Uso de peptídeo sintético em vacina contra Linfadenite Caseosa

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1 1 Uso de peptídeo sintético em vacina contra Linfadenite Caseosa Emily Lima Martins 1 (PROBIC/ Unit), emilymimy10@hotmail.com; Daniela Droppa-Almeida 2 (CAPES), danieladroppa@gmail.com; Glenda Amaral da Silva 1 (PIBIC/Fapitec), glendaamaral7@gmail.com; Afonso Celso Silva Dórea 3 (PROBIT/Unit), afonsosinho@hotmail.com; Elton Franceschi 4 (co-orientador), franceschi.elton@gmail.com; Francine Ferreira Padilha 2 (orientadora), fpadilha@yahoo.com. 1. Universidade Tiradentes/Enfermagem/Aracaju, SE. Instituto de Tecnologia e Pesquisa ITP, Laboratório de Biomateriais, Aracaju, Sergipe. 2. Universidade Tiradentes/Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial/Aracaju, SE. Instituto de Tecnologia e Pesquisa ITP, Laboratório de Biomateriais. 3. Universidade Tiradentes/Biomedicina/Aracaju, SE. Instituto de Tecnologia e Pesquisa ITP, Laboratório de Biomateriais. 4. Universidade Tiradentes/Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial/Aracaju, SE.Instituto de Tecnologia e Pesquisa ITP, Núcleo de estudos em Sistemas coloidais. Área: Imunologia; Medicina Veterinária; Imunologia Aplicada; Subárea: Medicina Veterinária preventiva; Especialidade: Doenças infecciosas em animais. RESUMO: A Linfadenite Caseosa (LC) é um enfermidade crônica e infectocontagiosa, ocasionada pela bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis e acomete ovinos e caprinos. Doença considerada cosmopolita estando presente em diversos países do mundo e apresenta alta prevalência nos rebanhos. Atualmente não existem medidas profiláticas eficazes para LC o que contribui para a disseminação da doença e perdas econômicas consideráveis para ovinocaprinocultura. Com isso o objetivo do trabalho é utilizar os adventos da biologia molecular e da bioinformática e buscar epítopos imunodominantes e obter um peptídeo sintético capaz de compor uma vacina peptídica eficaz contra LC. Para isso, análises de bioinformática foram feitas em três ferramentas de predição de epítopos imunodominantes de células B, baseados na proteína serina protease corinebacteriana. Após a obtenção dos epítopos, alinhamentos foram efetuados com intuito de analisar sequências repetidas nos três softwares. A sequência alvo foi determinada e denominada de peptídeo14. Testes em fêmeas da linhagem swiss foram realizados. Os animais foram vacinados em duas doses e desafiados após 60 dias a contar da dose inicial. A vacina baseada no peptídeo14 apresentou 20% de proteção dos animais, no entanto não houve diferenças estatísticas ao comparar com os grupos controles. O uso de peptídeos sintéticos na composição vacinal tem sido crescente e apresentam resultados satisfatórios, no entanto requer o uso de adjuvantes direcionados na ativação de PRR s presentes em células importantes na ativação da imunidade inata e adaptativa. Diante disso novos testes com diferentes adjuvantes são importantes para verificar de fato a imunogenicidade do peptídeo14. Palavras-chaves: Bioinformática, Epítopos imunodominantes, Corynebacterium pseudotuberculosis. INTRODUÇÃO A Linfadenite Caseosa (LC) é uma doença crônica, infectocontagiosa. O agente etiológico da LC é o Corynebacterium pseudotuberculosis (AYERS, 1977; BATEY, 1986a;1986b), bactéria caracterizada como gram-positiva, intracelular facultativa, pleiomórfica e imóvel (DORELLA et al., 2006) que acomete mamíferos em geral tendo maior prevalência em ovinos e caprinos. Doença caracterizada por lesões purulentas e formação de abcessos, no entanto a LC pode ser classificada

