Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

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1 Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas Estudo de amostras de Staphylococcus spp isolados de infecção nosocomial da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil WAGNER LUIS MENDES DE OLIVEIRA RECIFE 2009

2 WAGNER LUIS MENDES DE OLIVEIRA Estudo de amostras de Staphylococcus spp isolados de infecção nosocomial da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de mestre em Ciências Biológicas na área de concentração: Biotecnologia Orientadora: Drª Alzira Maria Paiva de Almeida Co- orientadora: Drª Nilma Cintra Leal RECIFE

3 Oliveira, Wagner Luis Mendes de Estudo de amostras de Staphylococcus spp isolados de infecção nosocomial da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil / Wagner Luis Mendes de Oliveira. Recife: O Autor, folhas: il., fig., tab. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas, Inclui bibliografia e anexo. 1. Staphylococcus aureus 2. Bactérias resistentes 3. Infecções hospitalares - Controle I Título CDU (2.ed.) UFPE CDD (22.ed.) CCB

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5 À minha avó e minha mãe. 5

6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pela oportunidade do aperfeiçoamento intelectual e de poder também desenvolver qualidades morais importantes para meu adiantamento. A Drª Alzira de Almeida pela oportunidade da orientação, disponibilidade para as correções necessárias durante o desenvolvimento do estudo, além de toda atenção e zelo. A Dr a Nilma Cintral Leal muito mais do que pela oportunidade, orientação precisa e confiança em mim depositada, agradeço pelo carinho e apoio de sempre. Ao Drº Osvaldo Pompilio de Melo Neto, Drº Ernesto Hofer e Drª Deyse Vallin pela colaboração no estudo. Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães Dept. de Microbiologia -, que possibilitou toda a infra-estrutura para o desenvolvimento deste trabalho. Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas e aos órgãos de fomento (CAPES e CNPq) pela disponibilização de bolsa de estudo durante o desenvolvimento do estudo. A Silvana Santos, Isaac Martins e Cláudio Araújo técnicos do Dept. de Microbiologia (CPqAM) que me deram suporte para desenvolver minha pesquisa. Aos colegas do Deptº de Microbiologia (CPqAM) e da Pós graduação (CCB) que também fazem parte desta conquista. À Patrícia Toniollo e Eduarda Mangueira (minhas pupilas) pela inestimável colaboração no estudo. A Marinalda Anselmo Vilela e Márcia Camargo pela amizade, sugestões e links que me abriram muitas vezes um horizonte vasto de conhecimentos e descobertas. 6

7 SUMÁRIO Agradecimentos... v Lista de figuras... viii Listas de tabelas... ix Lista de abreviaturas... x Resumo... xi Abstract... xii 1. Introdução Objetivo Objetivo geral Objetivos específicos Revisão bibliográfica Staphylococcus: Características gerais Mecanismos de virulência Biofilme Resistência aos antimicrobianos: uma visão geral Resistência à β-lactâmicos: bases moleculares Operon mec SCCmec: Staphylococcal cassette chromosome mec Mecanismos de regulação Proteína de ligação à penicilina Origem e reservatório do SCCmec Epidemiologia molecular das infecções por MRSA Distribuição mundial dos clones de MRSA Métodos fenotípicos para detecção de resistência Referências Bibliográficas Artigo I: Estudo de cepas de Staphylococcus SCCmec tipo III de origem 35 hospitalar da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil Artigo II: Diversidade genética de cepas de Staphylococcus isoladas de infecção 47 nosocomial no Brasil Conclusões Anexos

8 LISTAS DE FIGURAS Figura 1. Microscopia eletrônica e microscopia óptica de Staphylococcus aureus Figura 2. Modelo da biossíntese da adesina intercelular polissacarídica (PIA) Figura 3. Representação do complexo mec Figura 4. Diagrama esquemático dos cinco tipos de Complexo mec Figura 5. Esquema da região do SCCmec com seus dois importantes sítios, o complexo mec e o complexo ccr, além das regiões J (J1, J2 e J3) Figura 6. Representação esquemática das proteínas BlaR1 e/ou MecR1, envolvidas na regulação de β-lactamase e PBP2a respectivamente Figura 7. Representação esquemática das proteínas MecI e BlaI envolvidas na repressão de β-lactamase e PBP2a respectivamente Figura 8. Mecanismo de ação da PBP2 e PBP2a Figura 09 Amplificação do gene mecr1 com os primres SA-17/SA Figura 11 Gel de agarose 1% representativo das amplificações por PCR dos genes icaa (esquerda) com 1315 pb e icad (direita) com 381pb Figura 12. Dendograma ilustrando a similaridade entre os perfis cromossomais detectados por PFGE entre as 17 amostras resistentes à oxacilina Figura 9. Dendograma ilustrando a similaridade entre os perfis cromossomais detectados por PFGE entre as 29 amostras sensíveis à oxacilina

9 LISTAS DE TABELAS Tabela 1. Características dos diferentes tipos de SCCmec Tabela 2. Combinações e seqüências dos oligonucleotídeos utilizados Tabela 3. Características dos isolados de Staphylococcus spp identificados como pré 60 meticilina resistente (pré-mrs * ), relacionando o operon icaad e o fenótipo... Tabela 4. Características dos isolados de Staphylococcus spp identificados como resistente à meticilina (MRS * ), relacionando o operon icaad e o fenótipo

10 LISTA DE ABREVIATURAS ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária ccr Cassete de recombinação cromossômica CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães dntp Desoxiribonucleotídeo Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz HUOC Hospital Universitário Oswaldo Cruz IS - Segmento de inserção Kb quilo bases KDa Kilodalton MgCl 2 Cloreto de Magnésio MRS Staphylococcus spp. resistente a meticilina MRSA Staphylococcus aureus resistente à meticilina MRSCoNs Staphylococus coagulase negativo resistente meticilina MS- Região transmembrana da proteína PBP2a MSSA - Staphylococcus aureus sensível à meticilina NCBI - National Center for Biotechnology Information NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards PB Região de ligação da penicilina da proteína PBP2a PBP Proteína de ligação da penicilina PCR Reação em cadeia da polimerase PFGE Eletroforese em gel de campo pulsado PIA Adesina Intercelular Polissacarídica PNAG N-acetil glicosamina Polimérica RBS Sítio de ligação do ribossomo SaPI Ilha de Patogenicidade de Staphylococcus aureus SaPbov Ilha de Patogenicidade de Staphylococcus aureus bovino SCCmec Cassete cromossômico estafilocócico mec SCN Staphylococcus Coagulase Negativo TSST Toxina da Síndrome do Choque Tóxico VRSA Staphylococcus aureus resistente vancomicina 10

11 OLIVEIRA, W.L.M. Estudo de amostras de Staphylococcus spp isolados de infecção nosocomial da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2009 RESUMO Staphylococcus, embora presente na microflora da pele e mucosa humana se comporta como patógeno oportunista responsável por complicações infecciosas, principalmente após implantação de dispositivos protéticos. Além disso, possui extraordinária capacidade para adquirir resistência a antimicrobianos. Atualmente, Staphylococcus resistentes à meticilina (MRS) estão dispersos e relacionados com processos infecciosos tanto em âmbito hospitalar como na comunidade. A capacidade de aderir e colonizar materiais inertes por meio da formação de um biofilme confere proteção contra defesas do hospedeiro e a agentes antimicrobianos. A formação de biofilme tem sido associada com o nível de susceptibilidade à meticilina. O presente trabalho visou caracterizar amostras estafilocócicas pela identificação de genes relacionados à produção de biofilme (icaad) e à regulação da resistência à meticilina (meci e mecr1) correlacionando com a capacidade para formar biofilme in vitro e a susceptibilidade à oxacilina respectivamente, além de determinar o tipo de recombinase (ccr) presente no SCCmec das amostras e de estabelecer relação genética entre os isolados. As análises realizadas em 46 amostras de Staphylococcus obtidas de infecções nosocomiais de um hospital universitário da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil permitiram observar que a habilidade para formar biofilme nem sempre está associada à presença ou mesmo à transcrição dos genes icaad, principalmente nos MRS. Diante disso os genes icaad não constituem marcadores moleculares eficazes para diferenciar isolados produtores de biofilme dos não produtores sendo recomendável associar a detecção molecular dos genes ica com a prova fenotípica de determinação da produção de biofilme. Nossos resultados mostram que o alelo tipo ccra3 é conservado tanto em S. aureus quanto em SCN sugerindo transferência horizontal entre as amostras. Foi observada uma deleção de aproximadamente 700pb no gene mecr1 apontando para um novo arranjo nessa região em MRSA e MRSCN. Essa alteração ainda não havia sido descrita em isolados de origem hospitalar. A avaliação da relação genética dos isolados revelou grande diversidade entre isolados sensíveis e resistentes com a prevalência de alguns clones dentro do hospital. A diversidade dos perfis encontrados sugere uma origem comunitária das amostras. O conhecimento do perfil fenotípico e molecular das amostras de Staphylococcus obtido no nosso estudo pode contribuir para orientar a conduta terapêutica no tratamento e controle de infecções hospitalares. Palavras chaves: Staphylococcus, biofilme, SCCmec 11

12 OLIVEIRA, W.L.M. Study of samples of Staphylococcus spp isolated from nosocomial infection in the city of Recife, Pernambuco, Brazil. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, ABSTRACT Staphylococcus, although present in the microflora of human skin and mucosa, behaves as an opportunistic pathogen responsible for infectious complications, especially after the implantation of prosthetic devices. Furthermore, it has an extraordinary ability to acquire resistance to antimicrobials. Nowadays, methicillin-resistant Staphylococcus (MRS) are widespread and related to infectious processes both in the hospital and community. The ability of the bacteria to adhere to and to colonize inert materials through the formation of a biofilm confers protection against host defenses and antimicrobial agents. Biofilm formation has been associated with the level of susceptibility to methicillin. In the present study, we characterized staphylococcal samples identifying genes related to the production of biofilm (icaad) and to the regulation of resistance to methicillin (meci and mecr1) correlating with the ability to form biofilm in vitro and with susceptibility to oxacillin, respectively. Furthermore, we determined the cassette chromosome recombinase SCCmec present in the samples and established the genetic relationship among the isolates. An analysis carried out on 46 samples of Staphylococcus obtained from nosocomial infections at a university hospital in the city of Recife, Pernambuco, Brazil showed that the ability to form biofilm is not always associated with the presence or transcription of the icaad genes, mainly in the MRS. Hence, icaad genes are not effective molecular markers for differentiating biofilm-producers from non-producers among isolates. Therefore, both the molecular detection of ica genes and the phenotypic determination of biofilm production are recommended. Our results demonstrate that the allele type ccra3 is conserved both in S. aureus and in SCN, suggesting horizontal transfer among the samples. We also observed a deletion of approximately 700 bp in mecr1, suggesting a new arrangement in this region in MRSA and MRSCN not yet described in isolates of hospital origin. The assessment of the relationship among the isolates showed high genetic diversity among sensitive and resistant isolates and the prevalence of some clones within the hospital. The diversity of profiles found suggests a community origin of the samples. Knowledge of the molecular and phenotypic profile of samples of Staphylococcus obtained through our studies may help in guiding the therapeutic approach for the treatment and control of hospital infections. Keywords: Staphylococcus, biofilm, SCCmec 12

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14 A mortalidade e morbidade por infecções esfilocócicas que antes da introdução da terapia antibiótica era de aproximadamente 80%, apresentaram uma queda considerável após a introdução na terapia clínica da penicilina e um pouco mais tarde da meticilina. Contudo atualmente, em conseqüência do alto nível de resistência, infecções decorrentes de Staphylococcus aureus resistente à meticilina/ oxacilina (MRSA) tem provocado altos índices de mortalidade. A resistência a antibióticos considerados de última escolha no tratamento dessas infecções, como é o caso da vancomicina, tem dificultado ainda mais o seu controle (Dancer, 2008). Segundo o último relatório de perfil de suscetibilidade dos microrganismos - análise dos dados de 2006 e 2007 da Rede Nacional de Monitoramento da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde (Rede RM), criada em 2004 em parceria com a Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) e Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública do Ministério da Saúde (CGLAB/MS), os estafilococos representaram 47% de todas as notificações. A resistência à oxacilina foi constatada em 80% dos isolados de Staphylococcus coagulase negativo (SCN) e em 61% dos S. aureus, em 18 meses do monitoramento. Staphylococcus resistente à meticilina é frequentemente isolado em hospitais universitários da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil. Apesar disso, os estudos dos aspectos moleculares da resistência à meticilina e a relação filogenética entre os isolados ainda são escassos. Estudos realizados no Departamento de Microbiologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM) identificaram amostras estafilocócicas portando o gene meca e apresentando perfil de susceptibilidade variável. O presente trabalho teve como objetivo, caracterizar estas amostras fenotipicamente, quanto a susceptibilidade a oxacilina e a produção de biofilme, identificar por PCR, genes relacionados à virulência e genes reguladores da resistência à meticilina além da possibilidade de estabelecer relações genéticas entre as amostras por meio da análise dos perfis de macrorrestrição. Nossos resultados contribuíram para o conhecimento do perfil fenotípico e molecular de amostras de Staphylococcus meticilina resistentes e pré-meticilina resistentes, do potencial de virulência dessas amostras e de sua dispersão dentro do hospital. Esses conhecimentos podem ser aplicados na orientação para adoção de uma terapêutica adequada para o tratamento de infecções e de medidas de controle de infecção hospitalar. 14

