Genômica e Proteômica

Transcrição

1 Genômica e Proteômica

2 Genômica A genômica é o campo da genética que tenta compreender o conteúdo, a organização, a função e a evolução da informação genética contida em genomas inteiros (PIERCE)

3 Genômica estrutural A genômica é uma área da genética que estuda a estrutura e a função de genomas inteiros. Na década de 80, pesquisadores começaram a se unir em grandes equipes, fazendo um esforço conjunto para o sequenciamento de genomas inteiros. Surgiram então os Projetos Genoma, que tinham como objetivo conhecer a sequência de nucleotídeos de uma determinada espécie.

4 Genômica Estrutural Essa abordagem é conhecida como Genômica Estrutural e tais projetos geram uma quantidade muito grande de dados de sequências das mais diversas espécies, sendo que essa informação é armazenada em bancos de dados de acesso público, como o GenBank.

5 Genômica Estrutural A genômica estrutural está relacionada ao sequenciamento e à compreensão do conteúdo dos genomas. Uma das abordagens é primeiro caracterizar o genoma através de mapas genéticos e físicos de seus cromossomos. Estes mapas fornecem informações sobre as localizações relativas dos genes, marcadores moleculares e segmentos cromossômicos, que em geral são essenciais para o alinhamento de trechos de sequenciamentos de DNA em uma sequência total do genoma.

6 Mapas Genéticos Os mapas genéticos tem como objetivo determinar a posição de um certo número de marcadores genéticos em relação ao outro. Para esse tipo de análise é necessário que tenha polimorfismo e que tenham grandes famílias disponíveis para a análise de segregação, fornecendo uma localização aproximada dos genes com relação à outros genes ou marcadores, cuja localização é conhecida.

7 Mapas Genéticos As distâncias nos mapas genéticos são medidas em porcentagem de recombinação (centimorgans, cm) ou unidades de mapa. Os dados de vários cruzamentos de dois pontos ou três pontos podem ser integrados em mapas de ligação para cromossomos inteiros.

8 Mapas Genéticos Limitações: a primeira é a resolução. O genoma humano inclui 3,4 bilhões de pares de bases de DNA e tem uma distância genética total de cerca de cm, uma média de pb/cm. Mesmo se ocorresse um marcador a cada centimorgan, a resolução em relação à estrutura física do DNA ainda seria bem baixa. Um segundo problema com os mapas genéticos é que eles nem sempre correspondem precisamente a distâncias físicas entre os genes. Os mapas genéticos são baseados nas taxas de recombinação, que variam um pouco de uma parte do cromossomo para outra. Apesar disso, os mapas genéticos foram críticos para o desenvolvimento de mapas físicos e o sequenciamento de genomas inteiros.

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10 Mapas Físicos Os mapas físicos referem-se a molécula de DNA. Trata-se de determinar a posição dos genes no cromossomo, assim como a distância em nucleotídeos entre os genes. O mapa físico final é constituído pela sequência completa do DNA.

11 Mapas Físicos Os mapas físicos em geral têm maior resolução e são mais precisos que os mapas genéticos. Existem várias técnicas: o mapeamento de restrição, que determina as posições dos sítios de restrição no DNA e a hibridização in situ com fluorescência (FISH), na qual os marcadores podem ser visualmente mapeados a locais nos cromossomos; e o sequenciamento do DNA

12 Correlação dos mapas genéticos, citológicos e físicos, dos cromossomos A localização cromossômica dos genes e outros marcadores moleculares podem ser mapeados com base nas frequências de recombinação, posição relativa de marcas citológicas ou distâncias físicas. John Wiley & Sons, Inc.

13 Correlação de mapas Genético, Citológico e Físico

14 Mapas Genético: é baseado na frequência de recombinação. Citológico: é baseado no padrão de bandeamento dos cromossomos. Físico: é baseado em distâncias moleculares. Marcadores âncora: são mapeados geneticamente e fisicamente e podem ser usados para correlacionar os mapas. John Wiley & Sons, Inc.

