Avaliação de fungos filamentosos isolados a partir de solo contendo glicerina para produção de compostos químicos por bioconversão

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1 Processos Bioquímicos Avaliação de fungos filamentosos isolados a partir de solo contendo glicerina para produção de compostos químicos por bioconversão Rebeca Baiocchi Vianna 1, Karen Santos de Lima 2, Carolina Madalozzo Poletto 3, Thaís Demarchi Mendes 4, Augusto Lopes Souto 5, José Antônio de Aquino Ribeiro 6, Patrícia Pinto Kalil Goncalves Costa 7, Flávia Soares Vieira 8, Jamille Ribeiro Coelho de Lima 9, Patrícia Verardi Abdelnur 10, Clenilson Martins Rodrigues 11, Mônica Caramez Triches Damaso Resumo Visando agregar valor à glicerina bruta, coproduto da produção de biodiesel, 46 linhagens de fungos filamentosos isolados da Fazenda Sucupira, Brasília, DF, foram avaliadas quanto à capacidade de crescimento em meio de cultivo contendo essa matéria-prima como única fonte de carbono. Baseado no Índice de Velocidade de Crescimento Micelial, cujos valores em glicerina metílica de soja variaram entre 1,25 e 10,53, 13 fungos foram selecionados segundo critérios de crescimento e de forma de isolamento, para avaliação de bioconversão de glicerina de soja em compostos químicos de valor agregado. Os sobrenadantes foram analisados por espectrometria de massas por infusão direta (DIMS) e por cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) para identificação e quantificação dos compostos químicos. Com base nos resultados obtidos por meio de DIMS, cinco linhagens teriam produzido polióis. Porém, quando as amostras foram analisadas por UPLC não foi 1 Graduanda em Biotecnologia, Universidade de Brasília, rebeca.baiocchi@colaborador.embrapa.br 2 Bióloga, ex-bolsista de DTI-C (CNPq) na Embrapa Agroenergia, karen.lima@colaborador.embrapa.br 3 Engenheira de alimentos, mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente, analista da Embrapa Agroenergia, carolina.poletto@embrapa.br 4 Bióloga, mestre em Microbiologia Aplicada, analista da Embrapa Agroenergia, thais.demarchi@.embrapa.br 5 Farmacêutico, doutor em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, pós-doutorando na Embrapa Agroenergia, augusto.souto@colaborador.embrapa.br 6 Farmacêutico, mestre em Ciências Farmacêuticas, analista da Embrapa Agroenergia, jose.ribeiro@embrapa.br 7 Química, mestre em Química Orgânica, analista da Embrapa Agroenergia, patricia.costa@embrapa.br 8 Farmacêutica, bolsista DTI-C do CNPq na Embrapa Agroenergia, flavia.vieira@colaborador.embrapa.br 9 Bióloga, doutora em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, pós-doutoranda na Embrapa Agroenergia, jamille.lima@colaborador.embrapa.br 10 Química, doutora em Química Orgânica, pesquisadora da Embrapa Agroenergia, patricia.abdelnur@embrapa.br 11 Químico, doutor em Química, pesquisador da Embrapa Agroenergia, clenilson.rodrigues@embrapa.br 12 Engenheira Química, doutora em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, pesquisadora da Embrapa Agroenergia, monica.damaso@embrapa.br