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16 2.1 OBJETIVO GERAL Caracterizar isolados de Staphylococcus spp associados a infecções hospitalares, quanto à presença de genes de virulência e genes envolvidos na resistência à antibióticos β-lactâmicos, além de determinar a variabilidade clonal dos isolados. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Investigar a presença e expressão dos genes icaad e relacionar com produção de biofilme in vitro. Analisar a variabilidade genética dos isolados para possível identificação de clones prevalentes. Determinar a presença dos genes meci e mecr1 em amostras sensíveis e resistentes à oxacilina. Caracterizar o tipo de SCCmec, nas amostras estudadas, pela identificação de genes do complexo ccrab. 16

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18 3.1 Staphylococcus: características gerais Staphylococcus são microrganismos esféricos, imóveis, Gram-positivos que se apresentam agrupados em cachos, devido à capacidade de se dividir em mais de um plano (figura 1). São capazes de sobreviver e se multiplicarem tanto em aerobiose quanto em anaerobiose. Em meio agar sangue, formam colônias pequenas, brancas ou douradas, com ou sem hemólise. Apresentam tolerância a altas concentrações de NaCl e ao ressecamento, não sendo produtores de esporos. São produtores de catalase, o que os diferencia dos demais cocos Gram-positivos. Podem ser divididos em dois grupos com base na produção da enzima coagulase: os estafilococos coagulase-positivos, representados unicamente por Staphylococcus aureus, e estafilococos coagulasenegativos de diversas espécies (Koneman, 2008). Figura 1. Microscopia eletrônica (a esquerda) e microscopia óptica (a direita) de Staphylococcus aureus, mostrando o agrupamento em cachos e os cocos Grampositivos, respectivamente. Fonte: (Imagem acessada em 18/12/2008). S. aureus é considerado microbiota normal da nasofaringe, períneo e pele, principalmente dobras cutâneas úmidas, podendo colonizar indivíduos assintomaticamente, por curtos ou longos períodos de tempo, causando doenças quando há um comprometimento do sistema imunológico (Kloos; Bannerman, 1994; Chambers, 2001). Grande parte dos profissionais de saúde e pacientes hospitalizados abriga estafilococos nas narinas ou na pele, sendo esses indivíduos os maiores vetores de disseminação destas bactérias no ambiente hospitalar. Existem três padrões de colonização de S. aureus: (i) 20% das pessoas são colonizados por uma mesma cepa; (ii) 18

19 cerca de 60% das pessoas abrigam S. aureus intermitentemente e, em geral, as cepas são variadas e (iii) cerca de 20% não são colonizadas pela bactéria. Os carreadores persistentes parecem estar protegidos da aquisição de outras cepas. No entanto, essa proteção diminui com o uso de antimicrobianos (Kluytmans et al., 1997). Este microrganismo também é considerado um dos principais patógenos humanos, responsável por doenças causadas pelas suas toxinas, invasão direta e disseminação sistêmica. Frequentemente está envolvido em processos supurativos, formação de abscessos e várias infecções piogênicas. A liberação de toxinas pode provocar intoxicações alimentares, síndrome do choque tóxico e síndrome de Panton-Valentine. S. aureus é causador de bacteremias, osteomielite, endocardites e infecções em feridas cirúrgicas. As infecções nosocomiais por S. aureus têm emergido como um grande problema clínico e epidemiológico, devido seu caráter oportunista e ao aumento da resistência aos antimicrobianos (Lowy, 2003). Os estafilococos coagulase negativos (SCN) são habitantes normais da pele e mucosas de humanos e geralmente possuem um relacionamento benigno com seu hospedeiro. No entanto tornam-se patogênicos quando têm acesso a tecidos internos, através de trauma na barreira cutânea, inoculação por agulhas ou implante de materiais médicos como próteses articulares, catéteres, válvulas cardíacas, marcapassos, etc. (Koneman, 2008). Nos últimos 20 anos, houve um aumento no número de casos de infecções hospitalares por SCN, que passou a ser considerado como um dos cinco organismos mais frequentemente associados a infecções hospitalares (Kloss; Bannerman, 1994). Um dos maiores problemas enfrentados pelos laboratórios de microbiologia clínica e pelos médicos envolvendo os SCN está na dificuldade em distinguir isolados patogênicos dos contaminantes, desde que o principal contaminante dos frascos de hemocultura é também o principal patógeno em infecções envolvendo catéter e outros materiais médicos implantados (Eiff et al., 1998). 3.2 Mecanismos de virulência A virulência de Staphylococcus é multifatorial e atribuída a uma ação combinada de diferentes componentes de superfície. Baseado na atividade biológica, os fatores de virulência podem ser divididos em três categorias funcionais: (i) os que favorecem a adesão das bactérias às células e tecidos, (ii) os que promovem danos ao tecido e 19

20 permitem a disseminação, (iii) e os que protegem a bactéria do sistema imune do hospedeiro (Arvidson; Tegmark, 2001). A patogenicidade de S. aureus depende da combinação de mais de 40 diferentes toxinas extracelulares, enzimas e proteínas de superfície. Um regulador global agr controla a produção de vários desses fatores de virulência. Alguns destes fatores de virulência possuem um papel importante no processo de colonização, resultando na conversão do tecido hospedeiro em nutrientes para o crescimento bacteriano, facilitando sua disseminação nos tecidos e/ou sua ação contra antimicrobianos (Dinges et al., 2000; Arvidson; Tegmark, 2001). A maioria dos fatores de virulência é codificada por elementos genéticos acessórios (plasmídios, transposons, profagos e ilhas genômicas), que permite a transferência horizontal e disseminação da virulência entre cepas de S. aureus. Diferentes ilhas de patogenicidade foram encontradas no genoma estafilocócico como SaPI1 SaPI4, SaPbov1, SaPbov2 e SaPIn1 SaPIn3. Estas ilhas carreiam genes responsáveis por codificar numerosas enterotoxinas denominadas de A-M, as toxinas esfoliativas A e B e a toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1) (Novick et al., 2001; 2003). Estas toxinas são consideradas superantígenos devido à capacidade de interagir com receptores específicos dos linfócitos T, acarretando sua proliferação e consequente liberação de citocinas que vão provocar manifestações sistêmicas (Lowy, 1998). Em algumas cepas de MRSA pode ocorrer intensificação de algumas toxinas, como TSST, alfa-toxina e leucocidinas induzidas pelo uso de antibióticos que irão acelerar o processo de virulência in vivo (Dancer, 2008). Staphylococcus coagulase negativo (SCN) produz menos toxinas que S. aureus. Geralmente o sucesso de SCN como patógeno é atribuído a sua habilidade para aderir a superfícies inertes ou poliméricas e escapar das defesas do hospedeiro e da ação antimicrobiana (Voung; Otto, 2002) Biofilme S. aureus e Staphylococcus epidermidis possuem a capacidade de aderir a superfícies e de formar um biofilme estável. O processo de formação do biofilme requer dois estágios: a) a adesão da bactéria à superfície inerte e b) a formação de um agregado celular decorrente do processo de adesão célula-célula mediada pela adesina intercelular 20

21 polissacarídica (PIA) ou N-acetil-glicosamina polimérica (PNAG) que é sintetizada por enzimas codificadas por genes presentes no lócus ica (O Gara; Humphreys, 2001; O Gara, 2007). O operon icaadbc foi primeiramente identificado e caracterizado em S. epidermidis, sendo formado por quatro genes estruturais responsáveis pela síntese de uma adesina polissacarídica, também conhecida como slime, e o gene icar, que atua como regulador negativo da transcrição do lócus icaadbc (Mack et al., 2007). Os genes icaa, icac e icad codificam proteínas transmembranas, em que IcaA possui atividade homóloga a N-acetil-glicosaminiltransferase. A atividade da proteína IcaA é intensificada por IcaD, que parece atuar como uma proteína auxiliar (chaperona) permitindo um enovelamento correto da proteína IcaA e atuando na ligação entre as proteínas IcaA e IcaC. A inativação dos genes icaa ou icac leva a uma diminuição da capacidade de adesão intercelular, sugerindo que esses dois genes são importantes na expressão de PIA. A função dos genes icab e icac não está bem esclarecida, contudo parecem estar envolvidos na translocação do polissacarídeo na superfície celular (figura 2) (O Gara, 2007). Figura 2. Modelo da biossíntese da adesina intercelular polissacarídica (PIA), indicando a localização das proteínas IcaA, IcaB, IcaC e IcaD, codificadas pelo operon icaadbc. Fonte: Gotz, (2002) (Modificado). A produção de PIA é influenciada por um sistema de regulação variável afetado por condições ambientais. Entretanto há uma associação entre os níveis de resistência à meticilina e a habilidade para formar biofilme decorrente de PIA (Mempel et al., 1994; 21

22 1995). Em isolados sensíveis à meticilina a expressão de biofilme é induzida por NaCl, sendo dependente de ica e em isolados resistentes, a produção de biofilme é induzida pela glicose, o que caracteriza produção independente de ica (O Gara, 2007). Apesar do indiscutível papel do operon icaadbc na regulação e produção de biofilme, sua produção também pode ocorrer independente deste mecanismo. O gene bap, regulado positivamente pelos genes agra e sara, seria o responsável pelo desenvolvimento de biofilme independente de ica (O Gara, 2007). 3.3 Resistência aos antimicrobianos: uma visão geral A descoberta da penicilina, sua produção industrial e introdução na prática clínica alcançando grande sucesso no tratamento das infecções estafilocócicas, marcam o início da era antibiótica (Oliveira et al., 2002). A descoberta de novos agentes antimicrobianos facilitou o acesso a essas drogas e seu uso tornou-se frequente. Até o final da década de 1970 muitos antibióticos foram introduzidos no mercado, a exemplo da estreptomicina em 1948, a tetraciclina em 1950 e a eritromicina em 1953 (Oliveira et al., 2002). A idéia de que o controle das infecções era um objetivo possível de ser alcançado, levou ao uso indiscriminado dos antibióticos que passaram a ser utilizados para tratar os mais comuns e triviais tipos de infecções, algumas vezes de natureza nãobacteriana. Esse abuso provocou a seleção de cepas de S. aureus resistentes causadoras de infecções mais severas. Em 1950, o número de isolados clínicos de S. aureus resistentes aos antibióticos β-lactâmicos elevou-se rapidamente e seu uso tornou-se ineficaz para o tratamento de infecções estafilocócicas (Lencastre et al., 2007). Em 1960 mais de 80% dos isolados de infecções hospitalares ou comunitárias já eram resistentes aos β-lactâmicos (Fluit et al., 2001). Nesse mesmo ano, foi lançada no mercado a meticilina, uma penicilina semi-sintética, como alternativa terapêutica para cepas produtoras de penicilinase, uma vez que essa droga não sofre ação dessa enzima. Porém, em 1961 cepas resistentes passaram a ser identificadas em hospitais britânicos e foram denominadas de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA). A consequência da resistência à meticilina afetou não só o uso deste antibiótico, mas também a utilização de todos os antibióticos β-lactâmicos, que constituem o grupo mais importante e amplo dos agentes antibacterianos (Lencastre et al., 2007). 22

23 Na década de 1960, as estirpes de MRSA ainda eram relativamente raras, mas começaram a espalhar-se rapidamente, atingindo proporções epidêmicas no Norte da Europa em meados da década de Justamente quando esta onda de cepas MRSA começou a diminuir no Norte da Europa, uma segunda onda de cepas MRSA emergiu invadindo a Europa Meridional, E.U.A., a Austrália e o Extremo Oriente (Lencastre et al., 2007). Na década de 1980, cepas MRSA representavam um problema endêmico em diferentes hospitais de diversos países, incluindo o Brasil (Enright et al., 2002). Estas bactérias, inicialmente, causavam importantes infecções nosocomiais e eram a maior causa de morbi-mortalidade em pacientes hospitalizados. Porém, no início dos anos 1990, com a introdução de medidas de higiene e o maior controle na administração de antibióticos por parte dos hospitais, houve uma diminuição da freqüência de cepas MRSA nos hospitais de alguns países. Por outro lado, isolados MRSA começaram a disseminar-se na comunidade, causando doenças em portadores antes assintomáticos (Lencastre et al., 2007). Com o surgimento das isoxazolilpenicilinas (oxacilina, dicloxacilina, cloxacilina e flucloxacilina) que são estáveis em ph ácido e apresentam alto índice de ligação às proteínas plasmáticas (80%), a meticilina deixou de ser utilizada em muitos países, inclusive no Brasil. A expressão meticilina-resistente ou a sigla MRS continua sendo utilizada, para designar as cepas de Staphylococcus que não respondem ao tratamento com oxacilina e, por extensão, com as demais isoxazolilpenicilinas (Amato Neto et al., 2000). Como a resistência à oxacilina está acompanhada da resistência a outros antimicrobianos, houve um aumento no uso de glicopeptídeos (vancomicina e teicoplamina), para terapia empírica e até mesmo profilaxia de infecções hospitalares estafilocócicas. O uso frequente e muitas vezes indiscriminado dos glicopeptídeos teve como consequência o surgimento de cepas resistentes à vancomicina e teicoplamina primeiramente detectado em Enterococcus na Europa em 1986 e em 1997, um isolado clínico de MRSA com reduzida sensibilidade a vancomicina foi encontrado no Japão (Hiramatsu et al, 1997; Mcdonald et al., 1997). Em 2002, o primeiro S. aureus com resistência plena à vancomicina foi identificado em Michigan nos EUA. Os antibióticos de escolha para o tratamento de infecções por estafilococos, ainda hoje, são do grupo dos glicopeptídeos. A teicoplanina apresenta maiores vantagens que a vancomicina, 23