15 Projetos Genoma Início da década de 80: os métodos para mapeamento e sequenciamento de fragmentos de DNA estavam em um estágio de desenvolvimento que permitiu aos pesquisadores pensar em projetos de sequenciar todo o genoma humano. Foi feita uma colaboração internacional para realizar o Projeto do Genoma Humano.

16 Projetos Genoma Os primeiros genomas sequenciados: pequenos vírus. 1982: O genoma do bacteriófago λ, composto por pb 1995: Haemophilus influenzae. Esta bactéria tem um pequeno genoma de 1,8 milhão de pares de base 1996: primeiro organismo eucariótico (levedura) 1997: Escherichia coli 1998: Caenorhabditis elegans 2000: Drosophila melanogaster e Arabidopsis thaliana 2000: O primeiro esboço do genoma humano foi completado em junho de (PIERCE)

17 Haemophilus influenzae (PIERCE)

18 Projeto do Genoma Humano O Projeto do Genoma Humano foi iniciado em outubro de 1990, com prazo de conclusão de 15 anos e foi dirigido por James Watson. O projeto contava com a participação de cerca de 5000 cientistas em 250 diferentes laboratórios. Em 1993, mapas físicos em grande escala foram completados para todos os 23 pares de cromossomos humanos. Ao mesmo tempo, as técnicas de sequenciamento automatizado haviam sido desenvolvidas, tomando factível o sequenciamento em larga escala.

19 Projeto do Genoma Humano O esforço inicial para sequenciamento do genoma foi um projeto público consistindo na colaboração internacional que formou o Intemational Human Genome Sequencing Consortium.

20 Projeto do Genoma Humano Em 1998, Craig Venter anunciou que lideraria a empresa chamada Celera Genomics em um esforço privado de sequenciar o genoma humano. Os esforços públicos e privados avançaram simultaneamente, mas usaram enfoques diferentes. O Human Genome Consortium usou um enfoque baseado em mapas;

21 Projeto do Genoma Humano A Celera Genomics usou um enfoque shotgun de genoma inteiro para determinar a sequência do genoma humano, embora os mapas genético e físico produzidos pelo esforço público tenham ajudado a Celera a montara sequência final.

22 Projeto do Genoma Humano Em 1999 foi anunciado o primeiro rascunho do genoma humano e o esboço inicial foi publicado na revista científica Nature em fevereiro de 2001 com cobertura de cerca de 90 por cento do genoma. Em 2003, um comunicado de imprensa anunciou que o projeto fora concluído com sucesso, com o sequenciamento de 99% do genoma humano com uma precisão de 99,99%.

23 Genomas no Brasil No Brasil também foram realizados projetos genoma. O projeto Genoma da FAPESP começou em 1997 e sequenciou o genoma da bactéria Xylella fastidiosa, que causa a praga do amarelinho nos laranjais. Para realizar esse projeto, formou-se uma rede com 192 pesquisadores. No Paraná também foi realizado um projeto genoma (GENOPAR), que sequenciou o genoma da bactéria fixadora de nitrogênio, o Herbaspirillum seropedicae.

24 Metagenômica Hoje é possível sequenciar não apenas os genomas de espécie individual, mas os genomas de comunidades inteiras de organismos. A metagenômica é um campo emergente de tecnologia de sequenciamento no qual as sequências de genoma de um grupo de organismos que habitam um ambiente comum são separadas e determinadas.

25 Metagenômica Analisa as comunidades microbianas ao extrair o DNA do ambiente reconstrói a composição e função da comunidade com base nas sequências do genoma. Permite a identificação e análise genética de espécies que não podem crescer no laboratório. Os genomas inteiros de algumas espécies dominantes foram reconstruídos a partir de amostras do ambiente, fornecendo muitas informações sobre sua biologia.

