 (HUEFS), EU924340, --, EU924492, *XX000000, --; Rondonanthus capillaceus (Klotzsch ex Körn.) Hensold & Giul., Brasil, BA, CVD Berg 1792 (HUEFS), EU924338, --, EU078716, *XX000000, --; Syngonanthus caulescens (Poir.) Ruhland, Brasil, BA, MJG Andrade 452 (HUEFS), EU924344, --, EU924500, *XX000000,

100 Apêndice 3. Lista de caracteres morfológicos com seus respectivos estados de caráter. 1. Filotaxia: (0) alterna; (1) distica. 2. Folha [Comprimento]: (0) Folhas <= Espata; (1) Folhas => Espata. 3. Bainha [Comprimento]: (0) bainha <= 1,5mm; (1) bainha => 1,5mm. 4. Folhas [Indumento da superfície adaxial]: (0) Pilosa; (1) Glabrescente ou glabro. 5. Tricomas [Célula apical]: (0) cônica; (1) globosa. 6. Espata [Ápice]: (0) agudo; (1) denteado; (2) truncado. 7. Escapo [Número de costelas]: (0) 0-4; (1) Brácteas involucrais externas [Comprimento em relação às brácteas internas]: (0) até 1½x da bráctea interna; (1) > 1½x da bráctea interna. 9. Brácteas involucrais externas [Indumento]: (0) ambas as faces; (1) apenas uma face. 10. Brácteas involucrais externas [Indumento da superfície abaxial]: (0) pilosa no ápice; (1) pilosa no meio e não no ápice; (2) glabro ou ciliado. 11. Bráctea involucral interna [Ápice]: (0) arredondado a obtuso; (1) agudo; (2) acuminado. 12. Pseudoviviparidade: (0) nunca; (1) 1x; (2) 2-5x; (3) 1x esporádico. 13. Flores estaminadas x flores pistiladas [Proporção]: (0) estaminadas > pistiladas; (1) estaminadas < pistiladas. 14. Bráctea floral [Ápice]: (0) obtuso a agudo; (1) acuminado. 15. Flores estaminadas [Simetria]: (0) actinomorfa; (1) zigomorfa. 16. Flores estaminadas [Fusão das sépalas]: (0) unidas até o meio; (1) livres; (2) unidas acima do meio. 17. Flores estaminadas [Indumento das sépalas]: (0) pilosa em ambas as faces; (1) pilosa em uma face; (2) glabra a ciliada. 18. Flores estaminadas [Antóforo]: (0) presente; (1) ausente. 19. Flores estaminadas [Fusão das pétalas]: (0) unidas; (1) livres. 20. Flores estaminadas [proporção comprimento sépalas x pétalas]: (0) sépalas > pétalas; (1) sépalas < pétalas. 21. Flores pistiladas [Simetria]: (0) actinomorfas; (1) zigomorfas. 92

101 22. Flores pistiladas [Indumento das sépalas]: (0) pilosa em ambas as superfícies; (1) pilosa em uma superfície; (2) glabra a ciliada. 23. Flores pistiladas [Indumento das pétalas]: (0) pilosa em ambas as faces; (1) pilosa em uma face; (2) glabra a ciliada. 24. Flores pistiladas [Anel de pelos entre sépalas e pétalas]: (0) ausente; (1) presente. 25. Flores pistiladas [Anel de pelos entre pétalas e ovário]: (0) ausente; (1) presente. 26. Flores pistiladas [Ramos do estilete]: (0) separando-se na mesma altura; (1) separando-se no terço inferior da coluna; (2) separando-se no terço médio da coluna; (3) separando-se no terço superior da coluna. 27. Flores pistiladas [Estigma]: (0) incluso; (1) exserto. 28. Semente: (0) não estriada; (1) estriada. 93

102 Apêndice 4. Matriz dos caracteres morfológicos de Leiothrix e das espécies utilizadas como grupo externo para reconstrução dos caracteres ancestrais. Leiothrix angustifolia L. argyroderma L. arrecta L. crassifolia L. curvifolia var. curvifolia L. curvifolia var. lanuginosa L. distichoclada L. echinocephala L. flagellaris var. flagellaris L. flagellaris var. pedunculosa L. flavescens var. flavescens L. flavescens var. distichophylla L. fluitans L. fulgida L. gomesii L. graminea ?11020? L. hirsuta L. linearis ??1 L. longipes L. luxurians L. mucronata L. pilulifera L. plantago

103 L. prolifera L. propinqua L. raymondii L. restingensis L. rufula L. rupestre L. schlechtendalii L. schlerophylla L. sinuosa L. spergula L. vivipara Comanthera curralensis Rondonanthus capillaceus ? Syngonanthus caulescens ?

104 Apêndice 5. Cladogramas individuais selecionados da reconstrução ancestral, para os caracteres morfológicos informativos. A Ápice da bráctea involucral interna do capítulo (Caráter 1); B Pseudoviviparidade (Caráter 12); C Ápice da bráctea floral (Caráter 14); D Fusão das pétalas das flores estaminadas (Caráter 19); E Simetria das flores pistiladas (Caráter 21); F - Simetria das flores estaminadas (Caráter 15); G Filotaxia (Caráter 1); H Proporção flores estaminadas X flores pistiladas (Caráter 13); I Ápice da espata (Caráter 6); J Células apicais dos tricomas glandulares (Caráter 5). A B 96

105 C D 97

106 E F 98

107 G H 99

108 I J 100

109 Apêndice 6. Cladograma do consenso estrito de Leiothrix apresentado por Giulietti et al. (1995), derivado dos dois cladograma mais parcimoniosos. representa uma apomorfia; = representa um paralelismo; x representa uma reversão; - representa um estado de caráter provavelmente plesiomórficos de Leiothrix, mas com diferentes estados nas três espécies de Syngonanthus usadas como grupo externo e codificado como? na matriz. Letras maiúsculas representam os nós. 101