24 pelo fato de ser menos nefrotóxica, possuir uma meia-vida sanguínea mais longa, e, portanto, ser de administração única diária e ter maior ação contra estafilococos e estreptococos. A linezolida faz parte de um novo grupo de antibióticos (oxazolidinona), e até o momento seu uso em pacientes com MRSA não apresentou maiores benefícios que o uso de glicopeptídeos. Contudo, existem poucos estudos a respeito e os resultados são controversos. Além disso, o custo paciente/dia da linezolida é muito maior que o da teicoplanina. Dessa forma, a linezolida deve ser reservada para casos de intolerância à teicoplanina e à vancomicina (Spencer, 1996; Wilcox et al., 2004) Resistência à β-lactâmicos: bases moleculares Os estafilococos possuem dois mecanismos de resistência aos antibióticos β- lactâmicos: a) a expressão da enzima β-lactamase, que hidrolisa o antibiótico e é codificada pelo gene blaz e b) a produção de uma proteína com ação de transpeptidase, conhecida como proteína de ligação a penicilina alternativa ou PBP2a, com baixa afinidade ao antibiótico, codificada pelo gene meca. A transcrição desses genes resultando na expressão de β-lactamase e PBP2a é controlada por sistemas reguladores distintos. O operon plasmidial bla (blari blai blaz) controla a produção de β- lactamase e o operon cromossomal mec (mecri meci meca) a produção de PBP2a (Fuda et al., 2005). Os genes plasmidiais blai-blar1 apresentam 61 e 34% de homologia com os genes cromossomais meci e mecr1, respectivamente, sugerindo que a função reguladora, a estrutura e a origem dos elementos mec são similares aos elementos bla (Archer; Bosilevac, 2001) Operon mec O Operon ou Complexo mec (42 kb) é formado pelo gene meca e os genes reguladores meci (repressor) e mecri (indutor) localizados antes do gene meca (figura 3), responsáveis pela expressão de uma proteína com baixa afinidade aos antibióticos β- lactâmicos, Em todos os complexos estudados encontra-se a IS431mec próximo ao gene meca (Ito et al., 2001). 24

25 Figura 3. Posição dos genes meca (estrutural), mecr1 (indutor) e meci (repressor) e a IS431 no Complexo mec. Fonte: Shore et al. (2005). Modificado. Cinco classes de Complexos mec são encontradas em cepas meticilina resistentes. A classificação desse complexo está baseada na integridade dos genes reguladores e como eles afetam o mecanismo. O Complexo mec classe A é o protótipo desse operon. Nas outras classes de Complexo mec (B-E), o gene meci e/ou o gene mecr1 estão parcialmente ou completamente deletados, associados com outras IS s como as IS1272, IS1182 e IS431 ou recombinados homologamente (figura 4) com outras partes do SCCmec (staphylococcal cassette chromosome mec) no qual está inserido o complexo mec (Katayama et al., 2001). Figura 4. Diagrama esquemático dos cinco tipos de Complexo mec encontrados em cepas meticilina resistentes. Fonte: Shore et al. (2005). 25

26 3.4.2 SCCmec: Staphylococcal cassette chromosome mec O SCCmec é um elemento genético móvel, considerado uma ilha genômica de resistência (Hiramatsu et al., 2001). O sequenciamento de dois isolados MRSA, (N315 e Mu50), revelou que esse elemento está localizado no cromossomo em um sítio específico (attbscc), próximo a origem de replicação. Esta localização confere uma importância estratégica para transcrição imediata de importantes genes de resistência a antimicrobianos (Hiramatsu et al., 2002). Até o momento sete tipos de SCCmec foram caracterizados, os quais variam entre 20.9 e 66.9 kb (Tabela 1). Os SCCmec tipos I, IV, V, VI e VII (os menores cassetes) não carreiam nenhum gene de resistência além do meca (com exceção das variantes IA, IVA e IVC). Enquanto que os tipos II e III causam resistência a múltiplos antibióticos e a metais pesados, devido a integrarem plasmídios (pub110, pl258 e pt181) e transposons (Tn554 e ψtn554) os quais carregam genes de resistência a eritromicina (erma), estreptomicina (spc), kanamicina, tobramicina (aadd), bleomicina (ble), tetraciclina (tetk), cádmio (cad) e mercúrio (Ito, et al., 2001; Deurenberg; Stobbering, 2008). Tabela 1. Características dos diferentes tipos de SCCmec SCCmec Kb Complexo mec Complexo ccr Origem Tipo I 34.3 Classe B ccrab1 Hospitalar Tipo II 53 Classe A ccrab2 Hospitalar Tipo III 66.9 Classe A ccrab3 Hospitalar Tipo IV Classe B ccrab2 Comunitária Tipo V 28 Classe C2 ccrc Comunitária Tipo VI 20.9 Classe B ccrab4 Comunitária Tipo VII 35.9 Classe C2 ccrc Comunitária O SCCmec é composto essencialmente por dois sítios genéticos importantes: o Complexo mec, formado pelo gene meca e seus reguladores meci e mecr1, repressor e indutor respectivamente e o Complexo ccr que contém os genes ccrab e ccrc que codificam recombinases específicas, responsáveis pela integração e excisão precisa do SCCmec inteiro. A estrutura e sequência de nucleotídeos desses complexos definem o tipo de SCCmec. Além desses dois complexos o SCCmec possui várias orfs que diferem 26

27 de um SCCmec para outro. Essas regiões são denominadas de regiões J ou Junkyard e divididas em três sítios. A região J1 está localizada entre a junção à direita do cassete e os genes ccr; a região J2 entre os genes ccr e o Complexo mec e a região J3 entre o Complexo mec e a orfx situada na porção 3 terminal do cassete (figura 5) (Hiramatsu et al., 2002; Deurenberg; Stobbering, 2008). Além disso, os cassetes possuem uma relação epidemiológica, desde que os SCCmec tipos I, II e III são, normalmente, de origem hospitalar e os tipos IV, V, VI e VII de origem comunitária (Tabela 1) (Katayama et al., 2001; Deurenberg; Stobbering, 2008). Figura 5. Esquema da região do SCCmec com seus dois importantes sítios, o complexo mec e o complexo ccr, além das regiões J (J1, J2 e J3). Fonte: (Imagem acessada em 04/01/2009. Modificada) Mecanismos de regulação A expressão de β-lactamase e PBP2a é regulada pelas proteínas BlaRI (sinalizadora) e MecRI (indutoras) respectivamente. São proteínas transmembranas codificadas pelos genes blar1 e mecr1 respectivamente e possuem dois importantes domínios: um domínio N-terminal de aproximadamente 38 kda, com α-hélices cruzando a membrana quatro vezes por quatro segmentos transmembranas (TM1, TM2, TM3, TM4). Os segmentos transmembranas são interconectados por três loops (L1, L2, L3), onde L1 e L3 estão voltados para o citoplasma e L2 é extra-citoplasmático. O segundo domínio, de aproximadamente 27 kda, consiste de um sensor C-terminal na superfície da membrana (figura 6). Entre BlaR1 e MecR1 existem diferenças 27

28 consideráveis: a homologia entre seus aminoácidos é de 34% e a cinética funcional de cada uma é diferente. Enquanto BlaR1 induz a expressão de blaz dentro de minutos, MecR1 pode levar horas para induzir meca a ser transcrito (Fuda et al., 2005). O evento inicial para expressão de resistência é a presença do antibiótico β- lactâmico no meio o qual reage com o sítio ativo do domínio C-terminal da proteína, BlaR1 e/ou MecR1, resultando numa quebra irreversível do anel β-lactâmico. A ligação do antibiótico à proteína sinalizadora, estimula uma mudança conformacional e uma discreta clivagem auto-proteolítica dentro do domínio citoplasmático, N-terminal. O passo final é a clivagem por metaloproteases, ativadas pelo processo de proteólise, da proteína repressora BlaI e/ou MecI em fragmentos incapazes de formar dímeros e se ligar ao DNA. Ambas, possuem peso molecular de 14 kda e a homologia entre elas é de 60%. As duas proteínas possuem um domínio de 11 kda que se liga ao DNA aos pares como um homodímero e impede a RNApol de transcrever o gene estrutural (figura 7) e um domínio de dimerização com 3 kda. Sem a ação repressora de BlaI e MecI a transcrição do gene estrutural é liberada para produção de β-lactamases ou PBP2a (Archer; Bosilevac, 2001; Zhang et al., 2001). Figura 6. Representação esquemática das proteínas BlaR1 e/ou MecR1, envolvidas na regulação de β-lactamase e PBP2a respectivamente. Fonte: Fuda, et al. (2005). Modificado. 28

29 Figura 7. Representação esquemática das proteínas MecI e BlaI envolvidas na repressão de β-lactamase e PBP2a respectivamente. Fonte: Cha et al. (2007). Modificado Proteína de ligação à penicilina A estrutura química da parede celular das bactérias é formada de subunidades alternadas de β-1-4-n-acetilglicosamina e N-acetilmurâmico onde se liga uma cadeia tetrapeptídica constituída de L-alanina, D-glutamina, L-lisina e D-alanina. Aproximadamente 90% dessas cadeias peptídicas estão ligadas a outras cadeias de glicano formando uma ponte interpeptídica de pentaglicina (Giesbrecht et al., 1998). O processo de ligação cruzada da parede celular é catalisado por uma proteína com ação de transpeptidase e transglicosilase conhecida como proteína de ligação a penicilina ou PBP. As PBP s estão localizadas na superfície extracelular da membrana citoplasmática. Estas proteínas possuem função de peptideoglicano-transpeptidases e funcionam como ligases, catalisando a reação de ligação cruzada entre os polímeros de peptideoglicano. Dessa forma, atuam na etapa final de montagem da parede bacteriana. As PBP s possuem alta afinidade por antibióticos β-lactâmicos que ligam-se impedindo a síntese de parede celular e tornando a célula bacteriana mais suscetível à lise. As quatro principais PBP s são PBP 1, 2, 3 e 4 e encontram-se tanto em isolados de Staphylococcus sensíveis como nos resistentes (Brakstad; Maeland, 1997). Essas 29

30 moléculas de alto peso molecular, 41 a 87 kda, são enzimas bifuncionais e são classificadas dentro de duas classes: classe A envolvida com a polimerização e transpeptidação (ligação cruzada) da parede celular, sendo alvo dos antibióticos β- lactâmicos e a classe B envolvida com a morfogenética bacteriana (Navarre; Schneewind, 1999). Isolados resistentes à meticilina produzem uma proteína alternativa de ligação à penicilina, referida como PBP2 ou PBP2a, que possui uma reduzida afinidade de ligação a componentes β-lactâmicos e são capazes de continuar a ligação cruzada da parede celular quando a PBP nativa não está em atividade (Goldstein et al., 2007). A PBP2a (78 kda) é codificada pelo gene meca e contém um domínio transpeptidase e um domínio penicilina não ligante (Brakstad; Maeland, 1997). Segundo Pinho et al. (2001) a PBP2, uma das PBP s estafilocócicas nativa, é necessária para a expressão adequada de resistência à meticilina, mostrando-se essencial para a síntese da parede celular e crescimento bacteriano na presença de antimicrobianos β-lactâmicos no meio. Esta proteína possui um domínio transpeptidase (TPase) e um domínio transglicosilase (TGase). Em altas concentrações de meticilina, o domínio transpeptidase é acilado e não é mais capaz de realizar a ligação cruzada dos peptídeos. No entanto, o domínio transglicosilase mantém-se funcional e coopera com a atividade da transpeptidase da PBP2a (figura 8). 30

31 Figura 8. Mecanismo de ação da PBP2 e PBP2a. Na ausência do antibiótico, os domínios TPase e TGase da PBP2 participam na biossíntese do peptideoglicano estafilocócico. A atividade da TPase da PBP2a, na ausência do antibiótico ainda não está esclarecida. Na presença do antibiótico, o domínio TPase da PBP2 está inativo, mas seu domínio TGase coopera com a atividade do domínio TPase da PBP2a. Fonte: Pinho et al. (2001). Modificado Origem e reservatório do SCCmec A origem do SCCmec é desconhecida. Análises da evolução genética demonstram que o SCCmec foi transferido de SCN para S. aureus. Um homólogo ao gene meca apresentando 88% de similaridade foi encontrado em Staphylococcus sciuri que se encontra na base da árvore genealógica do gênero Staphylococcus, e está muito afastado filogeneticamente de S. aureus, que é uma das espécies mais evoluídas (Couto et al., 1996). Wielders et al., (2001), observaram a transferência horizontal do gene meca, in vivo, entre S. epidermidis e S. aureus, durante antibioticoterapia. O fato de que a resistência à meticilina prevalece entre isolados de S. epidermidis (mais de 70% dos isolados hospitalares), sendo menos comum entre S. aureus, indica que os SCN atuam como reservatório para o SCCmec. Além disso, já havia alta prevalência de S. epidermidis carreando SCCmec tipo IV no começo da década iniciada em, e somente em 1981 foi detectado em S. aureus (Ito et al., 2001; Robinson; Enright, 2003). 31