26 Metagenômica Um estudo, chamado de Global Ocean Sampling Expedition, seguiu a rota da viagem de Darwin no H.M.S. Beagle nos anos de Os cientistas coletaram amostras de oceano e usaram os métodos metagenômicos para determinar suas comunidades microbianas. As análises de genomas bacterianos encontrados nas amostras do oceano levaram à descoberta de proteínas proteorrodopsinas, que são bombas de próton acionadas pela luz. Estas proteínas são encontradas em diversos grupos microbianos e são uma fonte principal de fluxo de energia nos oceanos do mundo.

27 Metagenômica Outros estudos metagenômicos examinaram os genes das bactérias que habitam o trato intestinal humano. Estas bactérias, junto com as que habitam a pele e outras partes do corpo, são chamadas de microbioma humano. O microbioma de uma pessoa inclui mais de 100 trilhões de células, mais de 10 vezes as células humanas, e têm 100 vezes mais genes que o genoma humano.

28 Metagenômica O microbioma humano é importante para a saúde. Um estudo examinou a flora do intestino de pessoas obesas e magras. Dois grupos de bactérias são comuns no intestino: Bacteroidetes e Firmicutes. As pessoas obesas tem mais Firmicutes do que as pessoas magras e que a proporção de Firmicutes reduz nas pessoas obesas que perdem peso com dieta de baixas calorias. Os mesmos resultados foram observados nos camundongos obesos e magros. Em um experimento, foram transferidas as bactérias dos camundongos obesos para os camundongos magros. Os camundongos que receberam as bactérias dos camundongos obesos extraíam mais calorias do seu alimento e armazenavam mais gordura.

29 Banco de dados O portal do NCBI permite acessar diferentes bancos de dados ( Entre eles podemos destacar alguns como o PubMed, que permite busca na literatura biomédica, o OMIM (online Mendelian Inheritance in Man) e o banco de sequências (GenBank).

30 Bancos de dados Tem mais 200 milhões de sequências e mais de 300 bilhões de bases armazenadas (fev 2019). Temos o genoma completo de diversas espécies, como o homem, o chimpanzé e o cão, apenas para citar alguns, mas é possível sequenciar o DNA não apenas de espécies vivas, mas também a partir de material de espécies já extintas. Em 2010 foi publicado o rascunho do genoma do homem de Neandertal, que é evolutivamente muito próximo dos humanos atuais, e viveu na Ásia e Europa, tendo desaparecido a cerca de anos atrás. O DNA foi extraído a partir de 3 fragmentos de ossos.

31 Fragmentos de ossos de Neandertal usados para a extração de DNA. Fonte: Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology As sequências de DNA do Neandertal podem ser acessadas no banco de dados do Ensembl: dex.html

32 Genômica funcional Caracteriza o que as sequências fazem, sua função. Os objetivos incluem a identificação de todas as moléculas de RNA transcritas a partir de um genoma - transcriptoma - e todas as proteínas codificadas pelo genoma - proteoma. A genômica funcional usa a bioinformática e as abordagens experimentais laboratoriais na sua pesquisa para definir a função das sequências de DNA. (PIERCE)

33 Genômica funcional

34 Genômica funcional A sequência de nucleotídios de um gene pode ser usada para prever a sequência de aminoácidos da proteína que ela codifica. A proteína pode então ser sintetizada ou isolada e suas propriedades estudadas para determinar sua função. O objetivo principal da genômica funcional tem sido desenvolver métodos computacionais que permitam que a função gênica seja identificada a partir da sequência de DNA sozinha, superando o processo trabalhoso de isolar e caracterizar as proteínas individuais. (PIERCE)

35 Pesquisas de homologia Um método computacional para determinar a função gênica é fazer uma pesquisa de homologia, que depende de comparações das sequências de DNA e das proteínas do mesmo organismo e de diferentes organismos. Os genes com uma evolução próxima são chamados de homólogos. Os genes homólogos encontrados em diferentes espécies que evoluíram a partir do mesmo gene em um ancestral comum são chamados de ortólogos (PIERCE)