2 2 como LC superficial quando acomete os linfonodos superficiais e pele, e a LC visceral quando acomete os linfonodos internos e em órgãos como pulmão, fígado, baço, medula e no sistema reprodutor (DORELLA et al., 2006), a LC visceral é considerada a forma assintomática da doença devido a ausência de diagnóstico sorológicos. A LC é de difícil controle devido à falta de tratamentos e medidas profiláticas, como diagnóstico precoce e vacinas eficazes. Antibióticos em tratamentos quimioterápicos são usados, porém sem eficácia já que há formação de granulomas, os quais protegem o microrganismo da ação da droga (COSTA et al., 2011). Considerando o fato de o tratamento da LC ser de alto custo e ineficaz, a medida de menor custo-benefício contra a introdução da patogênese nos rebanhos é o diagnóstico sorológico e a imunização. Os diagnósticos sorológicos testados na literatura empregam o patógeno íntegro ou sobrenadantes de cultura que induzem a reações cruzadas com outras doenças. Assim como a vacina comercial é baseada na linhagem atenuada de C. pseudotuberculosis e apresenta baixa proteção e necessidade de reforços anuais (WINDSOR, 2011). Uma alternativa na utilização desses antígenos é o uso de peptídeos sintéticos que mimetizam epítopos de célula B identificados por ferramentas de bioinformática, podendo ser úteis na substituição de proteínas integras como antígenos e imunógenos, e apresentam vantagens por serem seguros, padronizáveis, específicos, reprodutíveis e disponíveis em larga escala nas análises in vitro (URIAS et al., 2009). As análises in silico de predição de epitopos de célula B permitem a identificação de epítopos lineares e conformacionais, que são úteis na síntese de fragmentos sintéticos (peptídeos) de proteínas antigênicas capazes de se ligarem a anticorpos e/ou induzirem a produção de anticorpos anti-peptídeos. Os métodos de bioinformática para predição de epítopos, que vislumbram a utilização da tecnologia de síntese de peptídeos, é uma estratégia mais simples, rápida, e com menor custo de produção e identificação de regiões antigênicas de proteínas em organismos patogênicos, incluindo proteínas de C. pseudotuberculosis. Assim, a predição de epitopos lineares e conformacionais de célula B por metodologia in silico é uma importante área de pesquisa que vem a contribuir para produção de novos antígenos a serem aplicados no controle da LC. Este estudo tem como objetivo, portanto, identificar epítopos lineares de célula B a partir de proteínas de C. pseudotuberculosis para uso em modelo animal para desenvolvimento de uma vacina peptídica contra Linfadenite Caseosa. MATERIAL E MÉTODOS Origem das sequências proteicas Sequência da serina protease corinebacteriana foi utilizada, a qual já foi testadas sua antigenicidade e imunogenicidade por DROPPA-ALMEIDA et al., Sua sequência de aminoácidos foi obtidas no NCBI (número de acesso NC_ NCBI). Obtenção dos epítopos Para identificação dos epítopos específicos para as células B foram usados os softwares BepiPred que é baseado em métodos de escala de propensão; ABCPred, com base em métodos de aprendizado de máquina que se aplicam uma rede neural recorrente; e BCPreds, que também é baseado em métodos de aprendizado de máquina, mas envolvem os que se aplicam a máquinas de vetores de suporte. As sequências identificadas no mapeamento indicam quais os peptídeos de cada proteína têm maior probabilidade de interagir com as Moléculas de Histocompatibilidade Maior (MHC) classe II. A proteína foi mapeada in silico e os epítopos gerados pelos softwares foram comparados, permitindo selecionar aqueles resultantes da sobreposição de predições dos três softwares simultaneamente. Obtenção dos peptídeos sintéticos O peptídeo sintético foi sintetizado pela empresa AminoTech, a qual utiliza o método químico de fase sólida. O peptídeo foi nomeado de peptídeo14 por conter 14 resíduos de aminoácidos. Animais Comitê de ética - O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de ética de uso Animal da Universidade Tiradentes com o parecer consubstanciado nº Este projeto é continuação de outro já em execução.