32 Segundo Kreiswirth et al (1993) a origem e evolução dos clones de MRSA pode ser explicada pela teoria do simples clone. Segundo esta teoria os vários clones de MRSA teriam um MSSA ancestral comum que adquiriu o SCCmec em apenas um momento, nesta trajetória. Contudo, diferentes estudos apoiam outra teoria, a do multiclone, na qual sugerem que o elemento SCCmec foi introduzido, em diferentes épocas, em diferentes linhagens de S. aureus (Deurenberg; Stobbering, 2008) Epidemiologia molecular das infecções por MRSA A disseminação de microrganismos resistentes depende de vários fatores que incluem: (i) expansão do espectro de resistência devido a mutações; (ii) troca genética entre microrganismos; (iii) pressão seletiva em hospitais e na comunidade facilitando o desenvolvimento e a proliferação de clones bacterianos resistentes; (iv) inabilidade de alguns testes laboratoriais para detectar o aumento de fenótipos de resistência (Tenover, 2001). Tradicionalmente, infecções por Staphylococcus resistentes à meticilina são adquiridas exclusivamente em âmbito hospitalar, também conhecida como HA-MRSA. Alguns fatores contribuem para colonização ou infecção por isolados resistentes, como a exposição a terapias antimicrobianas, o longo tempo de internamento em Unidade de Terapia Intensiva (UTI), procedimentos cirúrgicos, procedimentos invasivos e exposição a pacientes já colonizados por MRS. Geralmente os microrganismos são introduzidos em uma instituição por meio de um paciente colonizado ou um membro da equipe hospitalar e a transmissão se dá principalmente através das mãos destes portadores. Além da transmissão por contato direto, os equipamentos e utensílios manipulados por pessoas colonizadas podem desempenhar importante papel na epidemiologia das infecções por MRSA (Kluytmans et al., 1997; Chambers, 2001). Por muitas décadas, após o seu isolamento em 1961, os MRS foram associados a infecções hospitalares. Contudo, uma mudança na epidemiologia dessas infecções foi observada com aumento de MRSA na comunidade (CA-MRSA), sendo registrado um elevado índice de infecção na América do Norte (USA), sudoeste do Pacífico (Austrália, Nova Zelândia e Samoa), e na Europa (França, Suíça e Holanda) (Vandenesch et al., 2003). Baseado na experiência com as cepas resistentes à penicilina, Chambers (2001), projetou para uma prevalência de 25% de cepas MRSA na comunidade. 32

33 Em geral CA-MRSA são mais virulentos. Apesar disso são mais sensíveis a outras classes de antibióticos. Há diferentes maneiras de se definir um isolado como CA-MRSA. Segundo o Center for Disease Control and Prevention (CDC), trata-se de uma cepa de MRSA isolada em um paciente de ambulatório ou até 48 horas de admissão. Esses pacientes não devem ter histórico recente de hospitalização ou de procedimentos considerados de risco para infecção hospitalar, como é o caso de ventilação mecânica, diálise ambulatorial, etc. As cepas CA-MRSA também podem ser definidas com base em marcadores genéticos, como a presença dos SCCmec tipos IV, V, VI ou VII e a presença dos genes relacionados à leucocidina Panto-Valentine (Deurenberg; Stobbering, 2008). Quando o CA-MRSA foi descrito pela primeira vez em 1993 na Austrália, sua ocorrência e transmissão estavam associadas a populações específicas (Groom et al., 2001). No final da década dos anos 90 ocorreu disseminação principalmente entre crianças e depois entre a população em geral. No Brasil, cepas MRSA comunitárias já foram isoladas em ambulatórios de dois diferentes hospitais de Porto Alegre. Tais pacientes não tinham histórico de hospitalização, isolamento prévio de MRSA, ou mesmo de cirurgias, um ano antes do isolamento do CA-MRSA (Ribeiro et al., 2005). Certos grupos de indivíduos como crianças (incluindo recém nascidos), homossexuais, atletas e certas populações étnicas apresentam maior risco para desenvolver infecções cutâneas de CA-MRSA (Philip; Cohen, 2007) Distribuição mundial dos clones de MRSA Por meio de técnicas de tipagem como a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) de sequências repetitivas do DNA (rep-dna), Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) e Tipagem por Sequências Multi Lócus (MLST) foi detectada a existência de cinco clones de MRSA disseminados internacionalmente. Estes clones representam linhagens que obtiveram sucesso em termos de habilidade em causar infecções, persistir e se disseminar entre distintas áreas geográficas, inclusive entre continentes. Estes clones foram classificados como Ibérico, Brasileiro, Húngaro, Nova York/Japão e Pediátrico Epidêmico. A denominação desses cinco clones epidêmicos de MRSA reflete a região na qual eles foram inicialmente identificados, ou indicam 33

34 alguma propriedade epidemiológica característica de determinada linhagem (Oliveira et al., 2002). O clone Ibérico foi primeiramente encontrado na Espanha, em 1989, e disseminou-se na Europa e nos EUA. O clone Brasileiro foi detectado entre em um estudo realizado na cidade de São Paulo (Sader et al., 1994) e já disseminou-se nos hospitais brasileiros da região norte até o sul do País e atualmente encontra-se amplamente distribuído por várias regiões do mundo, incluindo outros países da América Latina (Argentina, Chile e Uruguai) e da Europa (República Tcheca e Portugal) (Martins; Cunha, 2007). O clone Húngaro encontrado inicialmente em hospitais da Hungria mais recentemente foi identificado em Taiwan. O clone Nova York/Japão é considerado o clone de MRSA predominante em hospitais da região metropolitana de Nova York e algumas regiões adjacentes, além de ter sido identificado em hospitais do Japão. O clone Pediátrico descrito em hospitais pediátricos de Portugal em 1992 foi depois encontrado na Polônia, EUA, Argentina e Colômbia (Oliveira et al., 2002). A estrutura do elemento mec presente nos isolados representantes dos cinco clones endêmicos, foi caracterizada e os clones foram relacionados com o tipo de SCCmec. O clone Ibérico carreia o SCCmec tipo I e IA. O clone Nova York/Japão carreia o SCCmec tipo II. Os clones Brasileiro e Húngaro carreiam os SCCmec tipo IIIA e III. O SCCmec tipo IV, e em menor proporção o tipo V, foram encontrados no clone Pediátrico (Tabela 1) (Oliveira, 1998). 3.5 Métodos fenotípicos para detecção de resistência Tradicionalmente, a detecção de resistência do Staphylococcus spp à meticilina é realizada pelo método de difusão com discos de oxacilina. Esta droga, representante da classe das penicilina-penicilinase resistente (PRP), é indicada por ser mais resistente à degradação e a mais sensível para detecção de heterorresistência. O CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) recomenda a identificação de isolados meticilina resistentes através de dois testes fenotípicos: (i) difusão em placa de ágar Müeller Hinton contendo disco com 1 µg de oxacilina; (ii) cultivo de uma suspensão bacteriana com turvação de 0,5 da escala McFarland, em ágar Mueller-Hinton suplementado com 4% de NaCl e 6 µg/ ml de oxacilina (screen agar), para a confirmação da resistência. 34

35 O padrão fenotípico de resistência pode ser homogêneo ou heterogêneo. No primeiro, todas as colônias expressam resistência à meticilina sem dificuldades de interpretação do teste. No padrão heterogêneo, somente uma fração de colônias expressa resistência à oxacilina, apesar da presença do gene meca, dificultando a interpretação do teste (Rossi; Andreazzi, 2005). Duas sub-populações podem coexistir na mesma cultura, onde cepas apresentando baixo nível de resistência podem não ser detectadas. Estas cepas apesar de possuírem a informação genética, apresentam in vitro o fenótipo de sensibilidade (Murakami et al., 1991). Kondo et al., (2001) encontraram um novo fenótipo de resistência à meticilina/oxacilina, designado eagle-type, que se caracteriza pela resistência a altas concentrações de meticilina (64 a 512µg/mL) e sensibilidade a baixas concentrações desta droga (2 a 16µg/mL). Segundo eles, tal fenótipo é resultado de mutações responsáveis pela conversão do fenótipo hetero para homogêneo em nível de controle da transcrição do gene meca. Os métodos fenotípicos podem falhar na detecção dessa resistência, uma vez que os resultados podem ser influenciados pelas condições de cultivo, como temperatura, ph e concentração de NaCl do meio. Em 2004, o CLSI passou a recomendar o uso do disco de cefoxitina de 30 µg, para determinar a susceptibilidade à oxacilina. O teste de difusão do disco de cefoxitina constitui uma alternativa para a detecção de resistência ao grupo PRP (oxacilina, meticilina) em Staphylococcus spp e funciona como um marcador fenotípico (NCCLS M100-S15, 2005; Rossi; Andreazzi, 2005). Atualmente, o padrão ouro, na detecção do gene meca que media resistência à meticilina é a amplificação desse gene pela técnica de PCR (Fluit et al., 2001). Contudo, nem todos os laboratórios de microbiologia clínica dispõem desta ferramenta. A utilização do disco de cefoxitina é uma forma de determinar fenotipicamente a resistência mediada pelo gene mec. O teste utilizando cefoxitina apresenta especificidade e sensibilidade para detectar o gene mec de 98.7%/100% respectivamente, quando comparado à PCR. O teste com cefoxitina é recomendado pelo CLSI e leva em consideração que essas cefaminas são melhores indutores de resistência que a própria oxacilina (Swenson, et al., 2007). 35

36 36

37 Amato Neto V, Levi GC. Lopes HM, Mendonça JS, Baldy JLS Antibióticos na prática médica, 5º ed. Editora Rocca, p ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Perfil da suscetibilidade dos microrganismos analise dos dados 2006 e Rede Nacional de monitoramento e controle da resistência microbiana em serviços de saúde (Rede RM), julho de (Acesso em setembro de 2008) Archer GL, Bosilevac JM Signaling antibiotic resistance in Staphylococci. Science 291: Arvidson S, Tegmark K Regulation of virulence determinants in Staphylococcus aureus. Institute Journal Medical Microbiology 291: Brakstad OG, Maeland JA Mechanisms of methicillin resistance in staphylococci. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica 105: Cha J, Vakulenko SB, Mobashery S Characterization of the β-lactam antibiotic sensor domain of the MecR1 signal sensor/transducer protein from methicillin resistant Staphylococcus aureus. Biochemistry 46: Chambers HF The changing epidemiology of Staphylococcus aureus? Emerging Infectious Disease, 7(2): Chang S, Sievert DM, Hageman JC, Boulton ML, Tenover FC, Downes FP, Shah S, Rudrik JT, Pupp GR, Brown WJ, Cardo D, Fridkin SK Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vana resistance gene. New England Journal Medicine 348: CLSI Committee Laborator Standards International Normas de desempenho para teste de sensibilidade antimicrobiana: 15º suplemento informativo, M100-S15. Wayne, Pa, USA, Couto I, Lencastre H, Severina E, Kloos W, Webster JA, Hubner RJ, Sanches IS, Tomasz A Ubiquitous presence of a meca homologue in natural isolates of Staphylococcus sciuri. Microbiology Drug Resistant 2: Dancer SJ The effect of antibiotics on methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal and Antimicrobial Chemotherapy, 61:

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40 Lencastre HA. Resistência aos antibióticos na década de acesso em Lencastre H, Oliveira D, Tomasz A Antibiotic resistant Staphylococcus aureus: a paradigm of adaptive power. Current Opinion in Microbiology 10: Lowy FD Staphyloccus aureus infections. The New England Journal of Medicine 339: Lowy FD Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus. Journal Clinical Investigation 3: Mack D, Davies AP, Harris LG, Rohde H, Horstkotte MA, Knobloch JKM Microbial interactions in Staphylococcus epidermidis biofilms. Analytical and Bioanalytical Chemistry 387: Martins A, Cunha MLRS Methicillin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase negative Staphylococci: epidemiological and molecular aspects. Microbiology and Immunology, 51: MCdonalds LC, Kuehnert MJ, Tenover FC, Jarvis WR Vancomycin-resitant enterococci outside the health-care setting: prevalence, sources and public health implications. Emerging Infections Diseases 3: Mempel M, Feucht H, Ziebuhr W, Endres M, Laufs R, Gruter L Lack of meca transcription in slime-negative phase variants of methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents Chemotherapy 38: Mempel M, Muller E, Hoffmann R, Feucht H, Laufs R, Gruter L Variable degree of slime production is linked to different levels of beta-lactam susceptibility in Staphylococcus epidermidis phase variants. Medical Microbiology Immunology 184: Murakami K, Minamide W, Wada K, Nakamura E, Teraoka H, Watanabe S Identification of methicillin-resistant strains of staphylococcis by polymerase chain reaction. Journal Clinical Microbiology 29: Navarre WW, Schneewind O Surface proteins of gram positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63: Novick RP, Schlievert P, Ruzin A Pathogenicity and resistance islands of staphylococci. Microbes and Infection 3:

41 Novick RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Molecular Microbiology 48: O Gara JP, Humphreys H Staphylococcus epidermidis biofilms: importance and implications. Journal Medical Microbiology 50: O Gara JP ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters 270: Oliveira D, Sanches IS, Mato R Virtually all MRSA infections in the largest Portuguese hospital are caused by two internationally spread multiresistant strains: the Iberian and the Brazilian clones of MRSA. Clinical Microbiology Infectious 4: Oliveira DC, Tomasz A, Lencastre H Secrets of success of human pathogen: molecular evolution of pandemic clones of methicillin resitant Staphylococcus aureus. The Lancet Infectious Disease 2: Philip R, Cohen MD Community-acquired methicillin-resistent Staphylococcus aureus skin infections: a reviews of epidemiology, clinical features, management and prevetion. International journal of Dermatology 46:1-11. Pinho MG, Lencastre H, Tomasz A An acquired and a native penicillin-binding protein cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococcy. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98: Ribeiro A, Dias C, Carvalho MCS, Berquo L, Ferreira FA, Santos RNS, Carvalho BTF, Figueiredo AM First Report of Infection with Community-Acquired Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus in South America. Journal Clinical Microbiology 43: Robinson, DA, Enright MC Evolutionary models of the emergence of methicillinresistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents Chemotherapy 47: Rossi F, Andreazzi D Resistência Bacteriana. Interpretando o antibiograma. Lançamento em 18 de março. Local: Hospital das Clínicas FMUSP. 1º ed. São Paulo: ATHENEU, 1:118. Sader HS, Jones RN, Silva JB Evaluation of interhospital spread of methicillinresistant Staphylococus aureus in São Paulo, Brazil, using pulsed-field gel electrophoresis of chromosomal DNA. Infections Control Hospital Epidemiology 15:

42 Shore A, Rossney AS, Keane CT, Enright MC, Coleman DC Seven Novel Variants of the Staphylococcal Chromosomal Cassette mec in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates from Ireland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 49: Spencer RC Predominant pathogens found in the European Prevalence of Infection in Intensive Care Study. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Disease 15: Swenson JM, Skov R, Patel JB The cefoxitin disk test what a clinical microbiologist needs to know. Clinical Microbiology Newsletters 29: Tenover FC Development and spread of bacterial resistance to antimicrobial agents: on overview. Clinical Infectious Disease 33(5): Vandenesch F, Naimi T, Enright MC, Lina G, Nimmo GR, Heffernan H, Liassine N, Bes M, Greenland T, Reverdy ME, Etienne J Community-acquired methicillinresistant Staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence. Emerging Infection Disease 9: Vuong C, Otto M Staphylococcus epidermidis infections. Microbes and Infection 4: Wielders CL, Vriens MR, Brisse S, De Graaf-Miltenburg LA, Troelstra A, Fleer A, Schmitz FJ, Verhoef J, Fluit AC In-vivo transfer of meca DNA to Staphylococcus aureus. Lancet 357: Wilcox M, Nathwani D, Dryden M Linezolid compared with teicoplanin for the treatment of suspected or proven Gram-positive infections. Journal Antimicrobial Chemotherapy 53: Zhang HZ, Hackbarth CJ, Chansky KM, Chambers HF A proteolytic transmembrane signaling pathway and resistance to β-lactams in Staphylococci. Science 291:

43 43

44 Estudo de cepas de Staphylococcus de origem hospitalar da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil W. L. M. Oliveira 1, P. A. Toniollo 1, E. V. C. Mangueira 1, M. A. Vilela. 2, T. C. Leal Balbino 1, A. M. P. Almeida 1, N. C. Leal 1 1. Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz 2. Laboratório de Bacteriologia, Hospital Universitário Oswaldo Cruz/HUOC do autor de correspondência: nilma.leal@pq.cnpq.br Manuscrito a ser submetido para publicação na revista Journal of Hospital Infection 44

45 Resumo Quarenta e seis amostras de Staphylococcus spp caracterizadas como de infecções nosocomiais em um hospital universitário da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil, foram analisadas quanto a presença e distribuição dos genes meci e mecr1 correlacionando com a susceptibilidade à oxacilina e a presença de genes do complexo ccrab. A maioria dos isolados, tanto os sensíveis quanto os resistentes à oxacilina, possuíam os genes mecr1 e meci e o ccr tipo 3. Nossos dados sugerem que novos tipos de SCCmec ainda não caracterizados podem estar dispersos no hospital de estudo, tanto em isolados de S. aureus como de SCN. Uma deleção de aproximadamente 700 pares de base no gene indutor, mecr1, foi encontrada em 38 amostras (pré-mrs e MRS). Este tipo de deleção ainda não havia sido descrita na literatura em clones hospitalares. Outros estudos são necessários para esclarecer se estas alterações ou rearranjos no gene mecr1, bem como mutações no gene meci constituem uma variante do SCCmec encontrado ou de um novo clone presente em hospitais pernambucanos..introdução Em Staphylococcus a resistência à meticilina é caracterizada pela aquisição de um elemento genético móvel denominado Staphylococcal Cassette Chromossomal mec (SCCmec) que contém dois sítios genéticos importantes: o complexo mec e o complexo ccr. O complexo mec, é considerado um elemento essencial para a resistência à meticilina tanto em S. aureus como em outras espécies estafilocócicas sendo formado estruturalmente pelo gene meca, responsável pela expressão de uma proteína conhecida como PBP 2a ou PBP 2 1 com reduzida afinidade de ligação a componentes β- lactâmicos, 2 e seus reguladores meci (repressor) e mecr1 (indutor). Embora a sequência do gene meca seja conservada em todas as amostras resistentes à meticilina, algumas cepas podem apresentar variação quanto a presença dos genes reguladores envolvidos na expressão da resistência à meticilina 3, 4. A mobilidade do SCCmec deve-se à presença de genes que codificam recombinases permitindo a integração e excisão do SCCmec no genoma estafilocócico. Esses genes fazem parte do complexo ccr e apresentam três alótipos mais comuns (ccrab1 a ccrab3) e dois alótipo mais raros (ccrab4 e ccrc) 5, 6, 7. 45

46 A estrutura e sequência de nucleotídeos de ambos os complexos definem o tipo de SCCmec, sendo atualmente descritos sete tipos 7. Cepas carreando o SCCmec tipo III e IV tem sido responsáveis pela grande maioria dos processos infecciosos na região Sul do Brasil 8. A proposta do nosso estudo foi determinar a presença e distribuição dos genes meci e mecr1 correlacionando com a susceptibilidade à oxacilina além de caracterizar o tipo de complexo ccrab presente em amostras relacionadas à infecção nosocomial na cidade de Recife, Pernambuco, Brasil. Material e métodos Bactérias utilizadas e extração do DNA As análises foram realizadas em 46 amostras de Staphylococcus spp obtidas de pacientes do Hospital Universitário Oswaldo Cruz na cidade de Recife, Pernambuco, Brasil, caracterizadas como de infecção hospitalar e identificadas por métodos microbiológicos clássicos no laboratorio de bacteriologia do hospital. Em seguida as amostras foram conservadas a -80 C em BHI (HIMEDIA) com 20% de glicerol, no Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM/Fiocruz). Para as análises as amostras foram reativadas por inoculação em caldo BHI e incubadas por h a 37ºC. O DNA foi extraído seguindo o protocolo descrito por Freitas et al. 9 e quantificado em espectrofotômetro (Biotech Photometer modelo UV1101). Susceptibilidade à oxacilina O perfil de susceptibilidade foi investigado em isolados que apresentaram o gene meca (dados não mostrados), seguindo as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 10 com teste de disco difusão utilizando discos de oxacilina (1µg) e cefoxitina (30µg) e crescimento em ágar Müeller Hinton suplementado com 4% de NaCl e 6 µg/ml de oxacilina a partir de uma suspensão das colônias com turvação equivalente a 0,5 McFarland. A leitura dos resultados foi realizada após incubação a 35 C por 24 horas. Como controles foram utilizados as cepas de S. aureus ATCC e ATCC

47 Detecção por PCR dos genes mecr1, meci e ccr Os primers utilizados para amplificação dos genes mecr1 e meci são mostrados na tabela 1. Para amplificação do gene mecr1 foram empregadas três combinações de primers: (1) SA-17/SA-15 para amplificação do domínio PB (ligação à penicilina); (2) SA-14/SA-18 para a região MS (porção transmembrana da proteína); (3) SA-17/SA-18, com sítios de hibridização nas extremidades do gene (tabela 1). As reações foram realizadas individualmente para cada gene, em um volume final de 25 µl por tubo, contendo 20 pmol de cada primer, dntp 200 µm, 1 U de Go Taq DNA polymerase (Promega, Brasil), 5 µl de tampão Green Go Taq (Promega, Brasil), MgCl 2 1,5 mm e 20 ng de DNA. As reações foram realizadas em termociclador (Biometra), nas seguintes condições: 94 C por 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 C por 1 min, 55 por 1 min, 72 C por 1 min e uma extensão final a 72 C por 10 min. Os produtos amplificados (5 µl) foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% com brometo de etídio (2,5 mg/ml), visualizados em transluminador UV e digitalizados usando o software KODAK 1D versão (Scientific Imaging Systems, U.S.A). Como marcador de peso molecular foi utilizado o 100bp DNA ladder (Invitrogen, Brasil). Sequenciamento dos genes amplificados Os fragmentos amplificados foram purificados utilizando PureLink TM PCR Purification kit (Invitrogen, Brasil) e analisados em um sequenciador ABI3100 (Aplied Biosystems, USA). As sequências consenso de cada amostra foram comparadas com sequências publicadas no GenBank através da ferramenta BLAST versão Resultados Das 46 amostras analisadas, 28 eram S. aureus e 18 Staphylococcus Coagulase Negativo (SCN). Vinte e nove amostras se revelaram sensíveis à oxacilina (20 S. aureus e 09 SCN) e 17 resistentes (08 S. aureus e 09 SCN). Exceto duas amostras de SCN resistentes à oxacilina, 44 isolados amplificaram o fragmento esperado de 480 pares de bases (pb) para o gene meci. Das três combinações de primers empregadas para análise do gene mecr1 o fragmento de 746pb esperado para o domínio PB (ligação à penicilina) foi amplificado em todas as amostras. O segmento de 537pb foi amplificado em 40 isolados com os primers direcionados para a região MS (porção transmembrana da proteína). Em 06 amostras não houve amplificação. Com a combinação de primers SA-17/SA-18, que 47

48 hibridizavam nas extremidades do gene, houve amplificação em 41 amostras. Destas, apenas três amostras amplificaram o segmento esperado de 1.825pb, 38 amplificaram um fragmento menor que o esperado, com aproximadamente 1.100pb (figura 1) e em cinco amostras não houve amplificação. Com os primers dirigidos aos genes ccrab houve amplificação apenas de um fragmento de aproximadamente 873pb correspondente ao gene ccra3, em todos os isolados. Com os primers dirigidos ao gene ccrab2 e ccrab1 não houve amplificação. A comparação das sequências utilizando o software Blast mostrou homologia de 99%, 98% e 100%, respectivamente com os genes meci, mecr1 e ccra3. A comparação das sequências dos fragmentos de 1.100pb e 1.825pb do gene mecr1 identificou um segmento homólogo de 530pb que quando comparado por meio do software Blast revelou uma identidade de 98% com a sequência da cepa de S. aureus N315. Discussão Em amostras pré-mrs, a presença e expressão do gene meci resulta na repressão da síntese de PBP2 14. A reação de PCR em quarenta e seis amostras de Staphylococcus spp utilizando primers dirigidos ao gene repressor (meci) apontou amplificação em quarenta e quatro amostras. Apesar da presença do gene meci, quinze isolados mostraram resistência à meticilina sugerindo mutações nos genes meca e/ou meci, na região operadora de ligação da proteína MecI (RBS) 15, 16, 17. A sensibilidade à meticilina das outras vinte e nove amostras pode estar associada à expressão do gene meci. Duas amostras de SCN resistentes foram negativas para o gene meci. As análises realizadas utilizando primers direcionados para os domínios de ligação à penicilina (PB) e transmembrana (MS), do gene mecr1, resultaram na amplificação dos segmentos do tamanho esperado na maioria das amostras. Nas reações utilizando primers externos com sítios de anelamento na extremidade do gene mecr1, o amplicon esperado de 1.825pb foi observado em apenas três amostras. Quarenta e três isolados amplificaram um segmento de 1.100pb, revelando uma deleção de cerca de 700pb tanto em amostras sensíveis como resistentes. Deleções nos domínios PB ou MS dentro do gene indutor mecr1 foram descritos em alguns complexos mec (classe B, C, D e E) e algumas vezes os segmentos deletados são substituídos por sequências de inserção (IS s) 18. Entretanto a deleção de 700pb encontrada neste trabalho não se 48

49 enquadra nos esquemas de complexo mec descritos na literatura, não tendo ainda sido descrita em clones hospitalares até o momento. Nossos resultados mostram a conservação no alelo ccra3 tanto em S. aureus quanto em SCN sugerindo transferência horizontal do gene, como observado por Hanssem et al., em diversas espécies de Staphylococcus da mesma área geográfica. Por outro lado os dois tipos observados para o complexo mec de acordo com a amplificação do gene mecr1, contradiz a sugestão de transferência horizontal e aponta para transferência independente tanto do complexo ccr, como do complexo mec e sugere um novo arranjo nessa região em MRSA e MRSCN nas cepas estudadas. 12. Outros estudos são necessários para esclarecer se estas alterações ou rearranjos no gene mecr1, bem como mutações no gene meci constituem uma variante do SCCmec ou de um novo clone presente em hospitais pernambucanos. Referências Bibliográficas 1. Brakstad, OG, Maeland, JA. Mechanisms of methicillin resistance in staphylococci. APMIS : Goldstein, F, Perutka, J, Cuirolo, A, Plata, K, Faccone, D, Morris, J, Sournia, A, Kitzis, MD, Ly, A, Archer, G, Rosato, AE. Identification and phenotypic characterization of a beta-lactam-dependent, methicillin resistant Staphylococcus aureus strain. Antimicrob Agents Chemother : Suzuki, E, Hiramatsu, K, Yokota, T. survey of methicillin-resistant clinical strains of coagulase negative staphylococci for meca gene distribution. Antimicrob Agents Chemother : Archer, GL, Bosilevac, JM. Signaling antibiotic resistance in Staphylococci. Science : Oliveira, DC, Tomasz, A, Lencastre, H. The evolution of pandemic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: identification of two ancestral genetic backgrounds and the associated mec elements. Microbiology Drug Resistant : Ito, T, Ma, XX, Takeuchi, F, Okuma, K, Yuzawa, H, Hiramatsu, K. Novel type V staphylococal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrc. Antimicrob agents Chemother :