36 Pesquisas de homologia Os genes homólogos têm a mesma linha de evolução. Os ortólogos são os genes homólogos encontrados em diferentes espécies, enquanto os parálogos são genes homólogos encontrados na mesma espécie (PIERCE)

37 Domínios da proteína As proteínas complexas têm, com frequência, regiões com formatos ou funções específicas chamadas de domínios da proteína. Por ex., determinadas proteínas ligadoras de DNA se conectam ao DNA da mesma forma; essas proteínas têm um domínio em comum que desempenha a função de ligação ao DNA. Cada proteína tem uma disposição de aminoácidos comum a esse domínio. É provável que exista um número limitado, embora grande, de domínios de proteínas, que se misturaram e combinaram durante a evolução para gerar a diversidade de proteínas observadas nos organismos atualmente.

38 Domínios da proteína Já foram caracterizados muitos domínios de proteínas e suas funções moleculares foram determinadas. A sequência de um gene recém-identificado pode ser rastreada em comparação com um banco de dados de domínios conhecidos. Se a sequência de gene codifica um ou mais domínios cujas funções foram previamente determinadas, a função do domínio pode fornecer informações importantes sobre uma possível função do novo gene. (PIERCE)

39 Expressão gênica Muitos indícios importantes sobre a função do gene provêm do conhecimento de quando e onde os genes são expressos. O desenvolvimento de microarranjos permitiu que a expressão de milhares de genes seja monitorada simultaneamente. O RNA-Seq o sequenciamento do transcriptoma. (PIERCE)

40 Genômica comparativa O sequenciamento de genomas fornece informações sobre o conteúdo e a organização dos genes em diferentes espécies e até em diferentes membros da mesma espécie, permitindo inferências sobre como os genes funcionam e como os genomas evoluem. Fornece informações importantes sobre as relações evolutivas entre os organismos e sobre fatores que influenciam a velocidade e a direção da evolução. A genômica comparativa é o campo da genômica que compara as semelhanças e diferenças no conteúdo, função do gene e a organização entre os genomas de diferentes organismos. (PIERCE)

41 Função dos genes O número de genes que codificam funções biológicas como transcrição e tradução tende a ser semelhante entre as espécies, mesmo quando seus genomas têm tamanhos muito diferentes. Esta semelhança sugere que estas funções são codificadas por um conjunto básico de genes que não varia entre as espécies. Por outro lado, o número de genes que participam de biossíntese, metabolismo de energia, transporte e funções reguladoras varia muito entre as espécies e tende a ser maior nas espécies com genomas maiores. (PIERCE)

42 Duplicações segmentares Parte dos genomas eucarióticos são preenchidos com duplicações segmentares, regiões com mais de pb quase idênticas na sequência. Por ex., cerca de 4% do genoma humano têm duplicações segmentares. As duplicações segmentares surgem a partir de processos que geram duplicações cromossômicas, como um crossing over desigual. Esta duplicação é importante na evolução ao dar origem a novos genes. Após surgir uma duplicação segmentar, a cópia original do gene pode continuar sua função enquanto a nova cópia sofre mutação. Estas mudanças podem consequentemente levar a uma nova função.

43 Duplicações segmentares A importância da duplicação do gene na evolução do genoma é demonstrada pelo grande número de famílias de multigenes que existem em muitos genomas eucarióticos. Uma família de multigenes é um grupo de genes evolutivamente próximos que surgem por meio de evolução repetida de um gene ancestral. Por ex., a família do gene da globina nos humanos é composta por 13 genes que codificam moléculas semelhantes à globina, a maioria dos quais produz proteínas que transportam oxigênio. Outro ex.: a família de multigenes olfatórios humanos, composta por cerca de genes que codificam as moléculas receptoras olfatórias. (PIERCE)

44 DNA não codificador Em 2002, o projeto Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) foi criado para determinar se o DNA não codificado tinha alguma função. Este projeto de 10 anos foi feito por uma equipe de mais de 400 cientistas ao redor do mundo. Em uma série de artigos publicados em 2012, ENCODE concluiu que pelo menos 80% do genoma humano está envolvido em algum tipo de função gênica. Muitas das sequências funcionais eram compostas por sítios onde as proteínas se ligavam e influenciavam a expressão dos genes. Antes deste estudo, parte do genoma era considerada DNA lixo sem função, mas o estudo ENCODE modificou significativamente esta visão e sugere que existe pouco DNA não funcional no genoma humano.

