EFEITO DE ÓXIDOS DE TERRAS RARAS PESADAS NA BIOCOMPATIBILIDADE DE CERÂMICAS 3Y-TZP
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- Gabriel Henrique Martinho
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1 1 EFEITO DE ÓXIDOS DE TERRAS RARAS PESADAS NA BIOCOMPATIBILIDADE DE CERÂMICAS 3Y-TZP D. R. R. Lazar; V. Ussui; M. C. Bottino; O. Z. Higa; S. G. Lorenzetti; J. O. A. Paschoal ; J. C. Bressiani; A. H. A. Bressiani Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares Av. Prof. Lineu Prestes, 2242 CEP São Paulo / SP drlazar@ipen.br RESUMO Cerâmicas à base de zircônia são materiais promissores na área biomédica por apresentarem biocompatibilidade, altas resistências ao desgaste e à corrosão. Recentemente, o emprego de concentrados de ítria tem sido proposto para a estabilização da zircônia visando reduzir o custo envolvido na produção desses materiais. Os elementos térbio, disprósio, holmio, érbio e itérbio, classificados como terras raras pesadas, são os principais constituintes destes concentrados por estarem associados aos minérios de ítrio. Neste trabalho foi avaliado em amostras 3Y-TZP, preparadas por co-precipitação, o potencial citotóxico destes elementos, baseando-se nas normas da ISO Diluições seriadas dos extratos das amostras foram expostas à cultura celular e o teste realizado pela incorporação do corante (MTS), que é diretamente proporcional ao número de células viáveis na cultura. Os resultados obtidos mostram que a utilização de óxidos de terras raras pesadas na estabilização da zircônia não compromete a aplicação dessas cerâmicas na área médica. Palavras chaves: zircônia estabilizada, ítria, óxidos de terras raras pesadas, citotoxicidade, biocerâmicas
2 2 INTRODUÇÃO O emprego de cerâmicas de zircônia estabilizada na fase tetragonal com ítria (Y-TZP yttria tetragonal zirconia polycrystals), como material alternativo à alumina na fabricação de cabeças de fêmur de próteses total de quadril, iniciou-se em meados da década de Posteriormente, esta cerâmica também passou a ser utilizada como componente de próteses de joelho e de ombro (1 5). Assim como a alumina, a zircônia é um material bioinerte que apresenta excelente biocompatibilidade, boa resistência à corrosão e ao desgaste, com a vantagem de apresentar maior resistência à fratura devido à transformação da fase tetragonal para monoclínica, quando sob solicitação mecânica, propiciando a absorção de uma trinca que está se propagando (1-5). Este mecanismo, conhecido como reforço por transformação, foi descoberto por Garvie et al. (6) em Na odontologia, as cerâmicas à base de zircônia têm sido utilizadas como material restaurador, não só devido à elevada resistência mecânica deste material, mas também por suas propriedades ópticas, que possibilitam reproduzir as características estéticas dos dentes naturais, após recobrimento com uma cerâmica feldspática contendo alumina (7, 8). Na década de 1990, a utilização da zircônia, como biomaterial, foi questionada devido à possibilidade de presença de urânio e tório, remanescentes dos minérios de partida, como zirconita e badeleíta, impurezas estas que acarretam danos ao corpo humano devido ao potencial radioativo desses elementos (1-3). Este problema, no entanto, é contornado com o emprego de pós de elevada pureza, obtidos por rotas de purificação química, de acordo com as especificações da norma ISO (2, 5, (Tabela 1) 9). As cerâmicas de zircônia obtidas segundo esta norma, consideradas de grau cirúrgico, foram avaliadas por meio de experimentos realizados in vitro e in vivo, sendo que grande parte destes estudos, reportados por Piconi & Macauro (1) e Cales (3), evidenciam a biocompatibilidade desses materiais. Recentemente, foi demonstrada a viabilidade do uso de concentrados de ítria para a estabilização da zircônia, uma vez que a presença de impurezas como térbio, disprósio, érbio e itérbio, denominadas terras raras pesadas, não apresenta efeito significativo na definição da estrutura cristalina, microestrutura, dureza e tenacidade à fratura desses materiais (10). A vantagem do emprego de concentrados de ítria