50 7. Deurenberg, RH, Stobrering, EE. The evolution of Staphylococcus aureus. Infect Genetics Evolut, 2008 doi: /j.meegid Ribeiro, A, Dias, C, Carvalho, MCS, Berquo, L, Ferreira, FA, Santos, RNS, Carvalho, BTF, Figueiredo, AM. First Report of Infection with Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in South America. J Clin Microbiol : Freitas, MFL, Luz, IS, Silveira-Filho, VM, Junior, JWP, Stamford, TLM, Mota, RA, Sena, MJ, Almeida, AMP, Balbino, VQ, Leal-Balbino, TC. Staphylococcal toxin genes in strains isolated from cows with subclinical mastitis. Pesq Vet Bras (12): Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Normas de desempenho para teste de sensibilidade antimicrobiana: 15º suplemento informativo, M100-S15. Wayne, Pa, USA, Petinaki, E, Arvaniti, A, Dimitracopoulos, G, Spiliopoulou, I. Detection of meca, mecr1 and meci genes among clinical isolates of methicillin-resistant staphylococci by combined polymerase chain reactions. Jl Antimicrob Chemother : Hanssen, AM, Kjeldsen, G, Sollid, JU. Local variants of staphylococcal cassette chromosome mec in sporadic methicillin resistant Staphylococcus aureus and methicillin resistant coagulase-negative staphylococci : evidence of horizontal gene transfer? Antimicrob Agents Chemother : Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Molecular Biol : Lewis RA, Dyke KGH. MecI repress synthesis from the β-lactamase operon of Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother, : Niemeyer DM, Pucci MJ, Thanassi JA, Sharma VK, Archer GL. Role of meca transcriptional regulation in the phenotypic expression of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. J Bacteriol, : Rosato AE, Craig WA, Archer GL. Quantitation of meca transcription in Oxacillinresistant Staphylococcus aureus clinical isolates. J Bacteriol, :3446: Katayama Y, Zhang HZ, Chambers HF. PBP2a Mutations producing very-highlevel resistance to beta-lactams. Antimicrob Agents Chemother : Katayama, Y, Teruyo, I, Hiramatsu, K. Genetic organization of the chromosome region surrounding meca in clinical Staphylococcal strains: role of IS431-mediated 50

51 meci deletion in expression of resistance in meca-carrying, low-level methicillinresistant Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother :

52 Figura 1. Amplificação do gene mecr1 com os primers SA-17/SA-18. Linhas 1 e 2 a esquerda: fragmentos de aproximadamente 1.100pb do gene mecr1; Linhas 1 e 2 a direita: fragmentos de 1.800pb do gene mecr1. M: marcador de peso molecular (100 bp DNA ladder). 52

53 mecr1 mecr1 a Tabela I. Primers utilizados para amplificação de mecr1, mec1 e ccr Alvo e Primer Seqüências (5-3 ) Produto esperado (bp) Referências SA-18 SA 17 SA 15 SA 17 mecr1 b SA 18 SA 14 meci SA-09 SA-10 ccra2 ccra2f ccra2r ccrb2 ccrb2f ccrb2r ccra3 ccra3f ccra3r ccra1 ccra1f ccra1r a Domínio PB (ligação à penicilina) b Domínio MS (porção transmembrana da proteína) atc ctc ctt ata taa gac tac cgc tca gaa att tgt tgt gc caa gca ccg tta cta tct gc cgc tca gaa att tgt tgt gc atc ctc ctt ata taa gac tac gtc gtt cat taa gat atg acg aat ggc gaa aaa gca caa ca gac ttg att gtt tcc tct gtt cga act tga atc aga taa cat tgg a tgt gaa tgg ttt caa tat agg ggt a cgt gtc ggt atc tat gta cgt gtt tc ctt gat ttt ctt gat tga cgt gtg cac aat att caa aat atc caa tac ctg aça tgt agc taa gac ttg aac t atc agc ttg gcc gaa cta gaa tc cag ctg ctc gtg att gag tgt ag

54 54

55 Avaliação da formação de biofilme e da diversidade genética de cepas de Staphylococcus isoladas de infecção nosocomial W. L. M. Oliveira 1, P. A.Toniollo 1, E. V. C. Mangueira 1, M. A. Vilela. 2, T. C. Leal Balbino 1, A. M. P. Almeida 1, N. C. Leal 1 3. Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz 4. Laboratório de Bacteriologia, Hospital Universitário Oswaldo Cruz/HUOC do autor de correspondência: nilma.leal@pq.cnpq.br Manuscrito a ser submetido para publicação na revista Journal of Hospital Infection 55

56 Resumo As análises realizadas em 46 amostras de Staphylococcus spp obtidas de infecções nosocomiais (17 resistentes à meticilina e 29 sensíveis todas carreando o gene meca e desta forma consideradas como MRS e pré-mrs, respectivamente), quanto à capacidade para formar biofilme in vitro, presença dos genes icaa e icad e a relação clonal entre elas mostraram que a habilidade para formar biofilme nem sempre está associada à presença ou mesmo à transcrição dos genes icaad, principalmente nos MRS. Portanto a presença dos genes icaa e icad não constitui marcador molecular eficaz para diferenciar isolados produtores de biofilme dos não produtores sendo recomendável associar a detecção molecular dos genes ica com a prova fenotípica de determinação da produção de biofilme. A avaliação da relação gênica dos isolados revelou grande diversidade tanto entre os pré-mrs quanto entre os MRS. Uma maior similaridade, ainda que discreta, foi observada entre as amostras sensíveis, com a prevalência de alguns clones, dentro do hospital. A diversidade dos perfis obtidos por meio do PFGE sugere uma origem diversa, provavelmente comunitária. Palavras chaves: Biofilme, operon ica, meca, PFGE Introdução Staphylococcus estão habitualmente presentes na microflora da pele e mucosa humana e se comportam como patógenos oportunistas nosocomiais responsáveis por complicações infecciosas, após implantação de dispositivos protéticos. A capacidade de aderir e colonizar materiais inertes mediante a formação de biofilme confere à bactéria, proteção contra defesas do hospedeiro e a agentes antimicrobianos, o que dificulta o tratamento, podendo levar à infecção crônica, que atua como foco para sepse aguda e morte, especialmente em pacientes imunocomprometidos 1, 2, 3. Em Staphylococcus a formação do biofilme ocorre em duas etapas, inicialmente as células se fixam no substrato sólido formando uma monocamada, seguida por adesão célula a célula pela produção de exopolissacarídeos, formando então o biofilme maduro 3,4. O mecanismo mais conhecido de produção de biofilme é dependente da produção de uma adesina conhecida como PIA (Polysaccharide Intercellular Adhesin) ou PNAG (Polymeric N-acetyl-glucosamine) codificada pelo operon icaadbc e influenciada por um sistema de regulação variável o qual é afetado por condições 56

57 ambientais 6. Assim a detecção dos genes icaa e icad passou a ser utilizada como marcador molecular do biofilme 11. A capacidade de formar biofilme é comumente avaliada por testes fenotípicos 7, 8, mas in vitro as condições de crescimento, como níveis de CO 2, anaerobicidade, estresse osmótico, concentrações de glicose e NaCl, podem influenciar os resultados 9, 10. A importância do biofilme, considerado como fator importante na patogênese da infecção estafilocócica 5, aumenta quando está associado à reduzida susceptibilidade a antimicrobianos, uma vez que o controle da infecção exige concentrações de antibióticos mais elevadas. A identificação de cepas produtoras ou não de biofilme pode guiar a terapia e impedir que pacientes sejam tratados com antibióticos de última geração, que aumenta o custo e seleciona cepas resistentes 1. A proposta deste trabalho foi analisar isolados de Staphylococcus spp associados à infecção hospitalar, quanto à capacidade para formar biofilme in vitro, presença dos genes icaa e icad e a relação clonal entre eles. Material e Métodos Bactérias utilizadas e extração do DNA As análises foram realizadas em 46 amostras de Staphylococcus todas carreando o gene meca (dados não mostrados), sendo 17 resistentes à meticilina (MRS) e 29 sensíveis (pré-mrs), obtidas de pacientes de infecção hospitalar do Hospital Universitário Oswaldo Cruz na cidade de Recife, Pernambuco, Brasil (Tabelas I e II). As amostras foram mantidas a -80 C em BHI (brain heart infusion, HIMEDIA) com 20% de glicerol, no Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM/Fiocruz) e para o trabalho foram reativadas por inoculação em BHI e incubadas por h a 37ºC. O DNA foi extraído seguindo o protocolo descrito por Freitas et al. 12 e quantificado em espectrofotômetro (Biotech Photometer modelo UV1101). Como controles foram utilizados as cepas de S. aureus ATCC e ATCC

58 Produção de Biofilme A habilidade para formar biofilme foi avaliada por cultivo em Agar Vermelho Congo (CRA) segundo Freeman et al. 7 As culturas foram incubadas em condições aeróbicas por 24 h a 37ºC e em seguida mantidas em temperatura ambiente por mais 18 horas sendo as colônias vermelho escuro ou enegrecido com consistência seca ou cristalina consideradas produtoras de biofilme e as colônias vermelhas com aspecto liso e escurecido no centro, não produtoras. Detecção dos genes icaa e icad Para a amplificação dos genes icaa e icad do operon icaadbc, foram utilizados os primers descritos por Vansudevan et al. 13 As reações foram realizadas individualmente em um volume final de 25 µl contendo 20 pm de cada primer, dntp 200 µm, 1U de Go Taq DNA polimerase (Promega, Brasil), 5 µl do tampão Green Go Taq DNA polimerase (Promega, Brasil), MgCl 2 1,5 mmol e 20 ng de DNA em termociclador (Biometra) nas seguintes condições: 94 C por 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 C por 1 min, 55 por 1 min e 72 C por 1 min e uma extensão final a 72 C por 10 min. Os produtos amplificados (5 µl) foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% com brometo de etídio (2,5mg/mL), visualizados em luz UV e digitalizado através do software KODAK 1D versão (Scientific Imaging Systems, U.S.A.). Análise transcricional (RT-PCR) Para extração do RNA total, 1 ml da cultura crescida a 37 C por 24 horas em BHI, foi centrifugado e o sedimento ressuspenso em TE 10:1. Utilizou-se lisozima (20 mg/ml) e lisostafina (20 mg/ml) para a lise das células. O RNA foi purificado com Trizol, precipitado com isopropanol e ressuspenso em H 2 O DEPC com DNAse. A transcrição reversa foi realizada utilizando a enzima Superscript III (Invitrogen, Brasil), e primers randômicos (Invitrogen, Brasil). A reação foi realizada em volume final de 20µL contendo: 100 ng de RNA, 20 pmol de cada primer e 1 µl de dntp 10 mm. A reação foi desnaturada a 65 C por 5 min, resfriada no gelo por 1 min e adicionados 4µL do tampão de transcrição (5X) que acompanha a enzima contendo: 1 µl dtt 0,1M, 1 µl RNAse out e 1 µl Superscript III seguido de homogeneização e incubação a 50ºC por 60 min, inativação por aquecimento a 75 C por 15 min e estocados a -80 C. Como controles negativos, foram realizadas reações com e sem a Superscript III, adicionando 58

59 H 2 O DEPC nos tubos sem Superscript III. Para amplificação do cdna transcrito foram utilizados os mesmos primers para icaa e icad e condições utilizados na PCR. PFGE A preparação dos plugs de DNA cromossômico foi realizada segundo Bannerman et al. 14 utilizando agarose low melting (Sigma). O DNA presente nos plugs foi digerido com 20U de SmaI (New England Biolabs) a 37 C durante 18h e os fragmentos separados utilizando o sistema CHEF DR III (Bio-Rad) programado para 5 pulsos iniciais de 15s e 15 pulsos finais de 60s. O ângulo da corrente elétrica no campo foi de 120º e a força aplicada foi de 4.5 V/cm, com um tempo total de 23,5h. Como marcador de peso molecular foi utilizado o Lambda ladder PFG Marker (New England BioLabs). Os géis foram corados com brometo de etídio (1 mg/ml) e as imagens capturadas sob iluminação UV pelo software KODAK 1D versão (Scientific Imaging Systems, U.S.A). Interpretação do padrão de bandas Os perfis obtidos por PFGE nas amostras dos dois grupos (MRS e pré-mrs) foram analisados utilizando o software GelcomparII 4.1 (Applied Maths, Bélgica). Para determinação da similaridade entre os padrões gerados foi construída uma matriz de similaridade utilizando o coeficiente de Dice. 15 A correlação para agrupamento foi calculada por UPGMA, com tolerância de posicionamento entre as bandas de 1,5%. Perfis de PFGE com mais de 60% de similaridade foram definidos neste estudo como expansão do mesmo grupo. Resultados Entre as 46 amostras analisadas, 32 amostras se revelaram capazes de produzir biofilme em CRA e 14 amostras não produziram biofilme (Tabela I e II). Os fragmentos do tamanho esperado para icaa (1.315 pb) e para icad (381 pb) foram amplificados em 42 amostras (Figura 1); em uma amostra de SCN houve amplificação de icaa mas icad não foi amplificado; em duas amostras (um S. aureus e um SCN) ocorreu o contrário: houve amplificação de icad mas icaa não foi amplificado; e em uma amostra de SCN não houve amplificação de nenhum dos dois genes. 59