2 88 III Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais possível quantificar a presença dos mesmos, embora a quantidade de glicero l, fonte de carbono, tenha sido reduzida. Portanto, acredita-se que o glicerol tenha sido consumido, principalmente, para crescimento dos fungos e que a quantidade de polióis produzida seja inferior aos limites de detecção e quantificação do método. Introdução O aumento crescente na demanda por combustíveis tem intensificado o desenvolvimento de pesquisas envolvendo biocombustíveis, de forma que a matriz energética renovável complemente a fóssil. Nesse contexto, o biodiesel é uma alternativa promissora, uma vez que diminui o impacto do efeito estufa e apresenta a possibilidade de ser produzido por uma gama de matérias-primas, dentre as oleaginosas e gorduras, tendo o óleo de soja como a principal fonte no Brasil (AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E BIOCOMBUSTÍVEIS, 2016). A produção de biodiesel tem crescido desde 2005, atingindo mais de 3,9 bilhões de litros em 2015 (AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E BIOCOMBUSTÍVEIS, 2016). Entretanto, à medida que essa produção se intensifica, o mesmo ocorre com as quantidades de coprodutos e resíduos gerados na cadeia produtiva desse biocombustível, como é o caso da glicerina. Segundo Almeida et al. (2012) e Yang et al. (2012), o aproveitamento da glicerina, por via microbiana, possibilita, respectivamente, a produção de compostos químicos de alto valor agregado para a indústria, tais como: 1,3-propanediol, 2,3-butanediol, etanol, n-butanol, cetonas, ácidos orgânicos e polióis, e, consequentemente, contribui para o aumento da viabilidade e competitividade da produção de biodiesel por meio da diminuição dos custos associados com a eliminação industrial dos resíduos. O presente trabalho teve como objetivo selecionar fungos filamentosos capazes de crescer em glicerina bruta de soja como única fonte de carbono e avaliar a produção de compostos químicos a partir da bioconversão da glicerina bruta por métodos de DIMS e UPLC.

3 Processos Bioquímicos 89 Materiais e métodos Isolamento dos fungos filamentosos Cinquenta mililitros de glicerina bruta de soja (Cesbra Química S.A. Volta Redonda, RJ) e padrão comercial (PA) (USB) foram derramadas em solo de duas seções distintas da Fazenda Sucupira, Brasília, DF: Plantação de Amaranthus sp. (Caruru) e Barragem, em junho de 2015, época caracterizada pela ausência de chuva. Não foram feitas análises físico-químicas do solo. Na área de plantação, a cultura havia sido plantada, mas quando se retornou para a coleta do solo, ela já estava crescida. Foram colocados pedras e pedaços de madeira que identificassem o local do derramamento, que foi feito com cerca de 5 cm de profundidade. Após 2 meses, amostras de solo do local do derramamento foram recolhidas para isolamento de fungos filamentosos. As amostras foram codificadas por: Glicerina Padrão Plantação (GPP), Glicerina Bruta Plantação (GBP), Glicerina Padrão Barragem (GPB) e Glicerina Bruta Barragem (GBP). Para isolamento de linhagens de fungos filamentosos, uma primeira diluição, de 50 g de cada amostra em 50 ml de tampão PBS, foi incubada por 1 hora a 30 C e 200 rpm em agitador de bancada. Posteriormente, novas diluições seriadas (1/10, 1/100, 1/1000 e 1/10000 da amostra pura) foram realizadas e estas inoculadas, em duplicata, em placas de Petri contendo Meio Mínimo, 2% Glicerina bruta e sulfato de estreptomicina. As placas de Petri foram incubadas em estufa a 28 C, por 7 dias. Após o período de incubação, as colônias formadas foram purificadas em meio BDA (batata dextrose ágar) e as linhagens preservadas seguindo os protocolos dos métodos de ultracongelamento (Glicerol 30%) e do método de Castellani (água destilada). Avaliação do índice de velocidade de crescimento micelial (IVCM) Para avaliação da eficiência de crescimento em glicerina, todas as linhagens foram reativadas e inoculadas, em triplicata, na forma de ponto central em meios contendo glicerinas distintas: glicerina bruta de soja ou glicerina padrão comercial, sendo esta última para fins comparativos. A metodologia da avaliação consistiu na medida do diâmetro micelial no 3º, 5º e 7º dias de incubação, para cálculo do Índice de Velocidade de Crescimento Micelial (IVCM). Por fim, a partir desses dados, as linhagens foram agrupadas em três grupos de acordo com baixo,