3 3 deve-se ao menor custo destas matérias primas, decorrente da dificuldade de separação química dos elementos de terras raras. A complexidade dos processos de purificação envolvidos é conseqüência da configuração eletrônica peculiar desta série de elementos, cujas espécies trivalentes apresenta valores muito próximos de raio iônico (0,985 a 1,04 Å) (10). Tabela 1 Especificações químicas e físicas de cerâmicas Y-TZP para aplicações biomédicas (ISO 13356) (2, 5, 9). Composição química (% em massa) ZrO 2 + HfO 2 + Y 2 O 3 > 99,0 Y 2 O 3 4,5 a 5,4 HfO 2 < 5 Al 2 O 3 <0,5 Outros óxidos < 0,5 Densidade (g.cm -3 ) 6,0 Tamanho de grão (µm) < 0,5 Dureza (GPa) 12,26 Tenacidade à fratura (MPa. m 1/2 ) 8 Módulo de elasticidade (GPa) 210 Resistência à flexão 4 pontos (MPa) > 950 Em aplicações biomédicas, a substituição de ítria de elevada pureza por concentrados deste óxido ainda não foi implementada. Neste caso, devem ser realizados estudos de biocompatibilidade para comprovar a viabilidade de uso deste material. Esses estudos têm como objetivo a verificação das interações entre o implante/meio fisiológico e implante/tecido, cujas principais reações sistêmicas incluem: hipersensibilidade, toxicidade e carcinogenicidade. Para esta finalidade, a norma ISO estabelece um planejamento de avaliação biológica (11). Os testes in vitro, utilizados há mais de vinte anos, são normalmente efetuados para triagem, na primeira fase de avaliação da biocompatibilidade. Esses ensaios, além de apresentar custo relativamente baixo e curto período para obtenção dos resultados, minimizam a possibilidade da utilização de animais em pesquisa, caso o material seja considerado inaceitável ainda nesta etapa inicial (12). Entre os testes que podem ser realizados in vitro estão os de citotoxicidade, genotoxicidade e hemocompatibilidade. A técnica de citotoxicidade verifica a lise
4 4 (morte) e a inibição de crescimento celular. Por sua vez, o teste de genotoxicidade verifica mutações genéticas em DNA ou em genes e o de hemocompatibilidade, os efeitos no sangue, ou seja a possibilidade destes materiais formarem trombos plaquetários o que seria extremamente prejudicial à utilização em aplicações cardiovasculares (12, 13). Neste trabalho, foi verificada influência de impurezas de óxidos de terras raras pesadas no potencial citotóxico de cerâmicas TZP, preparadas por co-precipitação, cujo ensaio foi baseado na norma da ISO (14). O concentrado contendo 85% de ítria foi obtido pelo beneficiamento da monazita e processamento por extração com solventes, técnica esta recomendada para separação química de terras raras em processos industriais (15). PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Os pós de zircônia estabilizada com 3 mol% de ítria de elevada pureza (P) e com concentrado de ítria (M1) foram obtidos pela rota de co-precipitação de hidróxidos, em meio amoniacal (16), empregando-se as seguintes matérias-primas: solução de oxicloreto de zircônio, obtida pela dissolução do hidróxido de zircônio com pureza 99,5% em massa de ZrO 2 + HfO 2, produzido na Usina Piloto de Produção de Zircônio do IPEN, pelo processo de decomposição da zirconita por fusão alcalina, seguido de purificação por precipitação do sulfato básico de zircônio; cloreto de ítrio obtido por dissolução do respectivo óxido, com pureza superior a 99,9% em massa, de procedência Aldrich; e concentrado de ítria, obtido por extração com solventes em meio clorídrico, a partir do processamento da monazita, contendo, em massa, 85% de Y 2 O 3, 8,5% de Dy 2 O 3, 4,2% de Er 2 O 3, 1,8% de Ho 2 O 3, 0,3% de Yb 2 O 3 e 0,2% de Tb 4 O 7. Os precipitados obtidos foram submetidos a duas etapas de lavagem: com água para eliminação de íons cloreto (teste realizado com AgNO 3 ) e com etanol para eliminação de aglomerados fortes. Para esta última finalidade foi realizado também um tratamento por destilação azeotrópica, utilizando butanol como solvente orgânico.