60 Dez isolados (07 SCN e 03 S. aureus) foram analisados por RT-PCR, sendo observada a transcrição dos dois genes em apenas um S. aureus; três isolados (2 S. aureus e 1 SCN) foram positivos para icad e negativos para icaa e em seis amostras de SCN não houve transcrição de nenhum dos dois genes (Tabelas I e II). Pelas análises dos perfis obtidos por PFGE as 29 amostras sensíveis à oxacilina (pré-mrs) geraram 24 perfis distribuídos em onze grupos e quatro subgrupos (Figura 3) e os 17 isolados MRS geraram 15 perfis distribuídos em 09 grupos (Figura 2). Discussão No presente estudo foi observada a formação de biofilme in vitro no meio CRA, sem adição de glicose ou NaCl, e a amplificação dos genes icaa e icad por amostras sensíveis e resistentes à meticilina. Segundo O Neil et al 10 o NaCl é um ativador transcricional do operon icaadbc 5 induzindo a formação do biofilme em amostras sensíveis à meticilina. A evidência da formação de biofilme in vitro na ausência de adição de NaCl nas nossas amostras se reveste de grande importância prática, desde que sugere um mecanismo independente de ica contrariando a recomendação da detecção da presença de icaa e icad como marcador molecular da produção de biofilme. Nas amostras resistentes (MRS) a produção de biofilme é considerada independente do operon ica e seria induzida por glicose 10 ou sacarose 7. Em nosso estudo, uma amostra MRS, icad negativa e sem transcrição de icaa e icad produziu biofilme em CRA. Adcionalmente uma amostra pré-mrs sem transcrição de icaa ou icad também produziu biofilme em CRA evidenciando um mecanismo de produção independente de ica como ocorre em S. aureus e SCN. Por outro lado, não houve produção de biofilme em doze amostras resistentes e icaad positivo embora o meio CRA utilizado tivesse 5% de sacarose. Apesar da maioria das amostras analisadas por RT-PCR produzir biofilme in vitro no meio CRA, a transcrição dos dois genes (icaa e icad) ocorreu em apenas um S. aureus e a de icad em dois S. aureus e um SCN confirmando a capacidade de produção de biofilme na ausência dos genes icaa e icad como observado anteriormente por O Neill et al. 10. Esses resultados não permitem afirmar que a formação de biofilme in vitro seja dependente de ica nas amostras sensíveis à meticilina ou independente de ica nas 60

61 resistentes. A incapacidade de formação de biofilme nas amostras resistentes à meticilina apesar da amplificação de icaad pode ser atribuída a mutações nesses genes ou a outros fatores que influenciam também na resistência. Outros estudos do operon ica são necessários para identificar alterações nos genes estruturais ou no seu regulador (icar), desde que é necessária a presença do operon intacto para produção de biofilme 4. A avaliação da relação gênica dos isolados realizada pela técnica de PFGE revelou grande diversidade tanto entre os isolados sensíveis (pré-mrs) quanto entre os resistentes (MRS) à meticilina, com maior similaridade, ainda que discreta, entre as amostras sensíveis com a prevalência de alguns clones dentro do hospital. Apesar das amostras analisadas serem de origem hospitalar obtidas de pacientes considerados de risco para colonização (UTI, próteses, cateter intravascular, injúrias de pele), a diversidade dos perfis obtidos por meio do PFGE sugere uma origem diversa, provavelmente comunitária, fato também observado por Layer et al. 19, em estudo de cepas MRSA responsáveis por infecções adquiridas em hospital. Em conclusão, embora a presença dos genes icaa e icad seja considerada marcador de virulência para separação de isolados de Staphylococcus comensais dos invasivos 16,17,18 nossos resultados mostram que nem a presença desses genes e nem mesmo a evidência de sua transcrição é um critério seguro para separação de isolados de Staphylococcus produtores de biofilme dos não produtores e fica evidenciada, a necessidade de associar métodos moleculares para detecção dos genes ica com o teste fenotípico do cultivo em CRA para determinação da capacidade de produção de biofilme. Além disso, é importante definir a origem das cepas para orientar condutas hospitalares de controle de infecções. No caso observado, em que múltiplos clones circulam no hospital, o monitoramento da flora normal da equipe médica e do paciente, antes de ser submetido a procedimentos poderia minimizar a presença de cepas potencialmente resistentes. 61

62 Referências Bibliográficas 1. Gristina, AG. Biomaterial-Centered Infection: Microbial Adhesion Versus Tissue Integration. Science, : Barth, E, Myrvik, QM, Wagner, W, Gristina, AG. In vitro and in vivo comparative colonization of Staphycoloccus aureus and Staphycoloccus epidermidis on orthopaedic implant materials. Biomaterials : Ferretti, G, Mandalà, M, DiCosimo, S, Moro, C, Curigliano, G, Barni, S. Catheterrelated bloodstream infections, Part1: pathogenesis, diagnosis, and management. Cancer Control, : O Gara, JP, Humphreys, H. Staphylococcus epidermidis biofilms: importance and implications. J Med Microbiol, : Mack, D, Davies, AP, Harris, LG, Rohde, H, Horstkotte, MA, Knobloch, JKM. Microbial interactions in Staphylococcus epidermidis biofilms. Anal Bioanal Chem, : O Gara, JP. ica and beyond? Biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Letters, : Freeman, DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol, : Ziebuhr, W, Heilmann, C, Gotz, F, Meyer, K, Wilms, K, Straube. E, Hacker, J. Detection of the intercellular adhesion gene cluster (ica) and phase variation in Staphylococcus epidermidis blood culture strains and mucosal isolates. Infect Immun, : Fitzpatrick, F, Humphreys, H, O Gara, JP. Evidence for icaadbc-independent Biofilm Development Mechanism in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Clinical Isolates. J Clin Microbiol, 2005a 43: O Neil, E, Pozzi, C, Houston, P, Smyth, D, Humphreys, H, Robinson, DA, O Gara, JP. Association between methicillin susceptibility and biofilm regulation in Staphycoloccus aureus isolates from device-related infections. J Clin Microbiol, : Galdbart, JO, Allignet, J, Tung, HS, Ryden, C, El Solh, N. Screening for Staphylococcus epidermidis markers discriminating between skin-flora strains and those responsible for infections of joint protheses. J Infect Dis, :

63 12. Freitas, MFL, Luz, IS, Silveira-Filho, VM, Junior, JWP, Stamford, TLM, Mota, RA, Sena, MJ, Almeida, AMP, Balbino, VQ, Leal-Balbino, TC. Staphylococcal toxin genes in strains isolated from cows with subclinical mastitis. Pesq Vet Bras 2008, 28(12): Vasudevan, P, Nair, MKM, Annamalai, T, Venkitanarayanan, KS. Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation. Vet Microbiol, : Bannerman, TL, Hancock, GA, Tenover, FC, Miller, JM. Pulsed-field gel electrophoresis as a replacement for bacteriophage typing of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, : Dice, LR. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology, : Arciola, CR, Baldassairi, L, Montanaro, L, Presence of icaa and icad genes and slime production in a collection of staphylococcal strains from catheter-associated infections. J Clin Microbiol : Fitzpatrick, F, Humphreys, H, O Gara, JP. The genetics of staphylococcal biofilm formation will a greater understanding of pathogenesis lead to better management of device-related infection? Clin Microbiol Infect, 2005b 11: Frank, KL, Hanssen, AD, Patel, R. icaa is not a useful diagnostic marker for prosthetic joint infection. J Clin Microbiol, : Layer, F, Ghebremedhin, B, König, W, König, B. Heterogeneity of Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus Strains at a German University Hospital Implicates the Circulating-Strain Pool as a Potential Source of Emerging Methicillin-Resistant S. aureus Clones. J Clin Microbiol, :

64 Figura 1. Gel de agarose 1% representativo das amplificações por PCR dos genes icaa e icad. Esquerda, linhas 1 e 2: segmentos de 1315pb. Direita, linhas 1 e 2: segmentos de 381pb. Linha M, marcador molecular: 100pb DNA ladder. 64

65 Figura 2. Dendrograma ilustrando a similaridade entre os perfis genotípicos obtidos por PFGE entre as 17 amostras resistentes à meticilina. 65

66 Figura 3. Dendograma ilustrando a similaridade entre os perfis genotípicos obtidos por PFGE entre as 29 amostras sensíveis à oxacilina. 66

67 Tabela I.Origem das amostras analisadas, produção de biofilme, amplificação e transcrição do operon icaad e os perfis genotípicos obtidos por PFGE 67

68 continuação 68

69 Tabela II. Origem das amostras analisadas, produção de biofilme, amplificação e transcrição do operon icaad e os perfis genotípicos obtidos por PFGE Origem das amostras Nº/Ano Espécie Unidade do hospital Produção de Amplificação RT-PCR Perfis de biofilme de icaa/d icaa/d PFGE 162/02 SCN Centro de oncologia +/+ + -/- G1 227/02 S. aureus Pré e pós-operatório cardíaco +/+ + -/- F 236/02 S. aureus Doenças infecciosas e parasitárias +/+ - nt C 237/02 SCN Unidade terapia intensiva cardiológica +/+ + nt A1 794/03 S. aureus Cirurgia geral e transplante -/+ - -/+ G2 804/03 SCN Pré e pós-operatório cardíaco +/- + -/- nt 853/03 S. aureus Unidade terapia intensiva cardiológica +/+ - nt G3 09/04 SCN Centro de oncologia -/+ - -/+ H1 12/04 SCN Unidade terapia intensiva cardiológica +/+ - nt nt 13/04 SCN Unidade terapia intensiva cardiológica +/+ - nt H2 38/04 S. aureus Pré e pós-operatório cardíaco +/+ + nt D 70/04 SCN Doenças infecto-contagiosas +/+ - nt I 412/04 SCN Clinica pneumológica +/+ - nt nt 464/04 S. aureus Doenças infecciosas e parasitárias +/+ - nt E3 710/04 S. aureus Doenças infecciosas e parasitárias +/+ - nt E1 969/04 S. aureus Unidade terapia intensiva geral +/+ - nt E2 992/04 SCN Centro de oncologia +/+ - -/- B 69

70

71 Uma deleção de ~ 700 pb no gene indutor mecr1 foi encontrada nas amostras pré-mrs e MRS ainda não descrita na literatura no clone epidêmico Brasileiro ou mesmo em clones hospitalares. Outros estudos são necessários para esclarecer se estas alterações ou rearranjos no gene mecr1, bem como mutações no gene meci constituem uma variante do SCCmec ou de um novo clone presente em hospitais pernambucanos. A habilidade para formar biofilme nem sempre está associada à presença, nem mesmo à transcrição dos genes icaad, principalmente nos MRS. A presença dos genes icaa e icad não constitui marcador molecular eficaz para diferenciar isolados produtores de biofilme dos não produtores. É recomendável associar a detecção molecular dos genes ica com a prova fenotípica de produção de biofilme. Foi encontrada grande diversidade clonal tanto entre os pré-mrs quanto entre os MRS, com maior similaridade entre as amostras sensíveis com a prevalência de alguns clones dentro do hospital. A diversidade dos perfis obtidos sugere que essas cepas tenham origem diversa, talvez comunitária. ii

72 iii

73 Journal of Hospital Infection Instructions for Authors Contributions should be submitted online at Manuscripts must be accompanied by a letter signed by the corresponding authors indicating that all named authors have seen and agreed to the submitted version of the paper; that all who are included in the acknowledgements section, or as providers of personal communications, have agreed to those inclusions; and that the material is original, unpublished and has not been submitted elsewhere. Any previous or pending publication of the material in conference proceedings, letters to journals and brief communications etc. must be declared. All Authors must declare whether there are any potential conflicts of interest and any sources of funding. A fax number and address must be provided to aid rapid processing of manuscripts. Authors should retain a copy of all material as the editors cannot accept responsibility for loss. The Journal will consider for publication Original Articles in English on all aspects of hospital infection as well as Leading Articles and longer Review Articles on subjects of current interest. The journal would not usually publish papers over 8 pages in the journal. This equates to approximately 4000 words in total, which includes summary, text, acknowledgements and references. Each figures and/or tables present will reduce the word count permitted by 200 words. Suitable review articles will be required to provide a few questions and answers for Continuing Professional Development (CPD). The correspondence section will include letters discussing topics raised by papers already published either in the Journal of Hospital Infection or elsewhere, or on other matters of interest. Brief accounts of new observations may also be presented as letters. The journal will endeavour to achieve rapid publication of correspondence if these contain new observations. Letters should contain up to 800 words, no more than one table or figure and up to 8 references. Case reports are not normally published unless they illustrate some exceptional point in the field of infection control. When published, case reports usually appear as a letter to the Editor. A list of language and copyediting services to authors who need assistance before they submit their article for peer review or before it is accepted for publication can be found at: Arrangement and format of original articles These would normally comprise the following sections in the order given: Title Page. This should show the title, names of all authors (but not their degrees) and the name of the institution or department where the work was done, as well as the name and address of the author to whom the proofs and correspondence should be sent. A running title not exceeding 40 characters and spaces should be provided on the title page. Summary. This should explain briefly what was done, what was observed and what was concluded'. Do not include subheadings within the summary. Summaries should not exceed 250 words. Introduction. A brief statement outlining the purpose and context of the paper, but leaving discussion for the Discussion section. iv