4 90 III Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais médio e alto IVCM. De cada um dos grupos, foram selecionadas linhagens e estas destinadas para estudo do processo de bioconversão de glicerina. Essa estratégia de seleção foi utilizada pelo fato de não ser possível afirmar que microrganismos que apresentam maior IVCM são os que melhor produzem os compostos químicos de interesse. Bioconversão da glicerina bruta e identificação e quantificação dos compostos químicos produzidos A partir de placas de meio de adaptação (com glicerina) contendo as linhagens reativadas, quatro discos (9 mm) de micélio foram retirados e inoculados em meio de cultivo submerso contendo glicerina bruta de soja, em triplicata, e incubados a 28 C a 120 rpm, por 10 dias. Após 5 e 10 dias de cultivo, em condições adequadas, alíquotas foram retiradas e centrifugadas (5.200 rpm, por 10 minutos, a 4 C). Os sobrenadantes foram diluídos em metanol:água (1:1). Posteriormente, foram analisadas por espectrometria de massas por infusão direta (DIMS), utilizando um espectrômetro de massas com fonte de ionização por eletrospray e analisador tipo TOF (time of flight) (Maxis 4G, Bruker Daltonics). As análises foram realizadas em modo de ionização positivo (ESI(+)-MS) e os espectros das amostras biotransformadas processadas utilizando o software Data Analysis (Bruker Daltonics). Para quantificação dos polióis, as amostras foram analisadas por duas metodologias utilizando sistema UPLC (Ultra-High Performance Liquid Chromatography) com fase estacionária HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) com detecção por ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) e eluição em modo gradiente. Em ambas as metodologias, a coluna utilizada foi a HILIC BEH Amide (2,1 X 150 mm; 1,7 μm, Waters ), com a temperatura de: A) primeira condição 30 C e B) segunda condição 73 C. Resultados e discussão Um total de 46 fungos filamentosos, ainda sem identificação, foi isolado de solo da Fazenda Sucupira contaminado com glicerina: 32 de solo da barragem, sendo 21 a partir da contaminação com glicerina padrão (GPBF) e 11, com glicerina bruta (GBBF), e 14 da plantação de Amaranthus sp. (Caruru), sendo 5 a partir da contaminação com glicerina padrão (GPPF) e 9, com glicerina bruta (GBPF). Essas 46 linhagens foram submetidas a uma avaliação quanto à sua eficiência de crescimento em meio de cultivo que continha apenas glicerina como

5 Processos Bioquímicos 91 fonte de carbono. Baseados nos dados obtidos e apresentados na Figura 1, os valores de IVCM em Glicerina bruta variaram de 1,25 a 10,53, enquanto os valores em Glicerina Comercial oscilaram dentro da faixa 1,79 a Embora os maiores resultados tenham sido obtidos em glicerina padrão comercial, considerando-se que a glicerina de soja contém várias impurezas, como metanol, cinzas e resíduos de catalisador, o resultado obtido pelas linhagens quando crescidas nessa glicerina bruta pode ser considerado satisfatório. Para seleção das linhagens, os 46 fungos foram agrupados em três grupos de acordo com o valor de IVCM baixo, médio e alto, obtidos em glicerina bruta, e linhagens de cada grupo, totalizando 13 linhagens, foram selecionadas para bioconversão nessa glicerina. Figura 1. Índice de velocidade de crescimento micelial das 46 linhagens de fungos filamentosos, obtidos em glicerina bruta de soja e padrão comercial. As amostras geradas por bioconversão de glicerina de soja das 13 linhagens, após 5 e 10 dias de cultivo, foram analisadas, primeiramente, por DIMS (Figura 2). De acordo com a análise de componente principal realizada sobre os dados espectrais das amostras de glicerol bioconvertidas pelos fungos filamentosos, pôde-se perceber no gráfico de scores (Figura 2), a presença de dois grupos distintos: no quadrante esquerdo, localizam-se as amostras geradas após 5 dias de cultivo (T1), e no quadrante direito, as amostras geradas após 10 dias (T2). O gráfico de scores representa todas as amostras analisadas. As suas posições no gráfico dependem dos íons detectados nas amostras e que estão

6 92 III Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais representados no gráfico de loadings. Então, existe uma correlação espacial entre o gráfico de scores e o gráfico de loadings. Ao se comparar os dois gráficos, pôdese constatar que as amostras do tipo T2 possuem íons mais intensos que o das amostras T1. Figura 2. Gráfico de scores e loadings das amostras de glicerol bioconvertidas por fungos filamentosos, em glicerina bruta de soja. T1 5 dias e T2 10 dias de cultivo.