5 5 Após secagem a 80 o C por 24 horas e calcinação a 800 o C por 1 hora, os pós foram submetidos à moagem em etanol por 16 horas, em moinho de bolas, e secagem em estufa a 80 o C por 24 horas. O processamento dos pós consistiu na conformação de pastilhas, por prensagem uniaxial (100 MPa) e sinterização 1500 o C, por 1 hora. Para caracterização das peças cerâmicas foram realizadas medidas de densidade aparente, baseadas no princípio de Archimedes; análises por difração de raios X (DMAX 2000, Rigaku), pelo método de Rietveld; medidas de dureza e tenacidade à fratura, pelo método de indentação Vickers (VMT-7, Büehler); módulo de elasticidade por análise mecânica dinâmica (DMA 242 Netzsch); e avaliação microestrutural por microscopia eletrônica de varredura (XL30, Philips). Testes de biocompatibilidade in vitro O ensaio fundamenta-se no procedimento originalmente desenvolvido por Borefreund & Puerner (17) para a triagem de agentes citotóxicos, sobre uma monocamada de células. O método baseia-se na avaliação quantitativa de células vivas, após a exposição ao agente tóxico, pela incubação com o corante supravital do composto tetrazólio (MTS) e um agente acoplador de elétrons PMS. O MTS é biorreduzido pelas células a um produto formazan que é solúvel no meio de cultura e então efetuada uma análise espectrofotométrica do corante incorporado, de acordo com Barltrop et al. (18). A quantidade de MTS, o marcador da viabilidade celular, incorporada pela população de células, é diretamente proporcional ao número de células vivas na cultura. No teste de citotoxicidade utilizou-se como controle positivo uma solução fenólica a 0,3%. O controle negativo designado foi um pó cerâmico de alumina de alta pureza. A preparação dos extratos, para as amostras cerâmicas de zircônia, foi realizada de acordo com a norma ISO , deixando-se as amostras em contato com meio de cultura por 48 h em estufa a 37º C e com atmosfera úmida de 5% de CO 2. Uma cultura de células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) em monocamada foi separada por tripsinização. Em seguida, a suspensão celular foi centrifugada, lavada com solução tampão salina (PBS) estéril e o precipitado ressuspenso em meio de cultura RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino e solução antibiótica.
6 6 Uma microplaca de cultura celular de 96 poços foi preparada a partir da adição de diluições crescentes (6,25; 12,5; 25; 50; 100%) do extrato dos materiais. Em seguida, pipetou-se a suspensão celular nos poços. Colunas controle de 4 poços foram preparadas (a) com o meio, sem a colocação das células (branco) e (b) com o meio e células (100% de viabilidade). Feito isso, foi realizada a incubação a 37º C da microplaca sob atmosfera úmida de 5% de CO 2. Decorridas 72 h, uma mistura (20:1) de MTS-0,2% e PMS-0,09% em PBS foi adicionada aos poços teste. O período de incubação em estufa a 37º C e com atmosfera úmida de 5% de CO 2 foi de 2 horas. A incorporação do corante foi avaliada por um leitor de microplacas a 490nm contra o branco. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados de caracterização física das amostras sinterizadas são apresentados na Tabela II. Observa-se que as cerâmicas contendo 3 mol% de dopante apresentam estrutura cristalina predominantemente tetragonal, com presença de cerca de 3% de fase monoclínica, com tamanho de grão da ordem de 0,3 µm (determinados com o auxílio do programa Quantikov de processamento de imagens). A presença de pequena quantidade de fase monoclínica, provavelmente decorrente da transformação martensítica durante o resfriamento da peça sinterizada ou etapas de corte, é evidenciada pela formação de maclas nos grãos de maior tamanho (figura 1a). Propriedades como densidade, módulo de elasticidade e tenacidade à fratura são inferiores ao especificado na ISO13356 (Tabela I), embora algumas delas apresentem valores superiores aos encontrados na literatura para cerâmicas Y-TZP aplicadas na odontologia e ortopedia (tenacidade à fratura, por exemplo, K IC = 5,5 MPa. m 1/2 ) (7, 17). A análise de imagens obtidas por MEV (figura 1) indica que não ocorrem diferenças significativas na microestrutura das cerâmicas de zircônia estabilizada com ítria ou concentrado deste óxido. As amostras contendo com 3 mol% de dopante apresentam boa homogeneidade.