3 3 Inoculação dos camundongos com as formulações vacinais Camundongos fêmeas da linhagem swiss de 9-12 semanas de idade foram utilizados no estudo. O ensaio foi composto por três grupos com seis animais em cada grupo. Foram divididos em grupo controle (G1) inoculado com solução salina, grupo com adjuvante (G2) inoculado com 7,5μg de saponina, e o grupo G3, inoculado com (50μg) do peptídeo14 associado com 7,5μg de saponina. Foram administradas duas imunizações no dia 0 e 15 pela via subcutânea e sessenta dias após a primeira imunização os animais foram desafiados com 1,0 x 10 7 da linhagem virulenta de C. pseudotuberculosis CPNS. Após o desafio os animais foram monitorados durante 60 dias e diariamente foram observados peso (>75% eram eutanasiados), formação de granulomas, morbidez e mortalidade. Análise estatística Para plotagem dos dados o programa GraphPad Prism versão 6.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA) foi utilizado. O teste de Fisher determinou as diferenças significativas na mortalidade e sobrevivência, respectivamente, entre os grupos imunizados. O valor fixado para significância estatística foi de P< 0,05. RESULTADOS E DISCUSSÃO Obtenção dos peptídeos baseados em epítopos As sequências que foram identificadas no mapeamento indicam quais os epítopos da serina protease corinebacteriana têm maior probabilidade de interagir com as moléculas do MHC, e resultaram em 184 epítopos. A partir destes resultados foram feitas análises para verificar a sobreposição, deste modo foram escolhidos apenas as sequências que estivessem presentes nas três análises com os três softwares diferentes. Em todos os softwares foram selecionados um tamanho de resíduos de aminoácidos para compor o peptídeo, uma vez que a fenda das moléculas de MHC classe II comportam de resíduos de aminoácidos (Lopes 2006).Um peptídeos de 14 aminoácidos contendo a sequência -DRDGRTYDGDDFTT -foi presente nos três softwares. Após a seleção, a sequência peptídica foi enviada para empresa AminoTech e pelo método químico de fase sólida foram sintetizados com alto grau de purificação. O peptídeo liofilizado foi dissolvido seguindo as instruções do fabricante. O uso de peptídeos sintéticos visa mimetizar epítopos imunodominantes para o desenvolvimento de vacinas contra doenças infecciosas, parasitárias e cânceres (Faria et al. 2011; Karunakaran et al. 2015; Qian et al. 2015; Singh et al. 2015) e vem apresentando resultados satisfatórios. Animais Potencial vacinal Para verificar o potencial imunoprotetor do peptídeo14, testou-se em camundongos fêmeas da linhagem swiss, divididos em três grupos G1, G2 e G3. A figura 1 mostra a curva de sobrevivência dos animais imunizados e desafiados com a linhagem virulenta de C. pseudotuberculosis CPNS. Nota-se que houve mortes em todos os grupos. Através das análises estatísticas pelo teste de Fisher não houve diferenças estatísticas entre os grupos controles e o experimental. Estes resultados revelam que o peptídeo14 não conseguiu proteger os animais e isso se deve a diversos fatores. O tamanho reduzido dos peptídeos pode ter influenciado no não reconhecimento pelas células dendríticas, células apresentadoras de antígenos (APC) primordiais para a ativação dos linfócitos T, assim como essas biomoléculas podem ter sido eliminadas pelo Sistema fagocitário mononuclear antes da ativação de uma resposta imune que conferisse proteção. Outra justificativa pode ser o uso de um adjuvante simples como a saponina, que apesar de mediar uma resposta TH1, a qual é a ideal contra LC, este adjuvante atua induzindo a produção de citocinas e não auxilia no processo de apresentação de antígeno, fato que outros adjuvantes mais sofisticados podem proporcionar (PAVAN et al., 2016). CONCLUSÕES Sendo assim a LC, conhecida como mal do caroço, uma doença infectocontagiosa de ocorrência mundial com prevalência em diversos países, representa um grande impacto econômico. Como o tratamento da LC é de alto custo e ineficaz, ultimamente a melhor estratégia que apresenta melhor custo benefício contra a doença é a