45 Colinearidade Uma das características da evolução do genoma revelada pela comparação das sequências de genes de diferentes organismos é que muitos genes estão presentes na mesma ordem nos genomas relacionados, um fenômeno chamado colinearidade. O motivo para a colinearidade entre os genomas é que eles descendem de um genoma ancestral comum e as forças evolutivas mantiveram a mesma ordem de genes nos genomas dos descendentes. Os estudos genômicos das gramíneas, as plantas da família Poaceae, ilustram o princípio da colinearidade. (PIERCE)

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47 Proteômica É a ciência que estuda o conjunto de proteínas contidas numa célula

48 Proteômica Algumas aplicações: Desenvolvimento de drogas a partir de proteínas Estudos básicos de biologia celular e molecular Modificações pós-traducionais Identificação de marcadores moleculares: Desenvolvimento; Doenças; Terapias.

49 Proteômica Separação das proteínas Eletroforese bidimensional: Primeira dimensão: focalização isoelétrica, que separa as proteínas em função da sua carga. Segunda dimensão: as proteínas são separadas por peso molecular. O gel é corado com azul de Coomassie ou com prata. Pontos no gel são proteínas que migraram para locais específicos.

50 Proteômica Um ponto no gel pode ser recortado e analisado em um espectrômetro de massa. O mapeamento de massa identifica uma proteína partindo-a em peptídeos curtos e deduz depois a identidade da proteína através da comparação entre as massas observadas dos peptídeos e uma base de dados de sequências. A espectrometria de massa sequencial, por outro lado, pode obter a informação sequencial de peptídeos individuais isolando-os, fazendo-os colidir com um gás não reativo e catalogando em seguida os íons dos fragmentos assim produzidos.

51 Proteômica

52 Focalização isoelétrica As moléculas anfotéras migram sob a ação de um campo elétrico em um gel contendo um gradiente de ph. A migração se interrompe quando as proteínas atingirem seu ponto isoelétrico.

53 Focalização isoelétrica Gradientes imobilizados de ph - IPG

54 Focalização isoelétrica Reidratação das tiras e aplicação das amostras

55 Focalização isoelétrica

56 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) As proteínas reduzidas migram sob a ação de um campo elétrico e a separação ocorre de acordo com o peso molecular da proteína em relação ao tamanho dos poros do gel.

57 SDS-PAGE

58 Coloração

59 Coloração

60 Software de análise

61 Espectrometria de massa

62 Espectrometria de massa

63 Banco de dados A partir das massas detectadas para os peptídeos é possível comparar o espectro obtido com os espectros teóricos de proteínas depositadas em bancos de dados.

64 Exemplo de aplicação: Câncer Comparative proteomics analysis of human gastric cancer Wei Li, Jian-Fang Li, Ying Qu, Xue-Hua Chen, Jian-Min Qin, Qin-Long Gu, Min Yan, Zheng-Gang Zhu, Bing-Ya Liu World J Gastroenterol 2008 October 7; 14(37):

65 Câncer normal câncer

66 Cromatografia líquida Outra maneira de fazer a separação inicial de proteínas é através de cromatografia líquida, na qual há uma separação de proteínas hidrofílicas e hidrofóbicas.

67 Um total de 462 proteínas foi observado como diferencialmente expresso entre os grupos analisados.

68 Referências PIERCE, Benjamin A.. Genética - Um Enfoque Conceitual, 5ª edição. Guanabara Koogan, 04/2016. VitalBook file. Snustad e Simmons. Fundamentos de Genética, 6ª edição. Guanabara Koogan, 2013