7 7 Tabela II - Concentração de fases, densidade teórica e aparente, tamanho de grão, módulo de elasticidade, dureza e tenacidade à fratura de cerâmicas de zircônia estabilizada com 3 mol% de ítria de elevada pureza (3P) e concentrado deste óxido (3M1). Propriedade avaliada 3P 3M1 Concentração de fases (% em massa) tetragonal monoclínica ρ teórica (g.cm 3 ) ρ aparente (g.cm 3 ) ρ relativa (%) 6,07 5,92 ± 0,03 97,5 ± 0,5 6,11 5,96 ± 0,03 96,4 ± 0,5 Tamanho médio de grão (µm) 0,34 ± 0,13 0,34 ± 0,13 Módulo de elasticidade (GPa) H V (GPa) 13,5 ± 0,3 13,5 ± 0,3 K IC (MPa. m 1/2 ) 6,0 ± 0,2 6,1 ± 0,2 (a) (b) Figura 1: Micrografias, obtidas por MEV, de superfícies, polidas e atacadas termicamente, de amostras cerâmicas de zircônia estabilizada: (a) 3P, e (b) 3M1.
8 8 Os resultados apresentados na Tabela III e Figura 2 mostram os resultados do teste de citotoxicidade das amostras cerâmicas de zircônia estabilizada com 3 mol% de ítria de elevada pureza (3P) e concentrado deste óxido (3M1), assim como dos controles positivo e negativo. Tabela III: Percentuais de viabilidade celular obtidos no teste de citotoxicidade dos extratos das cerâmicas de zircônia estabilizada com 3 mol% de ítria de elevada pureza (3P) e concentrado deste óxido (3M1). Concentração dos extratos (%) 3P Viabilidade celular (%) 3M1 Controle (+) (fenol 0,3%) Controle (-) (alumina) ± 8 77 ± 2 0 ± 0,4 89 ± ± 2 95 ± 10 5 ± 3 96 ± ± ± ± ± 15 12,5 114 ± ± 7 60 ± ± 3 6, ± ± 2 91 ± ± Viabilidade celular (%) IC 50(%) Amostra 3M1 Amostra 3P Controle negativo (Alumina) Controle positivo (Fenol 0,3%) Concentração dos extratos (%) Figura 2: Curvas de viabilidade celular obtidas no teste de citotoxicidade dos extratos das cerâmicas de zircônia estabilizada com 3 mol% de ítria de elevada pureza (3P) e concentrado deste óxido (3M1).
9 9 O índice de citotoxicidade (IC 50(%) ), que corresponde à concentração de extrato do material que provoca a morte de 50% da população das células, foi determinado por interpolação. Conforme previsto, o controle positivo (Fenol 0,3%) deve produzir efeito citotóxico, sendo neste caso (IC (50%) =15). Por sua vez, o controle negativo (pó de alumina) não deve apresentar efeito citotóxico, (IC (50%) >100). As amostras de zircônia avaliadas também não apresentaram efeito citotóxico, mesmo quando estabilizadas com concentrados de terras raras (IC (50%) >100). Neste sentido, testes in vivo deverão ser programados com o intuito de verificar as interações implante-tecido. CONCLUSÕES Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que as cerâmicas Y-TZP, obtidas a partir de matérias primas provenientes do processamento químico dos minerais zirconita e monazita, apresentam potencial para aplicações biomédicas, devido à ausência de toxicidade desses materiais. Por sua vez, a rota de coprecipitação, adotada para síntese dos pós, e as condições empregadas para processamento cerâmico permitem a obtenção de materiais com estrutura predominantemente tetragonal, com microestrutura homogênea constituída por grãos com tamanho da ordem de 0,3 µm e valores elevados de dureza e tenacidade à fratura (13 GPa e 6,0 MPa.m 1/2, respectivamente), características estas típicas desta classe de materiais. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FAPESP pelo apoio financeiro e aos colegas Dr. Nelson B. Lima, Dr. Luis Filipe C.P. de Lima, MSc. Elizabeth Fancio, Celso V. de Moraes e Nildemar Ferreira pelo auxílio na caracterização física dos materiais. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. C. Piconi, G. Maccauro, Biomaterials 20 (1999) A. Marti, Injury 31 (2000) S-D B. Cales, Clin. Orthop. 379 (2000) 94.