74 Methods. Results. A statement of results, without discussion of their significance or relationship to those of others. Information may be conveyed in text or in figures or tables but not in both. Discussion. Acknowledgements. Authors should acknowledge help received in carrying out the work reported, e.g. supply of bacterial strains, permission to study patients, phage or biotyping of strains, according to accepted custom. When the work included in a paper has been supported by a grant from any source this must be indicated. References. References should comply with the Vancouver style. For a full explanation of this see the Br Med J 1988; 286: In the text, references must be consecutively numbered in the order in which they are first mentioned, and must be identified by superscript arabic numerals, after punctuation, e.g. it has been reported 3, or as noted by Smith. 4 The quoted references should be listed in numerical (not alphabetical) order at the end of the article. References cited in tables or in figure legends should be numbered sequentially according to the first mention in the text of the particular table or illustration. Lists of authors should be given for up to six authors; list the first three for seven or more and add et al. Authors are responsible for the accuracy of references and for ensuring that references given in the text comply with those in the list of references. Journal book and chapter references should be set out as below: Journals 1. Fallon RJ. Nosocomial infections with Legionella pneumophila. J Hosp Infect 1980; 1: Books and chapters 1. Washington JA, Barry AL. Dilution test procedures. In: Lennette EH, Spaulding EH Truant JP, Eds. Manual of Clinical Microbiology, 2nd edn. Washington, DC: American Society for Microbiology 1979; Titles of journals should be abbreviated in accordance with Index Medicus (see list printed annually in the January issue of Index Medicus). Whenever possible, please include the digital object identifier (DOI), if noted, from the article s title page. Please note the following examples: 1. Russell AD, McDonnel G. Concentration: a major factor in studying biocidal action. J Hosp Infect 2000; 44: 1 3. doi: /jhin Jacobsson B-M, Hijelte L, Nystyröm B. Low level of bacterial contamination of mist tents used in home treatment of cystic fibrosis patients. J Hosp Infect doi: /jhin www addresses must not be used as references. Papers that are submitted with references or other features that do not comply with these instructions will be returned to their authors and may not be considered for publication until they have been resubmitted. Method, results and discussion should be restricted to the section so named, except that preliminary results may be included in the Methods section if necessary. Headings and subheadings may be used in the text. Footnotes should be avoided. v

75 All pages of the manuscript should be numbered consecutively in the order: title page, text, references, tables, figures, legends. Keywords. Authors should provide Keywords from their summary; listing them immediately after the summary. Tables. Tables should be numbered in Roman numerals (e.g. Table III). Each table should be on a separate sheet and should include a title which makes the meaning clear without reference to the text. Use -' for no observation', or not measured'. Figures. Illustrations should be in finished form suitable for reproduction, as large or larger than the final size on the page. Photographs should have strong contrast and be trimmed to exclude unnecessary background. Figures should be planned to fit the proportions of the Journal pages, and details should be easily discriminated at the final size. Colour photographs will be considered only if essential. All illustrations are to be numbered with arabic numerals as Figures 1, 2, 3 etc. without abbreviation, in the order of their first mention in the text. A short explicit legend must be provided for each figure. All such legends should be listed together in the final section of the manuscript. Bacterial nomenclature. Organisms should be referred to by their scientific names according to the binomial system. When first mentioned the name should be spelt in full and written in italics. Afterwards the genus should be abbreviated to its initial letter, e.g. S. aureus' not Staph. aureus'. If abbreviation is likely to cause confusion or render the intended meaning unclear the names of microbes should be spelt in full. Only those names which were included in the Approved List of Bacterial Names, Int J Syst Bacteriol 1980: 30: and those which have been validly published in the Int J Syst Bacteriol since 1 January 1980 have standing in nomenclature. If there is good reason to use a name that does not have standing in nomenclature, the names should be enclosed in quotation marks and an appropriate statement concerning the nomenclatural status of the name should be made in the text (for an example see Int J Syst Bacteriol 1980; 30: ). When the genus alone is used as a noun or adjective, use lower case roman not underlined, e.g. organisms were staphylococci' and acinetobacter infection'. If the genus is specifically referred to, use italics, e.g. organisms of the genus Staphylococcus'. For genus in plural, use lower case roman e.g. salmonellae'; plurals may be anglicized e.g. salmonellas'. For trivial names, use lower case roman e.g. meningococcus'. Numbers, measurements and statistics. Numbers one to nine are written unless they are measurements (e.g. 5 ml). Numbers greater than nine are spelled out if they begin a sentence, or when clarity requires it. Numbers above and including have a space, not a comma. A decimal point is preceded by a number or cypher, e.g. 0. 5'. Decimal points in columns should be aligned vertically. Dates are usually provided in full: 14 April Measurements may be expressed in SI or non-metric units. Use 10 ml/h rather than -1 or per. When referring to microbial concentrations use expressions such as 10 x, not x log 10. When referring to changes in microbial concentration, use expressions such as reduced by a factor of 10 x, not reduced by x log 10 ; a log 10 reduction factor of x may also be used. Abbreviations. Use capitals for: MIC, MBC, WBC, RBC, DNA, RNA, Group A, B etc. for antigenic or other groups, HPA, CDSC, CDC, WHO, CSF, MSU, EMU, CSU. Use cfu, pfu, mm, m, min, h, in, ft, g, kg, ml, L, im, iv, iu, P (probability). Use sp. and spp. (species, singular and plural). Use Gram's stain and Gram-negative bacillus. Date format. Use European Date format. vi

76 Spelling. Use British spellings: Haemophilus, haematology, paediatrics, leucocyte, leukaemia, bacteraemia, sulphonamides, aetiology; but note neutropenia, fetal. Please note the journal uses UK 'z' spelling (e.g., colonizes). Drugs. These should be referred to by their approved and not proprietary names; for guidance, see the British National Formulary Additional points to note Use two carriage returns to end headings and paragraphs. Type text without end of Iine hyphenation, except for compound words. Do not use the lower case letter l (el) for 1 (one) or O for 0. (They have different typesetting values.) Be consistent with punctuation and only insert a single space between words and after punctuation. Please include a list of any special characters you have had to use, e.g. Greek, maths. The Editor retains the customary right to make changes in style and language without consultation. Copyright Information Authors submitting a manuscript do so on the understanding that, if it is accepted for publication, exclusive copyright of the paper shall be assigned to The Hospital Infection Society. Permissions Information Any material which has been published elsewhere and is contained in a contribution to the Journal must be accompanied by a statement giving permission to reproduce the material signed by the author(s) and publishers concerned. When submitting material related to commercial products it may, in some circumstances, be appropriate for the author to forward a copy of the contribution to the manufacturers before publication. Proofs One set of page proofs in PDF format will be sent by to the corresponding Author (if we do not have an address then paper proofs will be sent by post). Elsevier now sends PDF proofs which can be annotated; for this you will need to download Adobe Reader version 7 available free from Instructions on how to annotate PDF files will accompany the proofs. If you do not wish to use the PDF annotations function, you may list the corrections (including replies to the Query Form) and return to Elsevier in an . Please list your corrections quoting line number. If, for any reason, this is not possible, then mark the corrections and any other comments (including replies to the Query Form) on a printout of your proof and return by fax, or scan the pages and , or by post. Please use this proof only for checking the typesetting, editing, completeness and correctness of the text, tables and figures. Significant changes to the article as accepted for publication will only be considered at this stage with permission from the Editor. We will do everything possible to get your article published quickly and accurately. Therefore, it is important to ensure that all of your corrections are sent back to us in one communication: please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is received. vii

77 Electronic offprints The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via . The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use. Contact Details: Journal of Hospital Infection 162 King s Cross Road London WC1X 9DH Tel: Fax: jhi@his.org.uk Submission via Editorial Manager Manuscripts should be submitted to the journal online via the Editorial Manager website, Authors need to register before submitting their first manuscript online. Click REGISTER on the main navigation menu at the top of the screen; a screen will open, requesting First and Last names and address. Click OK upon completion to access the Registration Page. Authors must enter their personal information to begin the process. Note that information fields marked with asterisks can not be left empty. At the bottom of the form is a field where authors must pick a preferred username which is required to access the Editorial Manager system thereafter. Confirm that the information entered is correct on the subsequent Registration Confirmation page and click the Continue button at the bottom. Upon registering with the Editorial Manager system, a notification will be sent to the address specified in the registration information. It will contain the username and password required to log in. To log in, click LOGIN on the main navigation menu at the top of the screen. Enter the username and password in the appropriate fields then select Author Login to access the Author Main Menu a list of functions authors are enabled to perform in the system. Click Submit new Manuscript to begin the submission process and access the interface via which all the data that comprises the manuscript text, images and descriptions is submitted. The text of the article should conform to the arrangement and format detailed above and should be uploaded to the website as a Microsoft Word or Word Perfect document. PDF files must not be uploaded. Figures can be submitted in a variety of formats, although JPEG (.jpg) or TIFF (.tif) files at a resolution of at least 300 dots per inch (dpi) for colour images and 1000 dpi for black and white images are preferred. Illustrations should be planned at their final size. Line illustrations should be in a separate file and not embedded in the text. Once you have logged in to the system, you will be brought to the Author Main Menu (see below). viii

78 Click Submit new Manuscript to begin the submission process. You will be brought to the Submit New Manuscript menu (see below). It is from this interface that you will submit all the data that comprises your manuscript text, images and descriptions. Enter Article Title Enter the title of your article in the space provided. Click Next when you re ready to move forward. Select Article Type Using the drop-down menu, select the article type that best describes your manuscript. Click Next to proceed. Add/Edit/Remove Authors You may add the names of other people who were involved in the creation of the manuscript. Only you as the Corresponding Author will receive any notifications from the system. You may change the person designated as the Corresponding Author, but this person must be a registered Editorial Manager user, as they will need to be contacted throughout the submission process. Other Authors do not need to be registered with the system, but may be included for the purpose of appearing in the printed version of the manuscript if it is selected for publication. A first name and last name are required affiliation information isn t a required entry, however it will aid an Editor who wishes to select Reviewers who aren t affiliated with those who are involved in the creation of the manuscript. You don t need to re-enter yourself in the list of authors, as you are listed already as the corresponding author. Click Next to proceed. ix

79 Select Classifications Click 'Select Document Classifications' to open a window containing a list of the classifications pertaining to this journal. Click the checkbox next to any classification which is relevant to your submission. You may select as many classifications as is appropriate. Click 'Submit' when you are done. Click Next to proceed. Additional Information Please enter your total word count which includes summary, text, acknowledgements and references. Enter the number of figures and tables submitted and detail information regarding any conflict of interest and/or sources of funding. Enter Comments Enter any comments you would like to send to the editorial office. These comments do not appear in your manuscript. Click Next to proceed. Select Region of Origin Please select the submissions region of origin from the list provided. Attach files For each item you want to provide choose the Item (Items that are required will be marked with an asterisk (*)), enter a Description, locate the file with the Browse button, then click Attach This File to upload the file (uploading may take several minutes for larger files). If you have saved your manuscript on your desktop or C drive of your computer you ll be able to select it and attach it. Manuscripts MUST conform to the arrangement and format detailed above. Please attach Figures as separate TIFF or JPG files to make for ease in publishing. As each item from the dropdown menu is attached, you ll see that a list of what you ll be sending to the Editorial Office is building at the bottom of the screen. Repeat this process until all items in your submission have been attached. You can see everything you ve attached in the list at the bottom. When all Items have been attached ensure they are in correct order by editing the order number which the files are listed and click update file order button. When all the items are listed correctly, click Next at the bottom of the page. You ll again be able to see what you re sending to the Editorial Office, and can make sure that everything you want to include is listed. A message will prompt you if you ve left out any of the required pieces of the submission. Click Send. A message will appear on the screen thanking you for your submission, and an verification will be sent. You manuscript will now be filed in the Submissions Waiting for Author s Approval in your Author Main Menu. To complete the process you ll need to make one final approval before the Editorial Office receives your submission. (See Reviewing and approving your manuscript in the following section). If you are unable to complete the submission process, your data will not be lost. You can access your unfinished submission in the Incomplete Submissions list on your Author Main Menu. x

80 Reviewing and approving your manuscript You must approve your submission before it is sent to the journal office. Click Submissions Waiting for Author s Approval to bring up a table containing all manuscripts that are waiting to be viewed and approved by you (see below). Once the PDF version of your manuscript has been created by the system, you will see a set of links in the Action column of the table. View Submission allows you to view the PDF version of your submission (if you do not have Adobe Acrobat installed on your system, simply click the Get Acrobat Reader icon at the bottom of the Submissions Needing Approval menu and follow the instructions from Adobe s web site). You may choose to make alterations to your submission such as spelling corrections, description changes, extra graphics, etc. you can do this by selecting Edit Submission. If there is a problem creating the PDF you re viewing, there will be a message in the PDF explaining what may have caused the problem. Edit Submission will bring you to the same interface you used when you initially submitted the manuscript. You can remove or add files at the Attach Files portion of the submission if you need to change anything. If you do make changes, a new PDF file for you to view and approve will be built. Once you are satisfied with your submission and are ready to send it to the journal office, click Approve Submission. You may also choose to remove your manuscript from the system by selecting Remove Submission (the Manuscript will not be submitted to the journal office for review). When you approve your submission, it will now be filed in the Submissions Being Processed list in your Author Main Menu. Tracking the progress of your submission Once your manuscript has been submitted to the journal, you can track its progress by viewing your submission in the Submissions Being Processed list (see below). You will be notified when the journal has made a decision. xi