7 Processos Bioquímicos 93 Após processamento dos dados, foi possível inferir que as linhagens GPBF 21/15, GPBF 19/15 e GBBF 5/15 produziram polióis do tipo C4 (m/z 145,0471), C5 (m/z 175,0577) e C6 (m/z 205,0683), os quais foram detectados com intensidade perto de 1x10 5. As linhagens GPBF 9/15 e GBPF 7/15 produziram polióis do tipo C4 (m/z 145,0467 e m/z 145,0468 respectivamente), porém seu íon correspondente foi detectado com intensidade menor, 2x10 4, do que as linhagens anteriormente citadas. Nas réplicas de GPBF 21/15 e GPBF 19/15, foi detectado o íon m/z 215,0692, correspondente a compostos como carpacina, miristicina, metoxicinamato e isoquinolona, e o íon m/z 215,0162, correspondente ao ácido cítrico. Diante disso, ainda não foi possível confirmar qual produto essas linhagens realmente haviam produzido, além dos polióis. Com base nos resultados que indicaram a produção de polióis pelas linhagens GPBF 21/15, GPBF 19/15, GBBF 5/15, GPBF 9/15 e GBPF 7/15, as amostras obtidas após 5 e 10 dias de cultivo foram analisadas por UPLC para identificar e quantificar esses compostos. Porém, não foi possível determinar a identificação e concentração dos polióis do tipo C4, C5 e C6 que as linhagens teriam produzido conforme resultados indicativos por DIMS, por estarem abaixo do limite de quantificação do método empregado. No entanto, verificou-se que o poliol glicerol, fonte de carbono da bioconversão, foi consumido entre 35% e 57%, dependendo da linhagem avaliada. Sendo assim, acredita-se que o consumo de glicerol tenha ocorrido, principalmente, para crescimento dos fungos. Conclusões Linhagens de fungos filamentosos isolados a partir de solos contendo glicerina bruta de soja e padrão comercial, da Fazenda Sucupira, Brasília, DF, foram avaliadas de acordo com a capacidade de crescer em glicerina bruta de soja ou comercial, como única fonte de carbono. Ao todo, 13 linhagens foram selecionadas de acordo com valores de IVCM alto, médio e baixo e testadas em processo de bioconversão de glicerina bruta de soja. Os resultados obtidos por espectrometria de massas (DIMS) indicaram que cinco linhagens foram capazes de produzir polióis C4, C5 e C6, porém, esse resultado não foi confirmado por UPLC-ELSD, embora a fonte de carbono glicerol tenha sido parcialmente consumida.

8 94 III Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais Apoio financeiro Os autores agradecem ao CNPq, pelo apoio financeiro e concessão de bolsas (404854/2013-3) para as autoras Rebeca Vianna, Karen de Lima e Flávia Soares; à Capes, pela bolsa de Augusto Souto, e à Embrapa Agroenergia, pela infraestrutura de pesquisa. Referências ALMEIDA, J. R. M.; FÁVARO, L. C. L.; QUIRINO, B. F. Biodiesel biorefinery: opportunities and challenges for microbial production of fuels and chemicals from glycerol waste. Biotechnology for Fuels, London, v. 5, número do artigo 48, AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E BIOCOMBUSTÍVEIS (Brasil). Anuário estatístico brasileiro do petróleo, gás natural e biocombustíveis Brasília, DF, Disponível em: < Acesso em: ago YANG, F.; HANNA, M. A.; SUN, R. Value-added uses for crude glycerol-a byproduct of biodiesel production. Biotechnology for Biofuels, London, v. 5, artigo número 13, 2012.