10 10 4. E.M. Santos, S. Vohra, A. Catledge, M.D. McClenny, J. Lemons, K. D. Moore, J. Arthroplasty 19 (2004) G. Willmann, H.J. Früh, H.G. Plaff, Biomaterials 17 (1996) R.C. Garvie, R T Hannink; Pascoe, Nature 258(1975) M. Guazzato, M. Albakry, S. P. Ringer, M. V. Swain, Dent Mater. 20, (2004) J. W. McLean, T. H. Hughes. Br. Dent. J 119, (1965) ISO document Implants for surgery ceramic materials based on yttriastabilized tetragonal zirconia (Y-TZP) 1st Ed, D.R.R. Lazar, C.A.B. Menezes, V. Ussui, E. Fancio, N.B. Lima, A.H.A. Bressiani, J.O.A. Paschoal. Mater Sci Forum (2003) ISO document Biological evaluation of medical devices, Part 1, Guidance on selection of tests, B. D. Ratner, A. S. Hoffman, F. J. Schoen, J. E. Lemons (Eds) Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine. Amsterdan: Elsevier, 2004, p T. Groth, P. Falck, R.- R. Miethke, ATLA 23 (1995) ISO document Biological evaluation of medical devices, Part 5, Tests for cytotoxicity: in vitro methods, D. R. Ricci, S.M. Cunha, S. Silva, A. C. Mindrisz, L. M. Zarpelon, J. S. M. Nobre, J.O. A. Paschoal. In: Anais do 35 o CBC, 7-10, junho, 1992, Caxambu, M.G., ABC, 1992, v.1, p D.R.R. Lazar, C.A.B. Menezes, V. Ussui, A. H. A. Bressiani, J. O. A. Paschoal, J. Eur. Ceram. Soc., 22 (2002), p E. Borefreund, J.A. Puerner. A simple quantitative procedure using monolayer cultures for cytotoxicity assay (HTD/NR-90). J Tissue Culture Meth. 1984; 9: A. Barltrop et al, Bioorg & Med. Chem. Lett. 1 (1991) A. H. De Aza, J. Chevalier, G. Fantozzi, M. Schehl; R. Torrecillas Biomaterials 23 (2002) 937.
11 11 EFFECT OF HEAVY RARE EARTHS ON THE BIOCOMPATIBILITY OF 3Y-TZP CERAMICS ABSTRACT Zirconia based ceramics are considered very promising in the biomedical field due to its biocompatibility, high wear strength and corrosion resistance. The use of yttrium concentrates has been recently recommended to stabilize zirconia-based ceramics aiming to reduce the costs involved in these materials production. Elements such as terbium, dysprosium, holmium, erbium and ytterbium, termed heavy rare earths, are the main constituents of these concentrates due to the association to yttrium ores. In this study it was evaluated the cytotoxic potential of such elements in 3Y-TZP samples prepared by the coprecipitation route. The cytotoxic test was based on the ISO guide. Serial extract dilutions were exposure to a cell culture and the test performed by the supravital dye incorporation (MTS) which is directly proportional to the number of viable cells. The obtained results showed that the employ of heavy rare earths to stabilize zirconia phases did not compromise the use of 3Y-TZP ceramics in the medical field. Keywords: stabilized zirconia; yttria; heavy rare earth oxides; citotoxicity; bioceramics.
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