4 4 imunoprofilaxia. Dentre as possibilidades, a criação de uma nova vacina, uma vez que as vacinas comercias já disponveis não possuem uma eficácia satisfatória.dentre as novas abordagens, temos vacinas formuladas contendo sequências de aminoácidos baseadas em epítopos que são sintetizadas em laboratório(vacinas de peptídeos sintéticos ), esta seleção de epítopos imunodominantes se torna possível com o auxilio da bioinformática que prediz as sequências. Com isso o trabalho obteve as sequências através de softwares de predição de epítopos e formulou uma vacina com peptídeo de 14 resíduos de aminoácidos e associou com saponina, os testes em camundongos revelaram que a vacina não apresentou proteção dos animais. No entanto, novos testes são necessários para avaliar melhor a imunogenicidade do peptídeo, assim como adjuvantes baseados em padrões associados a patógenos (PAMPs). REFERÊNCIAS 1. AYERS, J. L. Caseous lymphadenitis in goat and sheep: review of diagnosis, pathogenesis, and immunity. JAVMA, n. 171, p , BATEY, R. G. Factors affecting the yield of viable cells of Corynebacterium pseudotuberculosis in a liquid medium. Vet. Microbiol., v. 11, n. 1-2, p , 1986a. 3. BATEY, R. G. Pathogenesis of caseous lymphadenitis in sheep and goats. Aust. Vet. J., n. 63, p , 1986b. 4. BRAGA, W.U. Protection in alpacas against Corynebacterium pseudotuberculosis using different bacterial components. Vet. Microbiol., v. 119, p , BROGDEN, K.A.; CHEDID, L.; CUTLIP, R.C.; LEHMKUHL, H.D.; SACKS, J. Effect of muramyl dipeptide on immunogenicity of Corynebacterium pseudotuberculosis wholecell vaccines in mice and lambs. Am. Vet. Res., v. 51, p , CHAPLIN, P.J.; De ROSE, R.; BOYLE, J.S.; McWATERS, P.; KELLY, J.; TENNENT,J.M.; LEW, A.M., SCHERLINCK, J.-P.Y. Targeting improves the efficacy of a DNA vaccine against Corynebacterium pseudotuberculosis in sheep. Infect. Immun., v. 67, p , COSTA ET AL. Molecular characterization of the Corynebacterium pseudotuberculosis hsp60- hsp10 operon, and evaluation of the immune response and protective efficacy induced by hsp60 DNA vaccination in mice. BMC Research Notes 2011, 4: COSTA, L.F.M. Corynebacterium pseudotuberculosis, the ethiological agent of the caseous lymphadenitis in goats. R. Ci. Méd. Biol., Salvador, v. 1, n. 1, p , nov DORELLA FA, PACHECO LGC, OLIVEIRA SC, MIYOSHI A, AZEVEDO V: Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties, pathogenesis and molecular studies of virulence. Vet Rev 2006, 37: URIAS EV, CARVALHO SF, OLIVIERA CL, CARVALHO ML; TELES LF; RODRIGUES MC, MAIA CN. Prevalência de adultos infectados por Leishmania leishmania chagasi entre doadores de sangue do Hemocentro Regional de Montes Claros, Minas Gerais, Brasil. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. 2009; 31(5): Percentual de sobrevivência Figura 1 Curva de sobrevivência dos animais imunizados com e desafiado com C. pseudotuberculosis com a linhagem virulenta CPNS (UFC 10 7 ). Análise estatísticas com teste de Fisher P Value > 0,05, não apresentando diferença estatística entre os grupos. G1 G2 G3

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